董騰慧，郭明洲

解放軍總醫(yī)院消化內(nèi)科，北京100853

RAS 蛋 白(the RAS-association domain family，RASSF)包含10 個(gè)家族成員，均含有一個(gè)RA 結(jié)構(gòu)域(RAS-association domain)，根據(jù)RA 結(jié)構(gòu)域的位置將RASSF 分為兩大類，位于羧基端的稱為經(jīng)典RASSF 家族(classical RASSF)，位于氨基端的稱為氨基端RASSF 家族(N-terminal RASSF)［1］。經(jīng)典RASSF 家族包括RASSF1A、RASSF1C、RASSF2、RASSF3、RASSF4、RASSF5A、RASSF5C 和RASSF6［2］，除RA 結(jié)構(gòu)域外，其羧基端還有一個(gè)SARAH 結(jié)構(gòu)域，可與其他蛋白相互 作 用［3］。氨 基 端 RASSF 家 族 包 含 RASSF7、RASSF8、RASSF9、RASSF10 4 種蛋白，除RA 結(jié)構(gòu)域的位置與經(jīng)典RASSF 家族不同外，還缺乏SARAH 結(jié)構(gòu)域，根據(jù)SMART 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)結(jié)果提示RASSF7、RASSF8和RASSF10 有一個(gè)卷曲螺旋(coiled-coil)結(jié)構(gòu)域，此結(jié)構(gòu)域可由疏水基介導(dǎo)形成二聚體，結(jié)構(gòu)學(xué)研究證實(shí)卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域與SARAH 結(jié)構(gòu)域沒(méi)有相似性［1，4］。經(jīng)典RASSF 家族與氨基端RASSF 家族在結(jié)構(gòu)上的差異提示是兩個(gè)完全不同的亞家族［1］。盡管在NRASSF 家族中RASSF7 ～10 的結(jié)構(gòu)類似但其表觀遺傳調(diào)控及生物學(xué)功能卻各有不同(見(jiàn)表1)。

RASSF7 及RASSF8 雖然在啟動(dòng)子區(qū)分別含有一個(gè)范圍約1 015 bp 和1 201 bp 的CpG 島，但很少在腫瘤中發(fā)生甲基化［1，7，10］。RASSF9 的啟動(dòng)子區(qū)無(wú)CpG島，RASSF10 啟動(dòng)子區(qū)有一個(gè)2 254 bp 的富含CpG 的區(qū)域，在多種腫瘤中頻繁發(fā)生甲基化且其表達(dá)受到啟動(dòng)子區(qū)甲基化調(diào)控［1］。RASSF7 結(jié)合在中心體上通過(guò)影響微管的功能，促進(jìn)有絲分裂進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)［7］。RASSF8 作為抑癌基因，通過(guò)抑制Wnt 和NFκB 信號(hào)通路抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移［9］。RASSF9誘導(dǎo)上皮細(xì)胞的分化并抑制其生長(zhǎng)［11，13］。本文討論RASSF10 基因在腫瘤中的表達(dá)、調(diào)控及腫瘤發(fā)生中的作用及機(jī)制。

表1 N-RASSF 成員的基本特征Tab 1 The characteristic of N-RASSF members

1 RASSF10 的分離和鑒定

RASSF10 位于人染色體11p15.2 上，是通過(guò)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)獲得的與RASSF9 同源的基因，與其他氨基端RASSF 家族成員一樣，其氨基端在人、非洲爪蟾和果蠅中具有一個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域，能夠抑制細(xì)胞有絲分裂［4］。RASSF10 在人甲狀腺、胰腺、胎盤、心臟、肺臟、腎臟、腦及骨骼肌等組織中均有表達(dá)［17］。RASSF10 基因含有一個(gè)外顯子，一個(gè)能編碼507 個(gè)氨基酸的開(kāi)放閱讀框［10］，RASSF10 的啟動(dòng)子區(qū)有一個(gè)范圍約2 254 bp的富含CpG 二核苷酸的區(qū)域［1］。

2 RASSF10 與人類腫瘤

2.1 RASSF10 在不同腫瘤中頻繁發(fā)生甲基化 目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)RASSF10 基因在多種腫瘤組織中存在啟動(dòng)子區(qū)甲基化(見(jiàn)表2)，且其表達(dá)受啟動(dòng)子區(qū)甲基化調(diào)控。

在兒童白血病細(xì)胞及正常人骨髓細(xì)胞中利用結(jié)合亞硫酸氫鈉處理和酶解分析(COBRA)法及硫化測(cè)序方法(Bisulfite sequencing，BSSQ)檢測(cè)RASSF10 啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)RASSF10 在兒童T 細(xì)胞白血病中甲基化率為88.5%(23/26)，在兒童B 細(xì)胞白血病中甲基化率為15.7%(8/51)，而在正常骨髓細(xì)胞中無(wú)甲基化，此外RASSF10 在7 個(gè)白血病細(xì)胞株(THP-1、U937、JKT、DND-41、SUP-T1、NALM1 及NALM6)中均呈甲基化狀態(tài)，其中白血病細(xì)胞系THP-1 及SUP-T1細(xì)胞在接受去甲基化藥物(5-Aza)及去乙酰化藥物(TSA)共同處理后RASSF10 的表達(dá)明顯上調(diào)［10］。

表2 RASSF10 在不同腫瘤中的甲基化情況Tab 2 The RASSF10 methylation status in different cancers

利用甲基化特異性 PCR (MSP)方法檢測(cè)RASSF10 在結(jié)腸癌組織中的甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)RASSF10 在結(jié)腸癌中的甲基化率為60.7%(54/89)，提示RASSF10 在結(jié)腸癌組織中頻繁發(fā)生甲基化［18］;另發(fā)現(xiàn)，在RASSF10 完全甲基化的結(jié)腸癌細(xì)胞系LOVO、RKO 及HCT116 中RASSF10 的表達(dá)缺失，加入5-Aza 處理后恢復(fù)表達(dá)，在RASSF10 部分甲基化的結(jié)腸癌細(xì)胞系LS180、DLD1、HT29、SW480 及SW620 中RASF10 有微弱表達(dá)，經(jīng)5-Aza 處理后表達(dá)上調(diào)，提示RASSF10 在結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)受啟動(dòng)子區(qū)高甲基化調(diào)控［18］。

RASSF10 在原發(fā)性甲狀腺癌中甲基化率為65.6%(21/32)，在濾泡狀腺瘤中甲基化率為10.0%(1/10)，在甲狀腺腫大患者中甲基化率為33.3%(4/12)，而在13 例正常甲狀腺組織中均未發(fā)現(xiàn)甲基化，RASSF10 在原發(fā)性甲狀腺癌中的甲基化率明顯高于其在濾泡狀腺瘤及正常甲狀腺中的甲基化率(P 均＜0.05)［17］。RASSF10 甲基化存在于神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞及上皮細(xì)胞起源的原發(fā)性甲狀腺癌，且甲基化率有所不同。

RASSF10 甲基化可用于原發(fā)性黑色素瘤的診斷及鑒別診斷中，如RASSF10 在原發(fā)性黑色素瘤及轉(zhuǎn)移性黑色素瘤中的甲基化率分別為68%和91%，在增生性色素痣中的甲基化率為11%，而在無(wú)增生性色素痣中無(wú)啟動(dòng)子區(qū)甲基化，提示RASSF10 的甲基化狀態(tài)可以作為區(qū)分黑色素瘤與色素痣的一個(gè)新的腫瘤標(biāo)志物［20］。

RASSF10 在原發(fā)性胃癌中的甲基化率明顯高于癌旁組織(61.6% vs 38.4%，P ＜0.01)，且在胃癌中RASSF10 的甲基化狀態(tài)與胃癌的浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Borrmann 分型相關(guān)，RASSF10 的甲基化率隨著浸潤(rùn)深度的增加而增加，T3 及T4 組RASSF10 甲基化率明顯高于T1 和T2 組(67.1% vs 37.5%，P ＜0.05)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組RASSF10 甲基化率明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(68.8% vs 40.9%，P ＜0.05)，Borrmann Ⅳ組RASSF10 甲基化率明顯高于早期胃癌組(85. 7% vs 57.0%，P ＜0.05)［22］。另有報(bào)道顯示RASSF10 在胃癌中的甲基化率與胃癌預(yù)后密切相關(guān)，對(duì)300 個(gè)胃癌患者進(jìn)行多因素生存分析顯示RASSF10 甲基化是胃癌患者總生存期的一個(gè)獨(dú)立預(yù)測(cè)因素(危險(xiǎn)比為1.687，P ＜0.001)［26］。

2.2 RASSF10 在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用 在肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549 中利用免疫熒光技術(shù)發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性RASSF10 蛋白可在有絲分裂間期定位于胞質(zhì)，當(dāng)有絲分裂期開(kāi)始時(shí)RASSF10 蛋白入核，與α-微管蛋白共定位于正在生成的紡錘體兩極及微管上，這種共定位從分裂前期一直持續(xù)到分裂末期。提示RASSF10 在細(xì)胞有絲分裂過(guò)程中可能具有一定的調(diào)控作用［19］。這一功能在原發(fā)性食管鱗癌細(xì)胞系及結(jié)腸癌細(xì)胞系中得到驗(yàn)證，在食管鱗癌細(xì)胞系KYSE150 中恢復(fù)RASSF10表達(dá)，G2/M 期細(xì)胞明顯增加，RASSF10 使原發(fā)性食管鱗癌細(xì)胞系阻滯在G2/M 期［25］;在結(jié)腸癌細(xì)胞系RKO及HCT116 細(xì)胞中恢復(fù)RASSF10 表達(dá)，G2/M 期細(xì)胞也明顯增加，證明RASSF10 可使細(xì)胞周期阻滯在G2/M期［18］。

此外，在多種腫瘤中證實(shí)RASSF10 可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，如在結(jié)腸癌細(xì)胞系RKO 及HCT116 中恢復(fù)RASSF10 表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞凋亡［18］;在食管癌細(xì)胞系KYSE150 中恢復(fù)表達(dá)RASSF10，明顯促進(jìn)細(xì)胞的凋亡［25］;在前列腺癌細(xì)胞LNCaP 細(xì)胞中恢復(fù)RASSF10表達(dá)，細(xì)胞凋亡比例增加2 倍［27］;在肺癌細(xì)胞系SPCA-1 細(xì)胞中siRNA 敲降RASSF10 可抑制細(xì)胞凋亡［28］。在胃癌細(xì)胞系JRST 及BGC823 細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)RASSF10 可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［16］。

RASSF10 在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡中的作用提示RASSF10 可能在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮抑癌作用。目前發(fā)現(xiàn)RASSF10 可抑制膠質(zhì)細(xì)胞瘤、原發(fā)性食管鱗癌、結(jié)腸癌、肺癌等腫瘤細(xì)胞系的生長(zhǎng)。在U87 膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系中RASSF10 表達(dá)沉默可促進(jìn)細(xì)胞增殖，反之，在H4 及U343 膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系中利用克隆形成實(shí)驗(yàn)及軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)恢復(fù)RASSF10 表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖及細(xì)胞的錨定非依賴性生長(zhǎng)［19］。RASSF10 抑制胃癌細(xì)胞的克隆形成及胃癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤作用，表明RASSF10 抑制胃癌的生成［16］。

RASSF10 對(duì)化療藥物治療敏感性也有一定的影響，多西他賽化療藥是一種有絲分裂抑制劑，在有絲分裂期特異性靶向作用于微管［29］，而RASSF10 在有絲分裂期可共定位于紡錘體兩極及微管中，且使細(xì)胞阻滯在G2/M 期，藥物敏感性實(shí)驗(yàn)證明RASSF10 可提高結(jié)腸癌細(xì)胞系RKO 及HCT116 細(xì)胞對(duì)多西他賽的敏感性，提示RASSF10 甲基化可成為結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)多西他賽耐藥的標(biāo)志物［18］。

2.3 RASSF10 在腫瘤中的作用機(jī)制 腫瘤相關(guān)基因可通過(guò)參與多種信號(hào)通路對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展發(fā)揮作用，RASSF10 通過(guò)參與Hedgehog、Wnt/β-catenin、P53等信號(hào)通路而影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。

在黑腹果蠅細(xì)胞中采用全基因組RNA 干擾篩選技術(shù)發(fā)現(xiàn)RASSF10 表達(dá)可正調(diào)控Hedgehog 信號(hào)通路［30］。在胃癌細(xì)胞中RASSF10 可促進(jìn)β-catenin 核定位，下調(diào)c-Myc、cyclin D1、cyclin E1、TCF-1、TCF-4 及CD44 的表達(dá)，抑制Wnt/β-catenin 信號(hào)通路［16］。

利用結(jié)腸癌細(xì)胞系RKO 穩(wěn)定表達(dá)RASSF10 前后的mRNA 進(jìn)行基因表達(dá)譜芯片分析，發(fā)現(xiàn)在RASSF10穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系中MDM2 表達(dá)下調(diào)，而MDM2 是P53 信號(hào)通路中的關(guān)鍵成分，可催化P53 泛素化使其降解，提示RASSF10 可通過(guò)下調(diào)MDM2 激活P53 信號(hào)通路。進(jìn)一步通過(guò)紫外照射誘導(dǎo)DNA 損傷模型，檢測(cè)各細(xì)胞株中P53、bax、活化型Caspase-3、MDM2 及bcl-2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)只有穩(wěn)定表達(dá)RASSF10 的細(xì)胞株P(guān)53、bax、活化型Caspase-3 的表達(dá)上調(diào)，MDM2 及bcl-2 的表達(dá)下調(diào)，表明RASSF10 在結(jié)腸癌中通過(guò)穩(wěn)定P53 而活化P53 通路，抑制腫瘤的生長(zhǎng)［18］。

綜上所述，RASSF10 在多種腫瘤中頻繁發(fā)生甲基化，且其表達(dá)受到啟動(dòng)子區(qū)甲基化調(diào)控，RASSF10 甲基化可能成為腫瘤診斷、預(yù)后及化療敏感性的標(biāo)志物。RASSF10 通過(guò)Wnt、P53、Hedgehog 等信號(hào)通路影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。

［1］ Underhill-Day N，Hill V，Latif F. N-terminal RASSF family:RASSF7-RASSF10［J］. Epigenetics，2011，6(3):284-292.

［2］ Richter AM，Pfeifer GP，Dammann RH. The RASSF proteins in cancer;from epigenetic silencing to functional characterization［J］. Biochim Biophys Acta，2009，1796(2):114-128.

［3］ Sherwood V，Recino A，Jeffries A，et al. The N-terminal RASSF family:a new group of Ras-association-domain-containing proteins，with emerging links to cancer formation［J］. Biochem J，2009，425(2):303-311.

［4］ Sherwood V，Manbodh R，Sheppard C，et al. RASSF7 is a member of a new family of RAS association domain-containing proteins and is required for completing mitosis ［J］. Mol Biol Cell，2008，19(4):1772-1782.

［5］ Weitzel JN，Kasperczyk A，Mohan C，et al. The HRAS1 gene cluster:two upstream regions recognizing transcripts and a third encoding a gene with a leucine zipper domain ［J］. Genomics，1992，14 (2):309-319.

［6］ Djos A，Martinsson T，Kogner P，et al. The RASSF gene family members RASSF5，RASSF6 and RASSF7 show frequent DNA methylation in neuroblastoma［J］. Mol Cancer，2012，11:40.

［7］ Recino A，Sherwood V，F(xiàn)laxman A，et al. Human RASSF7 regulates the microtubule cytoskeleton and is required for spindle formation，Aurora B activation and chromosomal congression during mitosis［J］. Biochem J，2010，430(2):207-213.

［8］ Falvella FS，Manenti G，Spinola M，et al. Identification of RASSF8 as a candidate lung tumor suppressor gene ［J］. Oncogene，2006，25(28):3934-3938.

［9］ Lock FE，Underhill-Day N，Dunwell T，et al. The RASSF8 candidate tumor suppressor inhibits cell growth and regulates the Wnt and NFkappaB signaling pathways ［J］. Oncogene，2010，29 (30):4307-4316.

［10］ Hesson LB，Dunwell TL，Cooper WN，et al. The novel RASSF6 and RASSF10 candidate tumour suppressor genes are frequently epigenetically inactivated in childhood leukaemias［J］. Mol Cancer，2009，8:42.

［11］ Chen L，Johnson RC，Milgram SL. P-CIP1，a novel protein that interacts with the cytosolic domain of peptidylglycine alpha-amidating monooxygenase，is associated with endosomes ［J］. J Biol Chem，1998，273(50):33524-33532.

［12］ Richter AM，Zimmermann T，Haag T，et al. Promoter methylation status of Ras-association domain family members in pheochromocytoma ［J］.Front Endocrinol (Lausanne)，2015，6:21.

［13］ Lee CM，Yang P，Chen LC，et al. A novel role of RASSF9 in maintaining epidermal homeostasis［J］. PLoS One，2011，6(3):e17867.

［14］ Underhill-Day N，Hill V，Latif F. N-terminal RASSF family［J］.Epigenetics，2014，6(3):284-292.

［15］ Guo J，Yang Y，Yang Y，et al. RASSF10 suppresses colorectal cancer growth by activating P53 signaling and sensitizes colorectal cancer cell to docetaxel［J］. Oncotarget，2015，6(6):4202-4213.

［16］ Wei Z，Chen X，Chen J，et al. RASSF10 is epigenetically silenced and functions as a tumor suppressor in gastric cancer［J］. Biochem Biophys Res Commun，2013，432(4):632-637.

［17］ Schagdarsurengin U，Richter AM，Wohler C，et al. Frequent epigenetic inactivation of RASSF10 in thyroid cancer［J］. Epigenetics，2009，4(8):571-576.

［18］ Guo J，Yang Y，Yang Y，et al. RASSF10 suppresses colorectal cancer growth by activating P53 signaling and sensitizes colorectal cancer cell to docetaxel［J］. Oncotarget，2015，6(6):4202-4213.

［19］ Hill VK，Underhill-Day N，Krex D，et al. Epigenetic inactivation of the RASSF10 candidate tumor suppressor gene is a frequent and an early event in gliomagenesis ［J］. Oncogene，2011，30 (8):978-989.

［20］ Helmbold P，Richter AM，Walesch S，et al. RASSF10 promoter hypermethylation is frequent in malignant melanoma of the skin but uncommon in nevus cell nevi［J］. J Invest Dermatol，2012，132(3 Pt 1):687-694.

［21］ Richter AM，Walesch SK，Wurl P，et al. The tumor suppressor RASSF10 is upregulated upon contact inhibition and frequently epigenetically silenced in cancer［J］. Oncogenesis，2012，1:e18.

［22］ F a。hraeus R，Olivares-Illana V. MDM2’s social network［J］. Oncogene，2014，33(35):4365-4376.

［23］ Richter AM，Haag T，Walesch S，et al. Aberrant promoter hypermethylation of RASSF family members in merkel cell carcinoma［J］.Cancers (Basel)，2013，5(4):1566-1576.

［24］ Shinawi T，Hill V，Dagklis A，et al. KIBRA gene methylation is associated with unfavorable biological prognostic parameters in chronic lymphocytic leukemia［J］. Epigenetics，2012，7(3):211-215.

［25］ Lu D，Ma J，Zhan Q，et al. Epigenetic silencing of RASSF10 promotes tumor growth in esophageal squamous cell carcinoma［J］. Discov Med，2014，17(94):169-178.

［26］ Deng J，Liang H，Ying G，et al. Methylation of ras association domain protein 10 (RASSF10)promoter negative association with the survival of gastric cancer［J］. Am J Cancer Res，2014，4(6):916-923.

［27］ Dansranjavin T，Wagenlehner F，Gattenloehner S，et al. Epigenetic down regulation of RASSF10 and its possible clinical implication in prostate carcinoma［J］. Prostate，2012，72(14):1550-1558.

［28］ Wang Y，Ma T，Bi J，et al. RASSF10 is epigenetically inactivated and induces apoptosis in lung cancer cell lines［J］. Biomed Pharmacother，2014，68(3):321-326.

［29］ Murray S，Briasoulis E，Linardou H，et al. Taxane resistance in breast cancer:mechanisms，predictive biomarkers and circumvention strategies［J］. Cancer Treat Rev，2012，38(7):890-903.

［30］ Nybakken K，Vokes SA，Lin TY，et al. A genome-wide RNA interference screen in Drosophila melanogaster cells for new components of the Hh signaling pathway ［J］. Nat Genet，2005，37 (12):1323-1332.