周永柏，張亞歷，王繼德，楊 兵

1.深圳市龍崗中心醫(yī)院消化科，廣東 深圳518116;2.南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院消化系病研究所

消化道腫瘤是我國(guó)最常見的惡性腫瘤，嚴(yán)重危害人民的生命健康。癌基因及抑癌基因在癌癥發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，X 染色體相關(guān)凋亡抑制蛋白相關(guān)因子1(X-linked inhibitor of apoptosis-associated factor 1，XAF1)是XIAP 相關(guān)因子，能與XIAP 直接結(jié)合拮抗其抑制caspase 活性而起抗凋亡作用［1-2］，XAF1 在腫瘤凋亡、抑制腫瘤血管生成、促進(jìn)細(xì)胞分化等方面有及其重要作用，已被認(rèn)定為抑癌基因［3-5］。目前發(fā)現(xiàn)XAF1的mRNA 有多種轉(zhuǎn)錄變異體［6］:其中XAF1A、XAF1B、XAF1C、XAF1D、XAF1E 分別編碼不同的蛋白(見圖1)，由于不同轉(zhuǎn)錄變異體所包含的結(jié)構(gòu)不同，可能在腫瘤中起相反的作用［7］，目前XAF1B、XAF1C 在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)及其相應(yīng)的蛋白的作用尚不清楚。有報(bào)道提示干擾素可誘導(dǎo)XAF1A 的表達(dá)［8］，但對(duì)其他轉(zhuǎn)錄變異體等影響尚不清楚，我們應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)檢測(cè)18 種腫瘤細(xì)胞及正常轉(zhuǎn)化細(xì)胞中XAF1 3 種轉(zhuǎn)錄變異體的表達(dá)情況，并用干擾素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞，觀察3 種轉(zhuǎn)錄變異體的變化;初步探討XAF1 不同轉(zhuǎn)錄變異體在腫瘤中的可能作用。

1 材料與方法

1. 1 材料 ECA109、ESO、AGS、BCG823、MKN45、KATOⅢ、MGC803、GES-1、LOVO、COLO205、HCT116、HCT-8、SW1116、SW620、SW480、DLD1、HEK293、ECV304 細(xì) 胞 為 本 實(shí) 驗(yàn) 室 保 存，ECA109、AGS、BCG823、MKN45、KATOⅢ、MGC803、LOVO、COLO205、HCT-8、SW1116、SW620、SW480、HEK293、ECV304 用含10%的新生牛血清(GIBICO)的RPMI-1640(GIBICO)培養(yǎng)基培養(yǎng)，HCT116、DLD1、ESO、GES-1 用含15%的胎牛血清(GIBICO)的DMEM/F12(GIBICO)培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基中加入100 U/ml 的青鏈霉素(杭州吉諾)，在37 ℃5% CO2的培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，胰蛋白酶購自GIBICO。人重組IFN-α 購自安徽安科生物公司，TRlzol 試劑盒和Taq 酶premix 購自Takara 公司，第一鏈cDNA 合成試劑盒購自Fermatas 公司，引物由Invitrogin 公司合成引物序列(見表1)。

表1 XAF1 不同轉(zhuǎn)錄變異體引物序列及相應(yīng)的位置、產(chǎn)物長(zhǎng)度Tab 1 Different transcript variants of XAF1，primer sequences，the corresponding location and product length

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，胰酶消化，PBS洗滌離心2 次后加TRI REAGENT 1 ml，按操作說明進(jìn)行總RNA 提取;電泳鑒定RNA 的完整性，紫外分光光讀計(jì)測(cè)定RNA 的濃度，取3 μg 總RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(總20 μl 體系);取2 μl 逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR 反應(yīng)，反應(yīng)體系為25 μl，PCR 反應(yīng)條件為:94 ℃5 min，94 ℃30 s，60 ℃45 s，72 ℃1 min，35 循環(huán)(內(nèi)參β-actin 為25 循環(huán))。72 ℃延伸8 min，引物序列見表1，2%的膠凝膠電泳成像。同時(shí)取2 例正常人外周血3 ml，提取外周血淋巴細(xì)胞RNA 及20 例正常人胃黏膜組織提取RNA 進(jìn)行RT-PCR 作為對(duì)照。

1.2.2 Western blotting:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞5×106，4 ℃預(yù)冷PBS 洗滌2 次，加RIPA 強(qiáng)效裂解液500 μl 及1%的PMSF 裂解細(xì)胞(組織100 mg 加1 ml RIPA 強(qiáng)效裂解液及1%的PMSF 冰上勻漿)，冰上放置30 min，4 ℃12 000 r/min 離心15 min，取上清，BCA 法測(cè)定蛋白濃度。50 μg/孔總蛋白上樣進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)至PVDF 膜上。5% 脫脂奶粉室溫封閉膜2 h，羊抗人XAF1 一抗(1∶300)4 ℃過夜浮育，TBS-T 洗膜3×10 min，兔抗羊二抗(1∶4 000)室溫浮育2 h，TBS-T 洗膜3 ×10 min，ECL 發(fā)光顯影。

1.2.3 藥物干預(yù):取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MGC803 細(xì)胞，胰酶消化，PBS 洗滌離心后計(jì)數(shù)，以每孔104個(gè)細(xì)胞的密度種入6 孔板，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好，60% ～70%瓶底時(shí)分別加入人重組IFN-α(1 000 u/ml)，24 h 后用4 ℃預(yù)冷的pbs 洗滌細(xì)胞3 次，加TRI REAGENT 提取總RNA，RT-PCR 檢測(cè)3 個(gè)不同轉(zhuǎn)錄變異體的變化。每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，RT-PCR 結(jié)果采用χ2檢驗(yàn)，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

RT-PCR 結(jié)果顯示在人胃腸道腫瘤腫瘤細(xì)胞株(ECA109、AGS、BCG823、MKN45、KATO Ⅲ、MGC803、LOVO、COLO205、HCT116、HCT-8、SW1116、SW620、SW480、DLD1)和 人 正 常 轉(zhuǎn) 化 細(xì) 胞(ESO、GES-1、HEK293、ECV304)中，XAF1 3 個(gè)剪切變異體陽性率分別為66.7%(12/18)、61.1%(11/18)、27.8%(5/18)，在2例正常成年男子的外周淋巴細(xì)胞中(N1、N2)及正常胃黏膜組織中XAF1A、XAF1B 均100% 表達(dá)，而XAF1C 均不表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，并且在腫瘤細(xì)胞中多為低表達(dá)，在2 株半懸浮細(xì)胞株(COLO205 和KATOⅢ)中，XAF1 3 個(gè)剪切變異體均高表達(dá)(見圖2 ～3)。Western blotting 結(jié)果顯示，XAF1A 蛋白為分子量為34 kD，其在腫瘤細(xì)胞中的水平與mRNA 表達(dá)水平相一致，在COLO205 中高表達(dá)(見圖4)。干擾素α 誘導(dǎo)MGC803 細(xì)胞24 h 后，XAF1A、XAF1B 和XAF1C3 轉(zhuǎn)錄變異體的表達(dá)均上調(diào)(見圖5)。

3 討論

圖1 XAF1 基因及已鑒定的5 種轉(zhuǎn)錄變異體的結(jié)構(gòu)示意圖Fig 1 Structure of XAF1 gene and its five identified splice variants

圖2 XAF1 3 個(gè)不同剪切變異體在人大腸腫瘤細(xì)胞株和正常人外周血淋巴細(xì)胞中的表達(dá)Fig 2 Expressions of the 3 splice variants of XAF1 in colorectal cancer cell lines and peripheral blood lympholeukocyte from health adults

圖3 XAF1 3 個(gè)不同剪切變異體在人食管、胃腫瘤細(xì)胞株和人正常轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的表達(dá)Fig 3 Expression of the 3 splice variants of XAF1 in esophageal，gastric cancer cell lines and normal transformants

細(xì)胞凋亡抑制可以促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展、免疫逃逸及對(duì)化療、放療的抵抗。近年來，越來越多的凋亡調(diào)控基因被發(fā)現(xiàn)和闡明，XAF1 由Liston 等［1］首先從酵母雙雜交系統(tǒng)中鑒定到的X 染色體相關(guān)凋亡抑制蛋白(Xlinked inhibitors of apoptosis protein，XIAP)相關(guān)因子。原位熒光雜交分析XAF1 基因位于17p13.2 位點(diǎn)，位于腫瘤抑制基因P53(位于17p13.1 位點(diǎn))遠(yuǎn)端3 cm處［2］。XAF1 基因包括8 個(gè)外顯子，長(zhǎng)20. 23 kb。XAF1 mRNA 經(jīng)軟件預(yù)測(cè)有24 種轉(zhuǎn)錄變異體(NCBI網(wǎng)站)，其中19 種mRNA 編碼完整的蛋白，部分蛋白包含鋅指結(jié)構(gòu)和腫瘤壞死因子-α 受體相關(guān)因子6 類型(TRAF-type)結(jié)構(gòu)域。目前在人類細(xì)胞或組織中檢測(cè)出 的 轉(zhuǎn) 錄 變 異 體 有5 種［6，9］:XAF1A、XAF1B、XAF1C、XAF1D 和 XAF1E，分 別 有906nt、849nt、495nt、426nt 和369nt 的開放閱讀框架。XAF1A 及通常說的XAF1，具有7 個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)(見圖1)，其N-端的5 個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)與FLN 29 及TRAF6 的鋅指結(jié)構(gòu)分別有41%和22%的同源性［2］。XAF1A 蛋白C 端的6 個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)在促凋亡中起作用，N 端的一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)(ZFTRAF)在蛋白的相互作用中起作用［2］。XAF1B 與XAF1A 相比缺失外顯子3(57nt)，編碼的蛋白比XAF1A 少19AA;XAF1C 比XAF1A 在4 和5 外顯子之間多一個(gè)4 b 外顯子(152nt)，但由于開放閱讀框架內(nèi)含中止子，而只能編碼含164 個(gè)氨基酸的蛋白，其C-端含有不同于XAF1A 的24 個(gè)氨基酸，N-端的鋅指樣結(jié)構(gòu)和XAF1 蛋白N-端的鋅指樣結(jié)構(gòu)(ZF-TRAF)相同。XAF1D 和XAF1E 分別編碼141 和122 個(gè)氨基酸的蛋白，具體結(jié)構(gòu)(見圖1)。實(shí)驗(yàn)表明［8］外源性的ZF-TRAF 單獨(dú)表達(dá)能劑量依賴降低內(nèi)源性XAF1 的促凋亡作用，而外源性缺失ZF-TRAF 部分的XAF1 對(duì)干擾素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡無影響，F(xiàn)ang 等［7］的研究顯示，在前列腺癌中用去甲基化試劑5-aza-DC 處理后XAF1B轉(zhuǎn)變成全長(zhǎng)的XAF1A。這說明不同的轉(zhuǎn)錄變異體編碼的蛋白，由于所含結(jié)構(gòu)域不同，在細(xì)胞中可能起著不同或相反的作用。Chung 等［9］研究顯示，利用體外構(gòu)建XAF1 表達(dá)載體轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116，XAF1 的5 種轉(zhuǎn)錄變異體均編碼蛋白，并在細(xì)胞的凋亡中均起著促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。具體XAF1 不同表達(dá)轉(zhuǎn)錄變異體在腫瘤中所起的作用有待進(jìn)一步研究。

圖4 XAF1 A 蛋白在人大腸腫瘤細(xì)胞株的表達(dá)Fig 4 Expression of XAF1A protein in colorectal cancer cell lines

圖5 MGC803 細(xì)胞中干擾素α 誘導(dǎo)XAF1 表達(dá)Fig 5 Expression of XAF1 in MGC803 cell line induced by IFN-α

本研究中，我們?cè)O(shè)計(jì)3 對(duì)分別針對(duì)轉(zhuǎn)錄變異體1、2 和3 的特異性引物，來檢測(cè)他們?cè)谖改c道腫瘤中的表達(dá)情況。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，XAF1 不同轉(zhuǎn)錄變異體在消化道腫瘤細(xì)胞株及正常轉(zhuǎn)化的永生化細(xì)胞中與正常人外周血白細(xì)胞中存在差異表達(dá)，消化道腫瘤細(xì)胞及正常轉(zhuǎn)化細(xì)胞中XAF1 轉(zhuǎn)錄變異體1 和2 多不表達(dá)或低表達(dá)，同時(shí)我們作了免疫印跡分析，提示XAF1 mRNA 高表達(dá)的細(xì)胞株其蛋白也高表達(dá)，與以往對(duì)XAF1A 的研究結(jié)果相似。XAF1 轉(zhuǎn)錄變異體3 在正常人外周血白細(xì)胞及正常胃黏膜組織中未檢出，但在高表達(dá)XAF1A 的3 株消化道腫瘤細(xì)胞及1 株正常轉(zhuǎn)化細(xì)胞中檢出，在正常胃黏膜及外周血淋巴細(xì)胞中不表達(dá)XAF1C，而在部分永生細(xì)胞中高表達(dá)XAF1A、XAF1B，同時(shí)高表達(dá)XAF1C，提示XAF1C 與XAF1A、XAF1B 在細(xì)胞凋亡上可能起相互拮抗作用。

在研究的細(xì)胞系中，SW480 及SW620 來源于同一個(gè)51 歲白種男性直腸腺癌患者的直腸原發(fā)灶及1 年后的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶，XAF1A、XAF1B 在原發(fā)灶腫瘤細(xì)胞株中表達(dá)，而在轉(zhuǎn)移灶中不表達(dá)，提示XAF1A、XAF1B 與腫瘤的轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)。在本研究中，其中在細(xì)胞株COLO205(來源于結(jié)腸癌腹水轉(zhuǎn)移灶)及KATOⅢ(來源于胃癌胸水轉(zhuǎn)移灶)中均高表達(dá)XAF1 轉(zhuǎn)錄變異體3，提示XAF1C 的高表達(dá)可能與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移有關(guān)。

干擾素有增強(qiáng)免疫力、抑制腫瘤血管生成、促進(jìn)凋亡等作用被廣泛應(yīng)用于腫瘤治療［10］，近來的一項(xiàng)研究顯示XAF1 啟動(dòng)子ATG 上游的-55 ～-66 bp 含ISRE結(jié)合元件(ISRE-XAF1)參與了干擾素誘導(dǎo)的XAF1的表達(dá)［11］。本研究提示和XAF1A 一樣，XAF1B、XAF1C 也可被干擾素誘導(dǎo)，提示干擾素誘導(dǎo)XAF1 表達(dá)在轉(zhuǎn)錄前，與上述研究結(jié)果相符合。

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