尹壽新，馬美雪，周 震，羊東曄

1.萊蕪市人民醫(yī)院消化內(nèi)科，山東 萊蕪271100;2.徐州市中心醫(yī)院消化內(nèi)科;3.長(zhǎng)沙市第一醫(yī)院消化內(nèi)科;4.香港大學(xué)深圳醫(yī)院消化及肝病科

肝癌是位居世界第五位的惡性腫瘤［1］。在中國(guó)由于乙型肝炎病毒的流行，HCC 成為第三位致死性惡性腫瘤。GPC3 是一種新型HCC 血清標(biāo)記物，在HCC組織中呈特異性高表達(dá)，而在正常肝、肝硬化等良性病變及癌旁肝組織中不表達(dá)或低表達(dá)［2］。GPC3 作為Glypican 家族中的一員，可以結(jié)合Wnts、Hedgehogs、FGFs、BMPs 等生長(zhǎng)因子參與這些信號(hào)通路的激活，而Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的異常活化在HCC 中很常見(jiàn)［3］。GPC3 很可能通過(guò)活化Wnt/β-catenin 信號(hào)通路促進(jìn)HCC 細(xì)胞生長(zhǎng)。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑 人胎盤(pán)組織取自北大深圳醫(yī)院婦產(chǎn)科。Trizol Reagent 購(gòu)自Invitrogen 公司。Reverse Transcription system 和GoTaq Green Master Mix 購(gòu)自Promega 公司。Pyrobest DNA Polymerase、EcoR I、EcoR I、DNA A-Tailing Kit、DNA Ligation Kit Ver.2.0及各種DNA Marker 均購(gòu)自大連寶生物公司。E.Z.N.ATM Gel Extraction Kit 和E. Z. N. ATM Plasmid Mini Kit I 購(gòu)自美國(guó)Omega Bio-Tek。pcDNA3.1(+)質(zhì)粒由羊東曄老師惠贈(zèng)。肝癌細(xì)胞HepG2 購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。攜帶人GPC3 全長(zhǎng)基因的pcDNA3.1(+)質(zhì)粒系前期試驗(yàn)合成，儲(chǔ)存于中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室。澳洲胎牛血清(FBS)、DMEM 培養(yǎng)液均購(gòu)自GIBCO 公司。轉(zhuǎn)染試劑Attractene Transfection Reagent購(gòu)自Qiagen 公司。GPC3 多克隆抗體(SANTA CRUZ，貨號(hào)sc-292920)，GPC3 單克隆抗體(Epitomics，貨號(hào)3697-1)，β-catenin 單克隆抗體(Epitomics，貨號(hào)1247-1)，c-myc (N-term)單克隆抗體(Epitomics;貨號(hào)1472-1)，Cyclin D1 單克隆抗體(Epitomics，貨號(hào)1677-1)，GAPDH 多克隆抗體(Millipore，貨號(hào)ABS16)，辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG 購(gòu)自Jakson 公司，辣根酶標(biāo)記小鼠抗兔IgG 購(gòu)自Sigma 公司。RIPA 裂解液、蛋白酶抑制劑、PVDF 膜、顯色液均購(gòu)自Millipore 公司。MTT 和二甲基亞砜DMSO 購(gòu)自Sigma 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/GPC3-ORF 的構(gòu)建與提取:TRIzol 抽提人胎盤(pán)組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 備用。以GenBan 號(hào):NM004484 序列為模板利用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)上游引物5＇-ctgccactctcccgcgctctcc-3＇和下游引物5＇-gtggttcccttatcgaggaagac-3＇，并在上游引物5＇端中加入EcoR I 酶切位點(diǎn)(GAATTC)，在下游引物5＇ 端中加入EcoR I 酶切位點(diǎn)(CTCGAG)。從cDNA中用pyrobest 酶擴(kuò)增包含GPC3-ORF 的基因片段-L-GPC3(1.851 kb)。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。按照E. Z. N. ATM Gel Extraction Kit 提供的操作步驟回收DNA。EcoR I、Xho I 雙酶切pcDNA3.1(+)和DNA。按照E.Z.N.ATM Gel Extraction Kit 提供的操作步驟回收酶切產(chǎn)物。將膠回收純化得到的產(chǎn)物按照DNA Ligation Kit Ver.2.0 說(shuō)明書(shū)16 ℃過(guò)夜連接。連接產(chǎn)物按照試劑盒說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)化至LB/氨芐平板上。分別隨機(jī)挑取幾個(gè)含上述質(zhì)粒的菌落于含100 mg/ml 的氨芐青霉素的3 ml LB 液體培養(yǎng)液中，290 r/min 培養(yǎng)12 ～16 h。用所得菌液作PCR 驗(yàn)證。所得產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察條帶，分析其分子量大小是否正確。分子量大小正確的菌液，取0.5 ml 送上海生工生物工程有限公司測(cè)序進(jìn)行再驗(yàn)證。按照E.Z.N.ATM Plasmid Mini Kit I 試劑盒操作步驟提取質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/GPC3-ORF。

1.2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染與Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的檢測(cè):采用含10% 胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺和100 U/ml 青霉素/鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)HepG2于5% CO2、37 ℃、濕度100%的恒溫培養(yǎng)箱中。轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組HepG2 細(xì)胞分別種板，待細(xì)胞融合至40% ～50%時(shí)用pcDNA3. 1(+ )/GPC3 質(zhì)粒和pcDNA3. 1(+)空白質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染。60 h 后用加入蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液提取蛋白，Western blotting 檢測(cè)兩組GPC3、β-catenin、c-myc、cyclinD1 的表達(dá)情況以判斷是否轉(zhuǎn)染成功及Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的活化程度是否有差異。分別將96 孔板中轉(zhuǎn)染后24、48、72 h 的轉(zhuǎn)染組、對(duì)照組HepG2 取出，傾去液體，加入5 g/L 的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，吸取上清，每孔加入150 μl 二甲基亞砜，室溫下?lián)u床上搖晃10 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm的A 值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)連續(xù)性資料用±s 表示，兩樣本均數(shù)比較采用t 檢驗(yàn);多組間均數(shù)比較采用方差分析。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GPC3 轉(zhuǎn)染至HepG2 肝癌細(xì)胞 轉(zhuǎn)染60 h 后分別提取蛋白Western blotting 檢測(cè)GPC3 表達(dá)量和Wnt/β-catenin 通路活化程度。用兔抗人GPC3 單克隆抗體(Epitomics，貨號(hào)3697-1)檢測(cè)出現(xiàn)4 條帶，內(nèi)參一致情況下，各個(gè)條帶上相對(duì)于對(duì)照組，轉(zhuǎn)染組的信號(hào)都要高，HepG2 肝癌細(xì)胞成功轉(zhuǎn)染GPC3(見(jiàn)圖1)。

2.2 Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的檢測(cè)與MTT 對(duì)Wnt 通路檢測(cè)發(fā)現(xiàn)β-catenin、c-myc、cyclinD1 都升高且差異較大(見(jiàn)圖2)，GPC3 可活化Wnt/β-catenin 通路。增殖實(shí)驗(yàn)示轉(zhuǎn)染后24、48、72 h 的轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組HepG2 細(xì)胞OD 值分別為0. 475 與0. 485(P ＞0.05)、0. 486 與0. 503(P ＜0. 05)、0. 500 與0. 525(P ＜0.05)，GPC3 過(guò)表達(dá)的HepG2 細(xì)胞增殖較未轉(zhuǎn)染組加快，Wnt/β-catenin 活化可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)(見(jiàn)圖3)。

圖1 Western blotting 檢測(cè)GPC3 表達(dá)量Fig 1 Expression of GPC3 by Western blotting

3 討論

圖2 HepG2 轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組Wnt/β-catenin 通路的活化情況比較Fig 2 Comparison of the activation of Wnt/β-catenin pathway between the transfected HepG2 cells group and control group

圖3 轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組增殖速度對(duì)比Fig 3 Comparison of growth speed between the transfected HepG2 cells group and control group

Wnt/β-catenin 信號(hào)異?；罨吩贖CC 發(fā)生、發(fā)展中的意義重大。研究發(fā)現(xiàn)突變?chǔ)?catenin 下Wnt通路的活化和正常β-catenin 下Wnt 通路的活化并不能引起相同的靶基因表達(dá)。存在活化的Wnt 通路的肝癌分成有(或多)β-catenin 突變的和無(wú)(或少)βcatenin 突變的，前者以肝相對(duì)特異的Wnt 靶基因過(guò)表達(dá)、腫瘤細(xì)胞高度分化和低度惡性、染色體相對(duì)穩(wěn)定、預(yù)后較好為特征，后者表現(xiàn)為經(jīng)典的Wnt 通路靶基因(cylinD1、c-myc 等)過(guò)表達(dá)、染色體高度不穩(wěn)定、生物學(xué)上侵襲生長(zhǎng)、與慢性乙型肝炎病毒感染密切相關(guān)［3-6］。并且將HepG2 細(xì)胞歸類于前者，認(rèn)為突變的β-catenin 不能誘導(dǎo)c-myc、cyclinD1 等Wnt 經(jīng)典靶基因的表達(dá)［3］。我們的研究證明了擁有完整Wnt/β-catenin 信號(hào)通路成分的HepG2 細(xì)胞在過(guò)度活化時(shí)同樣可以誘導(dǎo)c-myc、cyclinD1 等Wnt 經(jīng)典靶基因的表達(dá)。同時(shí)，用兔抗人GPC3 單克隆抗體檢測(cè)出現(xiàn)4 條帶，此前未見(jiàn)HepG2 有類似報(bào)道，考慮與GPC3 的不同剪切有關(guān)。由于人GPC3 核心蛋白(不含HS 鏈)分子量約為65 KD，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)被剪切成40 KD、30 KD 大小的兩個(gè)亞基，30 KD 的小亞基(C 端，可借糖基磷脂酰肌醇GPI 錨定于細(xì)胞膜)可因硫酸乙酰肝素HS 鏈的大小呈現(xiàn)不同的分子量，故推測(cè)此抗體識(shí)別GPC3 蛋白C端，由上及下分別為含HS 鏈的核心GPC3、不含HS 鏈的核心GPC3、含HS 鏈的C 端GPC3(第359 ～580 位氨基酸)和不含HS 鏈的C 端GPC3(第359 ～580 位氨基酸)。

Wnt 通路在肝癌中的活化提示抑制Wnt 通路可以阻斷此類肝癌的發(fā)生、發(fā)展。已發(fā)現(xiàn)多種分泌蛋白在調(diào)控Wnt/β-catenin 通路上發(fā)揮重要作用，GPC3 就是其中之一。多項(xiàng)調(diào)查研究表明GPC3 與肝癌關(guān)系密切，GPC3 已被看作是一個(gè)新的肝癌腫瘤標(biāo)志物:GPC3在肝癌細(xì)胞系HepG2、Hep3B、HT17、HuH6、HuH7 和PLC/PRF/5 中高度表達(dá)［7］;運(yùn)用免疫組化對(duì)不同肝病的研究中也發(fā)現(xiàn)GPC3 只在肝細(xì)胞癌組織中呈陽(yáng)性染色，在正常肝、硬化肝或良性病變及癌旁肝組織中均呈陰性染色［2］。早期肝癌診斷國(guó)際評(píng)議小組聲明GPC3在診斷小肝癌方面敏感性和特異性分別為77%、96%，推斷GPC3 陽(yáng)性高度提示病變惡性［8］。更重要的是，與甲胎蛋白(a-fetoprotein，AFP)相比，肝癌中GPC3 在mRNA 和蛋白水平陽(yáng)性率方面都更高，在＜3 cm的肝癌方面優(yōu)勢(shì)更明顯［9］。美國(guó)肝病研究協(xié)會(huì)在最新指南中聲明:“GPC3、HSP70(heat shock protein)和GS(Glutamine Synthetase)免疫染色可輔助肝癌病理學(xué)診斷，三者中兩個(gè)陽(yáng)性可確定肝癌診斷”［10］。

在血清學(xué)診斷方面，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)血清GPC3 在原發(fā)肝癌中的表達(dá)顯著高于肝硬化、慢性肝炎、其他腫瘤及正常肝組織［2，9，11］。在高度及中度分化肝癌中，GPC3 較AFP 敏感性更高，且與AFP 聯(lián)合時(shí)可將敏感度從50%提高至72%［11］。

GPC3 通過(guò)Wnt 通路促進(jìn)肝癌發(fā)生、發(fā)展的研究成果為肝癌治療提供了依據(jù)。Ishiguro 等［12］研究發(fā)現(xiàn)GC33(一個(gè)抗人GPC3 單克隆抗體)明顯抑制SCID 小鼠體內(nèi)GPC3 陽(yáng)性人肝癌移植物的生長(zhǎng)，而GPC3 陰性肝癌移植物不受影響。用此抗體進(jìn)行的進(jìn)展期肝癌生物治療Ⅰ期臨床試驗(yàn)表明每周20 mg/kg GC33 靜脈給藥無(wú)明顯不良反應(yīng)［13-14］。另一項(xiàng)Ⅰ期臨床試驗(yàn)中，Sawada 等［15］將包含可誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T 細(xì)胞活化的兩種GPC3 多肽的疫苗注射入人體，他們發(fā)現(xiàn)這種疫苗在絕大多數(shù)人體內(nèi)產(chǎn)生可觀測(cè)到的免疫反應(yīng)而不造成明顯傷害。可以說(shuō)GPC3 為肝癌治療提供了一種新的生物靶點(diǎn)。

［1］ Poon D，Anderson BO，Chen LT，et al. Management of hepatocellular carcinoma in Asia:consensus statement from the Asian Oncology Summit 2009［J］. Lancet Oncol，2009，10(11):1111-1118.

［2］ Nakatsura T，Yoshitake Y，Senju S，et al. Glypican-3，overexpressed specifically in human hepatocellular carcinoma，is a novel tumor marker［J］. Biochem Biophys Res Commun，2003，306(1):16-25.

［3］ Lachenmayer A，Alsinet C，Savic R，et al. Wnt-pathway activation in two molecular classes of hepatocellular carcinoma and experimental modulation by sorafenib［J］. Clin Cancer Res，2012，18(18):4997-5007.

［4］ Suzuki T，Yano H，Nakashima Y，et al. Beta-catenin expression in hepatocellular carcinoma:a possible participation of beta-catenin in the dedifferentiation process［J］. J Gastroenterol Hepatol，2002，17(9):994-1000.

［5］ Hoshida Y，Nijman SM，Kobayashi M，et al. Integrative transcriptome analysis reveals common molecular subclasses of human hepatocellular carcinoma［J］. Cancer Res，2009，69(18):7385-7392.

［6］ Pez F，Lopez A，Kim M，et al. Wnt signaling and hepatocarcinogenesis:molecular targets for the development of innovative anticancer drugs［J］. J Hepatol，2013，59(5):1107-1117.

［7］ Midorikawa Y，Ishikawa S，Iwanari H，et al. Glypican-3，overexpressed in hepatocellular carcinoma，modulates FGF2 and BMP-7 signaling［J］. Int J Cancer，2003，103(4):455-465.

［8］ International Consensus Group for Hepatocellular Neoplasia The International Consensus Group for Hepatocellular Neoplasia. Pathologic diagnosis of early hepatocellular carcinoma:a report of the international consensus group for hepatocellular neoplasia［J］. Hepatology，2009，49(2):658-664.

［9］ Capurro M，Wanless IR，Sherman M，et al. Glypican-3:a novel serum and histochemical marker for hepatocellular carcinoma［J］. Gastroenterology，2003，125(1):89-97.

［10］ Bruix J，Sherman M. Management of hepatocellular carcinoma:an update［J］. Hepatology，2011，53(3):1020-1022.

［11］ Hippo Y，Watanabe K，Watanabe A，et al. Identification of soluble NH2-terminal fragment of glypican-3 as a serological marker for earlystage hepatocellular carcinoma ［J］. Cancer Res，2004，64(7):2418-2423.

［12］ Ishiguro T，Sugimoto M，Kinoshita Y，et al. Anti-glypican 3 antibody as a potential antitumor agent for human liver cancer［J］. Cancer Res，2008，68(23):9832-9838.

［13］ Zhu AX，Gold PJ，El-Khoueiry AB，et al. First-in-man phase I study of GC33，a novel recombinant humanized antibody against glypican-3，in patients with advanced hepatocellular carcinoma ［J］. Clin Cancer Res，2013，19(4):920-928.

［14］ Ikeda M，Ohkawa S，Okusaka T，et al. Japanese phase I study of GC33，a humanized antibody against glypican-3 for advanced hepatocellular carcinoma［J］. Cancer Sci，2014，105(4):455-462.

［15］ Sawada Y，Yoshikawa T，Nobuoka D，et al. Phase I trial of a glypican-3-derived peptide vaccine for advanced hepatocellular carcinoma:immunologic evidence and potential for improving overall survival ［J］. Clin Cancer Res，2012，18(13):3686-3696.