糞便中SFRP2基因甲基化與大腸癌的相關(guān)性

賈鳳潔孫冬生徐龍健1劉寧曹立贏2

(唐山開灤總醫(yī)院腫瘤科，河北唐山063000)

摘要〔〕目的探討糞便中的分泌型卷曲相關(guān)蛋白(SFRP)2基因甲基化對(duì)大腸癌患者的診斷價(jià)值。方法選取2011年12月至2013年12月該院經(jīng)病理檢查確診的52例大腸癌病人及32例結(jié)腸鏡陰性的健康者(對(duì)照組)。通過亞硫酸氫鹽的限制酶法(COBRA)檢測大腸癌52例糞便中SFRP2基因啟動(dòng)子兩個(gè)區(qū)域(區(qū)域1和區(qū)域2)甲基化狀態(tài)，分析SFRP2基因甲基化與腫瘤臨床病理因素的關(guān)系。結(jié)果大腸癌患者及健康者糞便中廣泛甲基化、部分甲基化及無甲基化分別為59.6%(31/52)、84.6%(44/52)、15.4%(8/52)和12.5%(4/32)，25.0%(8/32)、75.0%(24/32)；廣泛和部分SFRP2的甲基化率在大腸癌患者糞便的檢出率均明顯高于健康體檢者(P<0.05)；SFRP2基因甲基化與大腸癌患者性別、腫瘤分期、浸潤程度無顯著關(guān)聯(lián)。結(jié)論SFRP2基因甲基化是大腸癌進(jìn)展過程中的早期事件，糞便SFRP2基因甲基化有望成為早期無創(chuàng)診斷大腸癌的新途徑。

關(guān)鍵詞〔〕分泌型卷曲相關(guān)蛋白2；基因甲基化；大腸癌

中圖分類號(hào)〔〕R735〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：中國煤炭工業(yè)協(xié)會(huì)2012年度科學(xué)技術(shù)研究指導(dǎo)性計(jì)劃項(xiàng)目(No.MTKJ 2012-420)

通訊作者：孫冬生(1963-)，男，主治醫(yī)師，主要從事腫瘤內(nèi)科方面的研究。

1普外科2肝膽外科

第一作者：賈鳳潔(1972-)，女，主治醫(yī)師，主要從事腫瘤與基因甲基化關(guān)系的方面的研究。

大腸癌的早期診斷有助于提高患者生存率及生活質(zhì)量，但發(fā)病機(jī)制尚不清楚。新進(jìn)研究發(fā)現(xiàn)，表觀遺傳學(xué)改變和突變?cè)诖竽c癌的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用，相關(guān)基因尤其是抑癌基因、凋亡相關(guān)基因、DNA修復(fù)基因等啟動(dòng)子發(fā)生甲基化可導(dǎo)致其表達(dá)沉默，并且這是大腸癌發(fā)生的早期事件〔1〕。DNA甲基化改變與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，正常腸道黏膜每天有大量細(xì)胞更新脫落進(jìn)入腸腔，隨糞便排出體外。分泌型卷曲相關(guān)蛋白(SFRP)2基因是一種新發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制基因，在大多數(shù)大腸癌中表現(xiàn)出過甲基化。檢測糞便中結(jié)直腸相關(guān)基因的甲基化狀態(tài)有望成為早期無創(chuàng)診斷大腸癌的新途徑。

1材料與方法

1.1組織及糞便標(biāo)本的收集 選取2011年12月至2013年12月我院經(jīng)病理檢查確診的52例大腸癌病人。納入標(biāo)準(zhǔn)〔2〕：(1)首次確診病例；(2)收集標(biāo)本前未治療和操作性腸道檢查；(3)無其他重要臟器，如心、肺、腎等的病變。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)并發(fā)其他腫瘤；(2)術(shù)前均接受化療或放療等治療；(3)不支持或無法配合完成本研究患者。另選取同期32例結(jié)腸鏡陰性的健康者為對(duì)照組。大腸癌患者男28例，女24例，年齡39～75〔平均(60.4±14.6)〕歲；對(duì)照組32例，男17例，女15例，年齡62～68〔平均(65±2.1)〕歲；兩組年齡和性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。所有研究對(duì)象的糞便標(biāo)本均在術(shù)前或內(nèi)鏡檢查前收集，收集后2 h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室，分裝后置于-80℃冰箱保存。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2主要儀器德國Analytik JenaAG公司的flexcycler PCR儀；美國Bio-Rad公司 PowerPacTM Basic Power Supply型電泳儀；美國Bio-Rad公司Sub-Cell GT 電泳槽；加拿大carestream公司的Gel Logic 212 PRO型凝膠成像的分析系統(tǒng)；美國Thermo公司Ultro freeze 3410超低溫冰箱；中國寧波永新光學(xué)股份有限公司NIB-100型顯微鏡；美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(ABI)，310測序儀等。

1.3主要試劑PCR擴(kuò)增引物中各序列均由上海的英駿公司設(shè)計(jì)合成；瓊脂糖產(chǎn)于美國的Promega公司；寶生物TEXPAT試劑盒；EZ DNA Methylation KitTM。亞硫酸鹽(Sigma)、苯二酚(Hydroquinone，Sigma)、Buffer(Promega 公司)。

1.4方法

1.4.1糞便DNA提取(不需要精制)取1 mg糞便放入裝有1.5 ml裂解液的2 ml離心管中(裂解液的制作：1 mol/L Tris 5 ml+0.5 mol/L EDTA 1 ml)，95℃加熱10 min后充分震蕩；5 000 r/min離心5 min(室溫)；取上清液放入新的2 ml離心管中。

1.4.2改良的亞硫酸鹽液體配制取1.8 g的亞硫酸鹽(Sigma),放入50 ml離心管中；加入純凈水2 ml、12.5 mol/L的NaOH 100 μl及10 mmol/L 對(duì)苯二酚300 μl(Hydroquinone，Sigma)。充分震蕩后微波爐加溫，再次震蕩使之完全溶解。

1.4.3改良的糞便DNA的亞硫酸鹽處理濃度：糞便上清液200 μl + 上述2溶液150 μl(最終亞硫酸鹽濃度2.63 mol/L);溫度條件：95℃ 15 min, 4℃ 10 min,75℃ 60 min。

1.4.4脫硫處理使用EZ DNA MethylationTM Kit。取350 μl的M-Binging Buffer，放入經(jīng)過上述處理后的溶液中，混勻后放入Zymo-Spin IC Column中500 r/min離心5 min(室溫)；加入M-Desulphonation Buffer 200 μl, 500 r/min離心5 min(室溫)；此操作充分兩次；最后加入純凈水40 μl,室溫放置10 min后離心，作為PCR增擴(kuò)時(shí)DNA模板使用。甲基化引物(熒光標(biāo)記):SFRP2區(qū)域1正義:GTYGGAGTTTTTYGGAGTTG，反義：AACCCRCTCTCTTCRCTAAATAC，熒光標(biāo)記NED，產(chǎn)物長度139 bp，酶切后長度：139、118、116，Hhal 37℃，12 h；區(qū)域2正義:GGTTGTTAGTTTTTYGGGGTTT，熒光標(biāo)記 PET；反義:CAACIAACCAAAACCCTACAACAT，產(chǎn)物長度：153 bp，酶切后長度：120 bp，Hhal 37℃，12 h。PCR反應(yīng)：Hot Start Taq Master Mix 12 μl，上下游引物各0.4 μmol/L，DNA模板4 μl，加水至24 μl。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS13.0軟件行χ2檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1經(jīng)酶切后310測序儀電泳結(jié)果經(jīng)酶切后310測序儀電泳結(jié)果見圖1和圖2所示，大腸癌患者糞便SFRP2基因廣泛甲基化，健康人群糞便SFRP2基因無廣泛甲基化。

圖1　大腸癌患者糞便SFRP2基因廣泛甲基化

圖2　健康人群糞便SFRP2基因無廣泛甲基化

2.2兩組研究對(duì)象糞便標(biāo)本甲基化情況比較大腸癌患者及健康者糞便中廣泛甲基化、部分甲基化及無甲基化分別為59.6%(31/52)、84.6%(44/52)、15.4%(8/52)和12.5%(4/32)、25.0%(8/32)、75.0%(24/32)；廣泛和部分SFRP2甲基化在大腸癌患者糞便的檢出率均明顯高于健康體檢者(均P<0.05)。

2.3大腸癌患者臨床特征與重亞硫酸鹽限制性內(nèi)切酶(COBRA)法檢測糞便SFRP2基因陽性率的關(guān)系COBRA檢測糞便結(jié)果與大腸癌患者性別、年齡、腫瘤分期等無顯著關(guān)聯(lián)(均P>0.05)。見表1。

表1SFRP2基因與大腸癌臨床特征的關(guān)系〔n(%)〕

臨床特征nSFRP2基因陽性χ2值P值性別 男2825(89.3)1.0170.313 女2419(79.1)TNM分期 Ⅰ/Ⅱ2521(84.0)0.0140.906 Ⅲ/Ⅳ2723(85.2)浸潤程度 黏膜下層2017(85.0)0.0040.952 >肌層3227(84.4)

3討論

大腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，近年來，隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，我國人民生活水平的提高，其發(fā)病率呈現(xiàn)逐年升高的趨勢，因此大腸癌預(yù)防的意義越來越重要〔3〕。由于癌瘤生長速度緩慢，在其達(dá)到產(chǎn)生癥狀、體征之前要經(jīng)過相當(dāng)長的時(shí)間，故臨床前來就診的患者往往癌腫已到晚期〔4〕。因此，早期診斷是提高大腸癌患者生存率及生活質(zhì)量的關(guān)鍵。

DNA的異常甲基化可為非侵襲性檢測結(jié)大腸癌提供一種新的策略，通過對(duì)無癥狀人群進(jìn)行篩查或?qū)τ写竽c癌家族史或確診有癌前病變的患者進(jìn)行監(jiān)測是發(fā)現(xiàn)早期癌的重要途徑〔5〕。目前傳統(tǒng)確診大腸癌的常規(guī)方法有纖維結(jié)腸鏡檢查和病理活檢等，但上述方法要求患者禁食、導(dǎo)瀉等腸道準(zhǔn)備，且檢查過程痛苦而繁瑣以及需要花費(fèi)病人較長的工作及休息時(shí)間等因素而不易被患者接受。近年來用于初篩的便潛血試驗(yàn)因?yàn)橐资芏喾N因素的影響而出現(xiàn)假陽性和假陰性，特異性差。故尋找更為敏感特異、簡便、無創(chuàng)、安全的檢測手段已成為大腸癌防治的重要課題之一。糞便DNA檢測由于具備上述諸多優(yōu)勢，已成為近年來歐美等國大腸癌檢測研究的熱點(diǎn)〔6〕。最近研究顯示，表觀遺傳學(xué)改變特別是DNA甲基化和突變?cè)诖竽c癌的發(fā)生發(fā)展過程(結(jié)腸息肉、進(jìn)展型腺瘤和大腸癌)中起著重要的作用，DNA甲基化變化被認(rèn)為是結(jié)直腸癌發(fā)生的一個(gè)關(guān)鍵機(jī)制。人類有五種SFRP基因，其中SFRP2作為Wnt信號(hào)調(diào)控基因，涉及腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展。據(jù)目前多名學(xué)者研究指出SFRP2基因是腫瘤發(fā)生通路——Wnt信號(hào)通路的可溶性調(diào)整基因之一，在大腸癌、結(jié)腸腺瘤和隱窩病灶中發(fā)生頻繁的甲基化，通過基化而使基因沉默的存在是大腸癌一個(gè)重要特征〔7〕。據(jù)報(bào)道〔8,9〕，正常腸道黏膜每天都會(huì)有大量細(xì)胞更新脫落進(jìn)入腸腔，通過糞便排出體外。而大腸癌細(xì)胞增殖代謝更較正常腸道黏膜細(xì)胞旺盛，只要采取適當(dāng)?shù)姆椒▽⒓S便中DNA提取出來，經(jīng)過PCR擴(kuò)增相關(guān)突變基因，再通過適當(dāng)?shù)姆椒▽?duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析，糞便中來自胃腸道腫瘤的所有遺傳和后生變化的脫落細(xì)胞都能被檢測出來，惡化前的腺瘤和大腸癌都可能通過這種方法檢測,故分析糞便本研究說明糞便中甲基化的SFRP2基因是篩選大腸癌及癌前病變的一個(gè)很有前景的敏感的標(biāo)志。

綜上所述，糞便甲基化檢測有望成為大腸癌早期無創(chuàng)診斷或高風(fēng)險(xiǎn)人群篩選的一個(gè)新途徑。

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9肖著軍,王新穎,李丙生,等.聯(lián)合檢測vimentin和SFRP2甲基化在大腸癌篩查中的應(yīng)用評(píng)價(jià)〔J〕.現(xiàn)代消化及介入診療,2014;19(1):13-16,20.

〔2013-12-09修回〕

(編輯袁左鳴)