胰島素對人肝癌HepG2細胞的侵襲特性及增殖能力的影響

劉曉梅鄭輝陳尚吳萍萍1

(蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院護理學(xué)院，江蘇蘇州215009)

摘要〔〕目的探討不同濃度胰島素對肝癌細胞系HepG2侵襲特性及體外增殖能力的影響及其可能機制。方法將人肝癌細胞系HepG2細胞培養(yǎng)于不同胰島素濃度的高糖培養(yǎng)基中，應(yīng)用預(yù)鋪Matrigel基質(zhì)膠的Transwell小室檢測不同胰島素濃度對HepG2細胞侵襲能力的影響；應(yīng)用PI單染流式細胞儀技術(shù)檢測不同濃度胰島素對HepG2細胞周期的影響；運用CCK-8方法檢測不同濃度胰島素對HepG2細胞增殖能力的影響；同時應(yīng)用RT-PCR檢測不同胰島素濃度培養(yǎng)的HepG2細胞中MMP-2、、MMP-9轉(zhuǎn)錄水平的變化。結(jié)果在一定濃度范圍內(nèi)，HepG2細胞的侵襲能力與胰島素濃度成正相關(guān)(P<0.05)；在一定濃度范圍內(nèi)，高濃度胰島素能促進HepG2細胞的體外增殖能力，并加快HepG2細胞G0/G1至S期轉(zhuǎn)換，加快細胞周期的進展(P<0.05)；在一定濃度范圍內(nèi)，HepG2細胞MMP-2、MMP-9轉(zhuǎn)錄水平與胰島素濃度成正相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論在一定濃度范圍內(nèi)，胰島素可能通過上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶表達水平促進HepG2的侵襲能力，并通過驅(qū)動HepG2細胞G0/G1至S期轉(zhuǎn)換促進HepG2細胞的增殖能力。

關(guān)鍵詞〔〕HepG2細胞；高胰島素；侵襲；基質(zhì)金屬蛋白酶；增殖

中圖分類號〔〕R446.1〔文獻標(biāo)識碼〕A〔

基金項目：江蘇省衛(wèi)生廳衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)教育研究立項課題(No.JZ201101)

1蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物技術(shù)中心

第一作者：劉曉梅(1972-)，女，教授，碩士，主要從事高職基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教學(xué)研究。

2010年美國糖尿病學(xué)會(ADA)和美國癌癥學(xué)會(ACS)聯(lián)合發(fā)表共識聲明指出糖尿病(主要為2型)與包括肝癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤的發(fā)生風(fēng)險增加有關(guān)，相關(guān)數(shù)據(jù)分析顯示，糖尿病患者原發(fā)性肝癌發(fā)生的相對風(fēng)險約為一般人群的2倍以上〔1〕。一般認為糖尿病可通過數(shù)種機制來影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展，如胰島素/胰島素樣生長因子受體軸、高胰島素血癥、高血糖或慢性炎癥等〔2〕。在2型糖尿病中普遍存在高胰島素血癥被認為與腫瘤的發(fā)病密切相關(guān)，但其確切機制尚不清楚〔3〕。本研究探討高糖環(huán)境中不同濃度的胰島素對肝癌細胞系HepG2侵襲特性及增殖能力的影響及其可能機制。

1材料與方法

1.1材料及儀器肝癌細胞HepG2購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫，8 μm Transwell板購自美國corning公司，Matrigel基質(zhì)膠購于美國BD公司，總mRNA提取Trizol試劑盒購自南京生興生物公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas公司，PCR引物合成于蘇州金唯智技術(shù)有限公司，CCK-8試劑購自日本同仁株式會，細胞周期試劑盒購自南京凱基生物公司，胎牛血清購自美國Hyclone公司，DMEM高糖細胞培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，GENMED結(jié)晶紫細胞染色試劑購自上海杰美醫(yī)藥科技有限公司，胰島素購自江蘇萬邦生化醫(yī)藥公司。

1.2實驗分組陰性對照組：常規(guī)培養(yǎng)，無胰島素干預(yù)；胰島素干預(yù)組分為1×10-8mmol/L胰島素組、1×10-6mmol/L胰島素組、1×10-4mmol/L胰島素組。

1.3細胞侵襲實驗將HepG2細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，常規(guī)消化計數(shù)，重懸于不同胰島素濃度的無血清高糖DMEM中，并調(diào)整濃度至2×105個/ml，取150 μl細胞懸液接種到預(yù)鋪有Matrigel基質(zhì)膠的Transwell小室中，Transwell小室外面加入600 μl含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。48 h后，用棉簽輕輕擦除小室上層的細胞，并參照說明書用GENMED結(jié)晶紫細胞染色試劑盒將Transwell小室下層細胞著色，每孔隨機選取10個視野拍照并計數(shù)分析，分析細胞侵襲能力的變化。實驗重復(fù)3次。

1.4細胞增殖實驗培養(yǎng)HepG2細胞至對數(shù)生長期，常規(guī)消化計數(shù)，調(diào)整細胞濃度至2×104個/ml,然后將細胞接種于96孔板中，每孔100 μl細胞懸液，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞每天更換不同胰島素濃度的新培養(yǎng)基。每板設(shè)4組細胞，每組5個重復(fù)孔，共鋪6個板。自第一天起，每天用CCK-8檢測細胞增殖情況。在避光條件下每孔加10 μl CCK-8溶液，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中孵育90 min。然后用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定其光吸收值，共6 d，作出生長曲線。實驗重復(fù)3次。

1.5細胞DNA分布在6孔板中培養(yǎng)各組細胞密度至70%～80%，常規(guī)制備單細胞懸液，收集至離心管中，用預(yù)冷的PBS洗滌細胞兩次。預(yù)冷的1 ml PBS再次重懸細胞，逐滴加入3 ml預(yù)冷的無水乙醇，4℃固定過夜后去除上清，并用預(yù)冷PBS洗滌細胞兩次。然后加入100 μl Rnase A 37℃水浴30 min。再加入400 μl PI染色混勻，4℃避光孵育30 min。用流式細胞儀在488 nm波長處檢測，分析各組細胞DNA分布。重復(fù)3次。

1.6逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測與侵襲遷移相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄水平的變化按照總mRNA Trizol提取試劑盒與逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明提取細胞總mRNA，并將4 μg mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。取1 μl cDNA進行20 μl體系PCR擴增，電泳結(jié)果用Quentity One軟件進行拍照分析。PCR引物如下：MMP-2上游引物,5’-AGGCAAGTGACTTCTCAGTTTCT-3’，下游引物,5’-TATCCATCGCCATGCTCCCA-3’；MMP-9上游引物，5’-TTCAGGGAGACGCCCATTTC-3’，下游引物，5’-TGGGTGTAGAGTCTCTCGCT-3’；GAPDH上游引物,5’-ATGGGCAGCCGTTAGGAAAG-3’，下游引物,5’-GCAAATGAGCCCCAGCCTTC-3’。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗。

2結(jié)果

2.1不同濃度胰島素在體外對HepG2細胞侵襲能力的影響在侵襲實驗中，無胰島素組、1×10-8mmol/L胰島素組、1×10-6mmol/L胰島素組、1×10-4mmol/L胰島素組穿過Transwell小室基膜的細胞數(shù)分別為(35.3±2.9)、(39.7±3.5)、(53.7±3.2)及(81.7±2.9)，各組間穿膜細胞數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。表明胰島素能顯著促進HepG2細胞侵襲和遷移能力，并在一定濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴性。見圖1。

2.2不同濃度胰島素在體外對HepG2細胞增殖能力的影響隨著胰島素濃度的增加，HepG2細胞的增殖能力逐漸增加，且在1×10-4mmol/L時胰島素的促增殖作用異常顯著，各濃度組間的差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

圖1　倒置顯微鏡白光下所拍穿過Transwell小室基底膜 各組細胞的情況(×100)

圖2　各組細胞的增殖曲線

圖3　各組細胞細胞周期分析圖

2.3不同濃度胰島素在體外對HepG2細胞細胞周期分布的影響隨著胰島素濃度的增加，處于S期的細胞比例逐漸增加，處于G1期的細胞比例逐漸減少，胰島素干預(yù)組較無胰島素干預(yù)組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3和表1。這說明胰島素可加快HepG2細胞G0/G1至S期轉(zhuǎn)換，促進HepG2細胞周期進展。

表1　不同濃度胰島素對HepG2細胞周期分布的影響 ± s)

與無胰島素干預(yù)組比較：1)P<0.05

2.4不同濃度胰島素在體外對HepG2細胞中金屬基質(zhì)蛋白酶(MMP)-2、MMP-9轉(zhuǎn)錄水平的影響隨著胰島素濃度的升高，HepG2細胞中MMP-2、MMP-9轉(zhuǎn)錄水平逐漸升高，各組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

M：marker，A：無胰島素干預(yù)，B：1×10 -8 mol/L，C：1×10 -6 mol/L，D：1×10 -4 mol/L 圖4　RT-PCR檢測不同濃度胰島素干預(yù)后HepG2 細胞中MMP-2、MMP-9 mRNA表達水平變化

3討論

越來越多的證據(jù)顯示糖尿病是肝癌發(fā)生發(fā)展過程中獨立風(fēng)險因素和術(shù)后復(fù)發(fā)的重要預(yù)后指標(biāo)，糖尿病與原發(fā)性肝癌之間存在密切的關(guān)系〔4,5〕。2型糖尿病以胰島素抵抗為主要特征，胰島素抵抗致使胰島素分泌代償性增加，胰島素是一種多功能激素類蛋白質(zhì)，也是人體細胞重要的生長因子，體外實驗、動物實驗和流行病學(xué)研究表明，高濃度胰島素能通過多種途徑促進癌癥的發(fā)生發(fā)展〔3,6〕，但其具體機制尚不明確。

腫瘤細胞快速、不可控性增殖是其癌變特性的最直接表現(xiàn)，腫瘤細胞的這種生物學(xué)特性決定了其較正常組織代謝旺盛，尤以惡性腫瘤更為明顯，為了滿足腫瘤細胞的迅速生長和分裂需要，其物質(zhì)代謝發(fā)生了一系列特征性改變。而胰島素作為細胞代謝中不可或缺的調(diào)控因子，其與癌細胞生長的關(guān)系一直備受關(guān)注〔7,8〕。本實驗結(jié)果提示，胰島素可通過加快HepG2細胞周期進程、促進細胞的分裂從而促進其增殖能力。

侵襲性生長是惡性肝癌細胞最顯著的臨床病理學(xué)特點之一，也是其肝癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的重要原因。本試驗表明，高濃度胰島素可能是肝癌惡化的重要原因。侵襲是一個多因素參與的、多步驟的高度協(xié)調(diào)過程，主要涉及以下三個步驟：腫瘤細胞與細胞外基質(zhì)(ECM)的黏附、腫瘤細胞分泌蛋白水解酶水解ECM以及細胞遷移出基底膜。其中ECM的降解被認為是整個侵襲行為的關(guān)鍵步驟〔9〕。MMPs是存在于肝癌細胞中重要的蛋白水解酶，能夠有效降解ECM，大量報道表明，MMPs在惡性肝癌中過度表達，且其表達水平與肝癌的惡性程度密切相關(guān)〔10〕。本實驗結(jié)果表明，高濃度胰島素可能是通過增加MMP-2、MMP-9轉(zhuǎn)錄活性而促進肝癌細胞侵襲能力。

4參考文獻

1Nagaoke Y,Hyogo H,Aikata H,etal.Recent trend of clinical features in patients with hepatocellular carcinoma〔J〕.Hepatol Res,2012;42(4):368-75.

2Hemkens LG,Grouven U,Bender R,etal.Risk of malignancies in patients with diabetes treated with human insulin or insulin analogues:a cohort study〔J〕.Diabetologia,2009;52(9):1732-44.

3Pisani P.Hyper-insulinaemia and cancer,meta-analyses of epidemiological studies〔J〕.Arch Physiol Biochem,2008;114(1):63-70.

4Singh S,Singh PP,Singh AG,etal.Anti-diabetic medications and the risk of hepatocellular cancer:a systematic review and meta-analysis〔J〕.Am J Gastroenterol,2013;108(6):881-91,92.

5盧瑜.糖尿病與惡性腫瘤關(guān)系的回顧性臨床研究〔J〕.中華內(nèi)分泌代謝雜志,2010;3(26):183-7.

6Gallagher EJ,Leroith D.The proliferating role of insulin and insulin-like growth factors in cancer〔J〕.Trends Endocrinol Metab,2010；21(10):610-8.

7Booy S,Van Eijck CH,Janssen JA,etal.IFN-beta is a potent inhibitor of insulin and insulin like growth factor stimulated proliferation and migration in human pancreatic cancer cells〔J〕.Am J Cancer Res,2015;5(6):2035-46.

8Pivovarova O,Von Loeffelholz C,Ilkavets I,etal.Modulation of insulin degrading enzyme activity and liver cell proliferation〔J〕.Cell Cycle,2015;14(14): 2293-300.

9Von Deiming A,Fimmers R,Schmidt MC,etal.Comprehensive allelotype and genetic anaysis of 466 human nervous system tumors〔J〕.J Neuropathol Experim Neurol,2000;59(6):544-58.

10Ha TY,Hwang S,Moon KM,etal.Sorafenib inhibits migration and invasion of hepatocellular carcinoma cells through suppression of matrix metalloproteinase expression〔J〕.Anticancer Res,2015;35(4):1967-76.

〔2014-06-19修回〕

(編輯苑云杰)