袁 婷，關(guān)曉菲（綜述），馬翠卿（審校）

（河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，河北省重大疾病免疫機(jī)制及干預(yù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北石家莊050017）

A族鏈球菌M蛋白相關(guān)疫苗的研究進(jìn)展

袁 婷，關(guān)曉菲（綜述），馬翠卿*（審校）

（河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，河北省重大疾病免疫機(jī)制及干預(yù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北石家莊050017）

釀膿鏈球菌；疫苗；綜述文獻(xiàn)

A族鏈球菌（group A streptococcus，GAS）也稱化膿性鏈球菌，是最常見(jiàn)的也是致病性最強(qiáng)的革蘭陽(yáng)性菌之一，其可以引起多種感染性疾病如扁桃體炎、急性咽炎、喉炎、風(fēng)濕熱、猩紅熱及嚴(yán)重的毒性休克綜合征。值得關(guān)注的是GAS感染后還可以導(dǎo)致嚴(yán)重的變態(tài)反應(yīng)性疾病如風(fēng)濕性心臟病、急性腎小球腎炎等。國(guó)內(nèi)外從來(lái)沒(méi)有停止過(guò)對(duì)GAS疫苗的研究，主要聚焦于免疫原性強(qiáng)的M蛋白，現(xiàn)就以M蛋白為基礎(chǔ)的疫苗研究進(jìn)展綜述如下。

1 GAS的流行病學(xué)

GAS廣泛存在于自然界、健康人的咽喉部以及人和動(dòng)物的糞便中，通過(guò)空氣、皮膚接觸等方式傳播。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，全球每年約有517 000例患者死于鏈球菌感染所致的各種疾病，其中約30%死于鏈球菌的侵襲性感染，近70%死于鏈球菌感染后所致的風(fēng)濕熱、風(fēng)濕性心臟病、急性腎小球腎炎等疾?。?］。我國(guó)廣東省、吉林省、浙江省、湖北省及重慶市學(xué)齡兒童GAS年平均感染率為50%，部分農(nóng)村地區(qū)GAS感染率高達(dá)70%～80%，GAS上呼吸道感染導(dǎo)致的風(fēng)濕性心臟病在5個(gè)省市兒童中平均發(fā)病率達(dá)22／10萬(wàn)［2］。

目前，治療GAS感染的主要措施為應(yīng)用抗生素如青霉素、大環(huán)內(nèi)脂類藥物，或靜脈注射免疫球蛋白。雖然沒(méi)有報(bào)道顯示GAS對(duì)青霉素有耐藥性，但相關(guān)研究證實(shí)青霉素在GAS咽炎的治療中失敗率達(dá)20%～40%［3］。而對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類敏感的GAS會(huì)利用生物膜形成隔離，成為逃避抗生素治療的機(jī)制從而在宿主體內(nèi)殘留［4］。嚴(yán)重的GAS侵襲性感染，如鏈球菌毒性休克綜合征和壞死性筋膜炎，靜脈內(nèi)注射免疫球蛋白以促進(jìn)調(diào)理吞噬作為輔助治療手段，收到一定的療效，但免疫球蛋白的弊端是只能提供短期保護(hù)。就目前形勢(shì)來(lái)看，GAS感染已成為臨床治療中的棘手問(wèn)題。所以，對(duì)于GAS的有效防治，除了控制傳染源外，應(yīng)用疫苗成為最有效的措施。

2 GAS疫苗中有效成分的選擇

關(guān)于GAS疫苗的研究是基于鏈球菌的各種蛋白及成分，如M蛋白、C5a肽酶、外毒素B、A族碳水化合物、鏈球菌纖連蛋白結(jié)合蛋白1（streptococcal fibronectin binding protein 1，Sfb1）、血清不透明因子（serum opacity factor，SOF）和纖連蛋白結(jié)合蛋白54（fibronectin binding protein 54，F(xiàn)BP54）等構(gòu)建并制備的亞單位疫苗，但因各種原因，迄今為止仍然沒(méi)有安全有效的GAS疫苗供人類使用［5－6］。最近一個(gè)時(shí)期，對(duì)GAS疫苗的研制進(jìn)入了新時(shí)代。通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助，利用反向疫苗學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、生物信息學(xué)、全基因測(cè)序和DNA微陣列等先進(jìn)技術(shù)，能快速發(fā)現(xiàn)并推斷毒力因子、表面相關(guān)蛋白和可能的候選疫苗。但GAS疫苗的發(fā)展仍然面臨著挑戰(zhàn)性。導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因可歸結(jié)為3個(gè)：①GAS的血清型眾多，而它們之間又很少存在交叉，很難制備針對(duì)所有流行菌株的疫苗；②缺乏合適有效的動(dòng)物模型加以評(píng)價(jià)也是限制疫苗發(fā)展的原因之一；③在GAS疫苗應(yīng)用中，最大的障礙是GAS某些免疫原性強(qiáng)的表面蛋白如M蛋白，與人體組織蛋白存在交叉反應(yīng)，使得疫苗的應(yīng)用面臨著誘發(fā)自身免疫病的風(fēng)險(xiǎn)。20世紀(jì)60年代末期，在使用天然的M蛋白制備疫苗試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)［7］，接種疫苗組較對(duì)照組兒童風(fēng)濕熱的發(fā)病率明顯增加。但是，其他GAS蛋白亞單位疫苗所誘發(fā)的免疫應(yīng)答及預(yù)防作用都不及M蛋白，故到目前為止，M蛋白依然是GAS亞單位疫苗研究的重要的備選蛋白，但顯然對(duì)于GAS疫苗的研究策略有待改善。

3 M蛋白

M蛋白是GAS所有血清型都表達(dá)的一個(gè)重要致病因子。它是GAS細(xì)胞壁的蛋白抗原成分，以二聚體形式存在，由2條多肽鏈復(fù)合成一條α-螺旋卷曲固定在細(xì)胞表面，每條多肽鏈包含多達(dá)4個(gè)重復(fù)區(qū)域（記為A～D）。C-端為高度保守區(qū)，N-端通常是由一個(gè)高變區(qū)A區(qū)和一個(gè)半可變區(qū)B區(qū)構(gòu)成（圖1）。

圖1 M蛋白結(jié)構(gòu)示意圖

M蛋白是GAS抗吞噬作用的主要決定因素?；贛蛋白高變區(qū)的抗原特異性（Lancefield血清學(xué)分類法），已經(jīng)確定的M蛋白血清型至少有150種。M蛋白不同區(qū)段的抗原異質(zhì)性使其呈現(xiàn)出不同的功能，M蛋白的N端高變區(qū)可結(jié)合H因子、H因子樣蛋白和C4bp結(jié)構(gòu)，C-端保守區(qū)也可結(jié)合H因子，這些因子均是經(jīng)典補(bǔ)體途徑的調(diào)節(jié)因子，有助于抗吞噬作用，故GAS通過(guò)M蛋白結(jié)合補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白以干擾補(bǔ)體介導(dǎo)的調(diào)理吞噬作用。另外，M蛋白的許多血清型的B區(qū)都可結(jié)合纖維蛋白原，同樣有助于抗吞噬作用。

4 M蛋白相關(guān)疫苗

由于M蛋白有較好的免疫原性和免疫保護(hù)性，可刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體，成為了疫苗研究的重點(diǎn)。M蛋白的抗原決定簇與人體多種組織抗原存在交叉性，包括心臟、骨骼肌球蛋白、原肌球蛋白、層黏連蛋白和角蛋白等［8］。研究［9］發(fā)現(xiàn)，M蛋白的調(diào)理表位與自身免疫性表位是分隔開(kāi)的，大多數(shù)組織的交叉性表位被定位在B區(qū)、A-B側(cè)翼區(qū)或B-C側(cè)翼區(qū)，而在A區(qū)和C區(qū)中存在著與人體組織交叉反應(yīng)同時(shí)又可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生調(diào)理性抗體的表位。據(jù)此，利用基因重組技術(shù)，M蛋白相關(guān)疫苗的研究有3個(gè)策略：①以多種血清型M蛋白N-端可變區(qū)片段為基礎(chǔ)制備多價(jià)多肽疫苗；②以M蛋白C-端保守區(qū)保護(hù)性表位為基礎(chǔ)制備多價(jià)多肽疫苗；③M蛋白融合其他蛋白的多肽疫苗。

4.1 基于M蛋白N-端的相關(guān)疫苗 M蛋白N-端可變區(qū)具有能夠激發(fā)產(chǎn)生最大殺菌活性抗體的表位，并且?guī)缀鯖](méi)有與人體組織蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)的表位，所以對(duì)于該種疫苗的研究備受追捧。Kotloff等［10］成功重組構(gòu)建了含有M24、M1、M3、M5、M6和M19蛋白血清型N-端片段的基因序列，該疫苗的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，免疫血清中含有相應(yīng)GAS血清型的調(diào)理性抗體，表明該抗體在大多情況下是針對(duì)M蛋白保護(hù)性抗原表位所產(chǎn)生的。該種疫苗的Ⅰ期試驗(yàn)結(jié)果顯示6價(jià)M蛋白血清型片段所誘導(dǎo)的抗體滴度顯著增加，同時(shí)未檢測(cè)到該抗體與人體組織存在交叉反應(yīng)。在此基礎(chǔ)上，由美國(guó)ID Biomedical Corporation公司研制出了26價(jià)多肽疫苗［11］，采用明礬佐劑免疫家兔，可產(chǎn)生特異性血清IgG抗體，在臨床Ⅰ期試驗(yàn)中觀察到該疫苗具有良好的免疫原性及顯示出良好的安全性。美國(guó)2000－2004年5 400例GAS侵襲性感染病例中，分離出的79%的血清型與該26價(jià)疫苗一致［12］，提示該疫苗所包含的表位廣泛分布于該地區(qū)流行的鏈球菌菌株表面，揭示了該疫苗具有應(yīng)用于該地區(qū)臨床的可能性。近日，Dale等［13］基于北美和歐洲時(shí)下流行的GAS血清型成功制備出30價(jià)疫苗，用此疫苗免疫家兔可得到能調(diào)理該30種血清型的抗血清。然而該疫苗的30種血清型僅能覆蓋馬里和南非GAS感染血清型中的40%和59%。由此可見(jiàn)，該種疫苗制備方法也存在弊端，M蛋白血清型眾多，不可能構(gòu)建一種疫苗可包含所有血清型，這就要求根據(jù)某一地區(qū)、某一時(shí)段GAS的流行趨勢(shì)選取相應(yīng)血清型設(shè)計(jì)疫苗，而該種疫苗只能對(duì)當(dāng)?shù)谿AS感染有效，而且一旦流行菌株發(fā)生變化或出現(xiàn)新的菌株則保護(hù)效果大大降低。

4.2 基于M蛋白C-端的相關(guān)疫苗 到目前為止，已經(jīng)有多種方法針對(duì)M蛋白C-端保守區(qū)保護(hù)性表位制備相關(guān)GAS疫苗。第1種方法是合成了4個(gè)涵蓋M6蛋白C-端重復(fù)區(qū)的重疊肽。使用該多肽滴鼻免疫Swiss CD1小鼠后，再用同源M6和異源M14 GAS分離株分別鼻內(nèi)攻擊小鼠［14］，結(jié)果顯示GAS咽部定植均顯著減少。第2種方法是合成了M5蛋白C-端重復(fù)區(qū)的2種多肽。通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的主動(dòng)免疫和被動(dòng)免疫發(fā)現(xiàn)［15］，針對(duì)M5多肽的血清IgG水平升高，但卻無(wú)法在體外誘導(dǎo)調(diào)理吞噬作用。第3種方法是通過(guò)識(shí)別M5蛋白C-端重復(fù)區(qū)內(nèi)的T、B細(xì)胞表位，構(gòu)建了長(zhǎng)度為55個(gè)氨基酸的序列（StreptInCor）。對(duì)BALB／c小鼠皮下接種，StreptInCor和完全弗氏佐劑／不完全弗氏佐劑共同給予，結(jié)果發(fā)現(xiàn)可以誘導(dǎo)高滴度的血清IgG［16］。第4種方法是從M5蛋白C-端篩選出一段20個(gè)氨基酸的多肽（P145），并通過(guò)實(shí)驗(yàn)衍生出2個(gè)序列，即含有M蛋白保守的B細(xì)胞表位及不與人體發(fā)生交叉反應(yīng)的T細(xì)胞表位，分別命名為J8和J14。研究證明，J8和J14可以誘導(dǎo)小鼠血清特異性Ig G和Ig A［17］水平增高。第5種方法是基于M蛋白C-端重復(fù)區(qū)序列制備活疫苗。首先對(duì)CD1小鼠鼻內(nèi)免疫接種表達(dá)M6蛋白C-端重復(fù)序列的牛痘病毒，再進(jìn)行同源M6和異源M14 GAS分離株的鼻內(nèi)攻擊，結(jié)果顯示可顯著減少GAS咽部定植。乳酸乳球菌是一種腸道共生菌群，也被用來(lái)作為活疫苗的載體，攜帶M6蛋白C-端重復(fù)區(qū)編碼的基因序列，對(duì)CD1小鼠行鼻內(nèi)免疫接種該活疫苗后，導(dǎo)致唾液Ig A和血清IgG水平增高［18］。

4.3 M蛋白融合其他蛋白的多肽疫苗 FbaA（an Fn-binding protein expressed on the surface of GAS）是2001年發(fā)現(xiàn)的GAS表面的一種相關(guān)蛋白，具有較好的免疫原性，可誘發(fā)與M蛋白相當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)性免疫應(yīng)答，且Fba A蛋白在不同的GAS血清型中有很高的同源性。將純化的Fba A蛋白和M蛋白分別皮下免疫小鼠，2組的血清Ig G水平相似且Fba A免疫組的保護(hù)效果僅次于M蛋白免疫組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［19－20］。近期該課題組，利用噬菌體肽庫(kù)及單克隆抗體技術(shù)篩選出7個(gè)Fba A優(yōu)勢(shì)表位，通過(guò)PCR技術(shù)將該表位同中國(guó)南方地區(qū)流行的4個(gè)GAS血清型的M蛋白相融合，構(gòu)建出含有7個(gè)Fba A優(yōu)勢(shì)表位和5個(gè)M蛋白片段的GAS疫苗（F7M5）。其中包括的5個(gè)M蛋白片段分別來(lái)自M1、M3、M6、M18的N端和C端的共同保守序列J14，將此多肽疫苗免疫小鼠，結(jié)果顯示小鼠血清Ig G水平相較單純應(yīng)用上述5個(gè)血清型的多肽疫苗顯著升高。攻毒試驗(yàn)顯示F7M5蛋白免疫組的保護(hù)率明顯高于其他對(duì)照組。表明該種融合疫苗誘導(dǎo)了較高的抗體水平和較好的保護(hù)率［21］。

5 展 望

在過(guò)去的幾十年里，對(duì)GAS疫苗的研究取得了很大進(jìn)展，研究者除了研究以M蛋白為基礎(chǔ)的疫苗外，還把目光投到其他可能蛋白上，如C5a肽酶［22］、精氨酸脫亞胺酶［23］、鏈球菌分泌酯酶［24］、鏈球菌血紅素蛋白受體［25］等，但目前仍沒(méi)有安全有效的商用疫苗問(wèn)世?？傊珿AS疫苗研制中的一些影響因素需要綜合考慮，包括GAS血清型的地理分布差異、該抗原包含自身免疫表位的可能性、人類疫苗佐劑的選擇、設(shè)計(jì)合理有效的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型等。就我國(guó)GAS疫苗研究領(lǐng)域而言，GAS相關(guān)流行病學(xué)資料的不足也是影響疫苗研發(fā)制備的因素。

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（本文編輯：趙麗潔）

R378.12

A

1007-3205（2015）01-0103-05

2014－05－15；

2014－07－11

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30901350）；河北省自然基金資助項(xiàng)目（H2012206076）

袁婷（1988－），女，河北廊坊人，河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)碩士研究生，從事感染免疫研究。

*通訊作者。E-mail：macuiqing＠sina.com

10.3969／j.issn.1007-3205.2015.01.041