于新友，李天芝，王金良，唐 娜，李 峰，沈志強(qiáng)，

(1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600)

美洲型和歐洲型PRRSV一步法二重RT-PCR快速檢測(cè)方法的建立和應(yīng)用

于新友1，李天芝1，王金良2，唐 娜2，李 峰2，沈志強(qiáng)1，2

(1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600)

根椐GenBank中已發(fā)表的美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）和歐洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）2種病毒基因序列，分別設(shè)計(jì)2對(duì)引物。在建立2種病毒單項(xiàng)一步法RT-PCR檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上，優(yōu)化一步法二重RT-PCR反應(yīng)條件，建立了2種病毒的一步法二重RT-PCR檢測(cè)方法，用這2對(duì)引物對(duì)同一樣品中的美洲型PRRSV、歐洲型PRRSV核酸模板進(jìn)行一步法二重RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果可同時(shí)擴(kuò)增美洲型PRRSV的265 bp和歐洲型PRRSV的451 bp的特異性片段，而對(duì)其他4種豬病原的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性。敏感性測(cè)定結(jié)果表明，該方法能檢出10 pg的美洲型PRRSV和10 pg的歐洲型PRRSV模板。通過對(duì)175份臨床病料檢測(cè)，將建立的一步法二重RT-PCR技術(shù)和單項(xiàng)一步法RT-PCR方法進(jìn)行對(duì)比驗(yàn)證，結(jié)果顯示，兩者的總符合率為100%。表明建立的一步法二重RT-PCR檢測(cè)方法，具有特異、快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，可用于對(duì)美洲型和歐洲型PRRSV的同時(shí)檢測(cè)和鑒別診斷。

美洲型PRRSV；歐洲型PRRSV；一步法二重RT-PCR；檢測(cè)

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的豬的一種接觸性傳染病，臨床上主要表現(xiàn)為妊娠母豬流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎等繁殖障礙以及各種年齡豬特別是仔豬的嚴(yán)重呼吸道疾病。已被國(guó)際獸疫局列為需要通報(bào)的B類傳染病。PRRS最早于1987年在美國(guó)發(fā)生，荷蘭于1991年首次分離到PRRSV。此后，該病相繼在主要養(yǎng)豬國(guó)家發(fā)生，現(xiàn)已呈世界性分布，給各國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。自1996年我國(guó)分離到首株P(guān)RRSV以來，該病已先后在全國(guó)多個(gè)省市地區(qū)暴發(fā)和流行。按照血清型和遺傳性差異，PRRSV可劃分為歐洲型和美洲型。最初，歐洲型主要流行于歐洲地區(qū)，美洲型主要流行于美洲及亞太地區(qū)。目前，兩種基因型已經(jīng)被鑒定在歐洲、北美和亞洲同時(shí)存在。我國(guó)流行的致病株主要以美洲型PRRSV為主，但是近年來也有歐洲型PRRSV致病的報(bào)道。我國(guó)每年從英國(guó)和法國(guó)等歐洲國(guó)家進(jìn)口種豬占進(jìn)口種豬總數(shù)的40%左右，然而，關(guān)于歐洲型PRRSV的報(bào)道卻很少。為調(diào)查我國(guó)美洲型和歐洲型PRRSV流行情況，同時(shí)減少2個(gè)亞型檢測(cè)的工作量，根據(jù)GenBank上已發(fā)表的美洲型PRRSV N基因、歐洲型PRRSV ORF5的基因序列，分別設(shè)計(jì)了2對(duì)能特異性擴(kuò)增歐洲型和美洲型PRRSV的引物，建立了可同時(shí)檢測(cè)歐洲型和美洲型PRRSV的一步法二重RT-PCR方法，為這2種病毒亞型臨床快速檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查等提供了有效的技術(shù)平臺(tái)。

1??材料和方法

1.1?病毒株與病料

美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、歐洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬瘟病毒（CSFV）、流行性乙型腦炎病毒（JEV）、豬細(xì)小病毒(PPV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)由山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)與動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室保存，臨床檢測(cè)病料為2012年1月—2014年12月采自山東省各地豬場(chǎng)臨床診斷為PRRSV感染的豬的肺臟、脾臟等。

1.2?工具酶及試劑盒

pMD18-T載體、限制性內(nèi)切酶、PCR相關(guān)試劑、DNA Marker、DNA凝膠回收試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司，AxyPrep體液病毒DNA/ RNA小量試劑盒購自愛思進(jìn)生物技術(shù)（杭州）有限公司。

1.3?RT-PCR引物設(shè)計(jì)與合成

用Primer Premier 5.0基因分析軟件，參照GenBank中登錄的美洲型PRRSV N基因序列（AY150564）設(shè)計(jì)1對(duì)引物，擴(kuò)增美洲型PRRSV N基因片段大小為265 bp，引物序列如下：NAF：5′-GCCCCATT TCCCTCTAGCGA-3′，NAR：5′- ACACATTCTCCCAATTCTA ACA-3′。參照GenBank中登錄的歐洲型PRRSV ORF5基因序列（AY588319）設(shè)計(jì)1對(duì)引物，擴(kuò)增歐洲型PRRSV ORF5基因片段大小為451 bp，引物序列如下：EUF：5′-CGGCGACAGCTCGACATA -3′，EUR：5′-CCCTTCGAGG ACGACATG-3′，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4?病毒基因組RNA的提取

按AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒使用說明書提取美洲型和歐洲型PRRSV的RNA，并提取其他幾種病毒的核酸。

1.5??一步法二重RT-PCR擴(kuò)增及條件優(yōu)化

最適退火溫度的確定：分別以50、52、53、54、56、58、60 ℃的退火溫度進(jìn)行梯度一步法二重RT-PCR反應(yīng)，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳觀察，確定最佳退火溫度。

最適引物濃度的確立：在25 ul PCR反應(yīng)體系中分別加入各對(duì)引物，使引物濃度分別為0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1 μmol/L，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳觀察，確定最佳引物濃度，篩選出一步法二重RT-PCR反應(yīng)體系的最佳反應(yīng)模式。

1.6??特異性試驗(yàn)

分別提取美洲型PRRSV、歐洲型PRRSV、CSFV、JEV、PPV、PRV的核酸，用已建立的一步法二重RTPCR方法進(jìn)行擴(kuò)增。

1.7?敏感性試驗(yàn)

分別提取美洲型PRRSV、歐洲型PRRSV的RNA后定量，分別作10倍梯度稀釋提取的病毒基因組RNA，每個(gè)稀釋度取l μL為模板，采用已優(yōu)化的一步法二重RT-PCR反應(yīng)條件分別對(duì)上述不同稀釋度的RNA 進(jìn)行一步法二重RT-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，以檢測(cè)建立的一步法二重RT-PCR的敏感性。

1.8?重復(fù)性試驗(yàn)

用建立的一步法二重RT-PCR檢測(cè)方法分別對(duì)美洲型PRRSV感染的10份陽性樣品，歐洲型PRRSV感染4份陽性樣品及5份陰性樣品重復(fù)檢測(cè)3次，以驗(yàn)證本方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

1.9?臨床樣品的檢測(cè)

取PRRSV疑似送檢病料175份，利用建立的一步法二重RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。

2??結(jié)果與分析

2.1?反應(yīng)條件的優(yōu)化

通過對(duì)美洲型PRRSV、歐洲型PRRSV 2種引物濃度及一步法二重RT-PCR擴(kuò)增溫度、時(shí)間和循環(huán)次數(shù)等的優(yōu)化，最后確定一步法二重RT-PCR中最佳引物濃度分別為美洲型PRRSV 0.5 μmol/L、歐洲型PRRSV 0.5 μmol/L。一步法二重RTPCR的最佳反應(yīng)模式為：95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)，最后 72 ℃ 延伸10 min。

2.2?擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)

將美洲型PRRSV和歐洲型PRRSV的核酸分別進(jìn)行一步法二重RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果能擴(kuò)增出與試驗(yàn)設(shè)計(jì)相符，美洲型PRRSV的265 bp，歐洲型PRRSV的451 bp的特異性片段，而對(duì)照擴(kuò)增不出任何條帶（圖1）。

圖1 單項(xiàng)一步法RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.3?特異性試驗(yàn)

用建立的一步法二重RT-PCR方法對(duì)美洲型PRRSV與歐洲型PRRSV混合樣品、美洲型PRRSV、歐洲型PRRSV、CSFV、JEV、PPV、PRV在相同的條件進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果顯示，美洲型PRRSV和歐洲型PRRSV的RTPCR產(chǎn)物的片段長(zhǎng)度分別為265 bp和451 bp，與預(yù)期大小一致，而CSFV、JEV、PPV、PRV均未擴(kuò)增出片段（圖2），說明本研究建立的一步法二重RTPCR方法特異性強(qiáng)。

2.4?敏感性試驗(yàn)

用紫外分光光度計(jì)測(cè)定的模板RNA濃度，依次做10倍梯度稀釋，每個(gè)稀釋度取1 μL作為模板。結(jié)果顯示用10 pg的美洲型PRRSV和10 pg的歐洲型PRRSV作為模板該一步法二重RTPCR仍然可以擴(kuò)增出特異性條帶（圖3）。

2.5?重復(fù)性試驗(yàn)

經(jīng)過3次重復(fù)操作，結(jié)果一致，表明本研究建立的一步法二重RT-PCR方法是穩(wěn)定可靠的。

圖2 特異性試驗(yàn)

圖3 敏感性試驗(yàn)

2.6?臨床樣品的檢測(cè)

對(duì)175份在山東省不同地區(qū)采集的PRRSV疑似病料，用建立的一步法二重RT-PCR和單項(xiàng)一步法RT-PCR進(jìn)行了檢測(cè)，兩者符合率達(dá)100%，檢出美洲型PRRSV陽性樣品95份，歐洲型PRRSV陽性樣品4份。

3??討論

參照GenBank中登錄的美洲型PRRSV N基因序列（AY150564）和歐洲型PRRSV ORF5基因序列（AY588319），利用Primer Premier5.0分別設(shè)計(jì)1對(duì)引物，通過一步法RTPCR擴(kuò)增出目的基因，分別連接到pMD18-T載體，送樣測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果與模板序列進(jìn)行比對(duì)，其同源性均為100%，本試驗(yàn)確定的一步法二重RT-PCR中最適引物濃度分別為美洲型PRRSV 0.5 μmol/L、歐洲型PRRSV 0.5 μmol/L時(shí)，達(dá)到最佳反應(yīng)效果。反復(fù)優(yōu)化多重PCR的反應(yīng)參數(shù)，尤其要注意PCR反應(yīng)的退火溫度要足夠高，因?yàn)橐徊椒ǘ豏T-PCR反應(yīng)體系中有多對(duì)引物，退火溫度過低往往會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)，提高退火溫度則可有效減少非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的生成，通過反復(fù)摸索條件，所確定的一步法二重RT-PCR中最適退火溫度為54 ℃。特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，本試驗(yàn)所建立的一步法二重RT-PCR檢測(cè)美洲型PRRSV、歐洲型PRRSV的方法分別能夠擴(kuò)增出265 bp和451 bp片段，而對(duì)常見的豬病病毒如CSFV、JEV、PPV、PRV均無擴(kuò)增產(chǎn)物，證明本方法具有很好的特異性。敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)美洲型PRRSV、歐洲型PRRSV的檢測(cè)靈敏度均可以達(dá)到10 pgRNA。

通過對(duì)175份PRRSV疑似病料檢測(cè)結(jié)果顯示，單項(xiàng)一步法RT-PCR與一步法二重RT-PCR檢測(cè)方法結(jié)果的符合率為100%?？梢栽谝环輼悠分型瑫r(shí)檢測(cè)出美洲型PRRSV和歐洲型PRRSV兩種病原體，達(dá)到對(duì)美洲型PRRSV和歐洲型PRRSV的同步診斷，比單項(xiàng)擴(kuò)增減少65%的時(shí)間和1/2的試劑，該法敏感性高、特異性強(qiáng)、快速簡(jiǎn)便、檢測(cè)成本低，適合基層獸醫(yī)工作者使用。為國(guó)內(nèi)美洲型PRRSV和歐洲型PRRSV的鑒別診斷和流行病學(xué)調(diào)查等提供一種簡(jiǎn)單、快速的分子生物學(xué)診斷方法。

略。

2015-01-13）

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(SDAIT-06-011-14)；山東省自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（ZR2014CQ010）

于新友(1983-)，男，漢族，山東菏澤人，助理研究員，碩士，主要從事動(dòng)物傳染病診斷技術(shù)研究。

Email：yuxinyou_2006@126.com