朱俊豐， 桑力軒， 楊芳麗， 李 巖， 翟景波， 高植鵬，鄧芳博， 孫 遜， 王大南， 呂昌龍*

(1.中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 免疫學(xué)教研室，遼寧 沈陽 110122；2.遼寧大學(xué) 生命科學(xué)院，遼寧 沈陽 110036)

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小鼠白細(xì)胞介素33真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及表達(dá)

朱俊豐1,2， 桑力軒1， 楊芳麗1， 李 巖1， 翟景波1， 高植鵬1，鄧芳博2， 孫 遜1， 王大南1， 呂昌龍1*

(1.中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 免疫學(xué)教研室，遼寧 沈陽 110122；2.遼寧大學(xué) 生命科學(xué)院，遼寧 沈陽 110036)

克隆小鼠 IL-33基因構(gòu)建其真核表達(dá)質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞檢測(cè)其表達(dá)。提取C57BL/6小鼠肺組織總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增小鼠 IL-33基因，酶切后插入pcDNATM3.1/myc-HisA構(gòu)建其真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-3.1-IL-33，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，RT-PCR和免疫印跡法(western blotting)檢測(cè)目的基因表達(dá)。結(jié)果顯示，pcDNA3.1-IL-33中插入的片段序列測(cè)定結(jié)果與小鼠IL-33cDNA序列一致，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞后檢測(cè)到相應(yīng)mRNA及蛋白表達(dá)。成功克隆了小鼠IL-33基因cDNA，并構(gòu)建其真核表達(dá)質(zhì)粒。

白細(xì)胞介素33；基因克隆；表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建；真核表達(dá)

白細(xì)胞介素-33(IL-33)是2005年發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子，為IL-1類細(xì)胞因子超家族成員，廣泛存在于多種組織細(xì)胞中，是炎癥反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子之一[1-2]。目前認(rèn)為IL-33具有雙重生物學(xué)功能，即在正常狀態(tài)下存在于細(xì)胞核中，作為轉(zhuǎn)錄抑制因子發(fā)揮作用[3]；細(xì)胞損傷時(shí)釋放到胞外成為一種免疫系統(tǒng)的危險(xiǎn)信號(hào)，與受體ST2結(jié)合，作為細(xì)胞因子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[4]。小鼠的IL-33 cDNA編碼266個(gè)氨基酸, 其相應(yīng)全長蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量為30 kD[5]。有研究表明全長IL-33是參與機(jī)體活動(dòng)的有效形式，剪切后的可溶性IL-33活性下降，主要在血清中出現(xiàn)，可能成為一種疾病標(biāo)記物[6]。但是另有研究發(fā)現(xiàn)，全長 IL-33經(jīng)過中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶和蛋白酶G剪切能夠產(chǎn)生生物活性10倍于全長 IL-33的片段[7]。綜上所述，IL-33的活性形式依然存在爭議。為了進(jìn)一步研究IL-33活性，本文利用基因工程的方法在大腸埃希菌中高效表達(dá)出鼠IL-33成熟蛋白，并對(duì)免疫學(xué)活性進(jìn)行了初步研究, 為深入研究IL-33的免疫學(xué)作用及其分子機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、菌株與質(zhì)粒 C57BL/6小鼠購自中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；大腸埃希菌E.coli-DH5、COS-7細(xì)胞、表達(dá)載體pcDNATM3.1/myc-HisA由本室保存。

1.1.2 試劑 RNAiso Plus、載體連接試劑盒、限制性核酸內(nèi)切酶、PCR試劑、T4DNA連接酶購自TaKaRa公司，DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒購自北京原平皓公司，Trizol、EasyScriptcDNA第一鏈合成試劑盒為全式金公司產(chǎn)品，lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司，DMEM培養(yǎng)基、新生小牛血清、細(xì)胞裂解液、蛋白酶抑制劑購自匯百生物公司?？筂yc的單克隆抗體購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。其他試劑為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank小鼠IL-33序列和pcDNA3.1/myc-HisA載體特性, 按照酶切位點(diǎn)對(duì)側(cè)翼序列的要求設(shè)計(jì)引物并包含相應(yīng)的酶切位點(diǎn) (引物合成由南京金斯瑞生物科技有限公司完成)。IL-33上游引物: AGCAAGCTTGCCACCATGAGACCTAGAATGAAGTAT，含酶切位點(diǎn)HindⅢ；下游引物: AGCTCTAGAGATTTTCGAGA-

GCTTAAAC，含酶切位點(diǎn)XbaⅠ，不含終止密碼子。上游引物中含有Kozak序列。同時(shí)，調(diào)整下游引物使IL-33能融合表達(dá)Myc和HisA標(biāo)簽。

1.2.2 RNA 的提取及RT-PCR 用RNAiso Plus提取C57BL/6小鼠肺組織總RNA，按全式金公司提供的cDNA第一鏈合成說明進(jìn)行反應(yīng)獲得cDNA，隨即進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)獲得IL-33基因編碼序列，反應(yīng)條件: 95 ℃ 5 min，進(jìn)入循環(huán)，94 ℃ 30 s，54 ℃30 s，72 ℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。產(chǎn)物經(jīng)1%溴化乙錠-瓊脂糖凝膠電泳分離分析PCR產(chǎn)物，用DNA回收純化試劑盒回收擴(kuò)增的目的基因。

1.2.3 IL-33cDNA的克隆及測(cè)序 將上述回收片段經(jīng)HindⅢ與XbaⅠ雙酶切，插入上述酶酶切線性化的pcDNATM3.1/myc-HisA載體，連接后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)菌，過夜培養(yǎng)后挑取白色單菌落，小量提取質(zhì)粒 DNA 進(jìn)行酶切鑒定, 命名為 pcDNA3.1-IL-33。送南京金斯瑞生物公司進(jìn)行插入片段序列測(cè)定。

1.2.4 重組質(zhì)粒的細(xì)胞轉(zhuǎn)染與表達(dá) 對(duì)數(shù)生長期COS-7細(xì)胞培養(yǎng)于含血清及雙抗的DMEM培養(yǎng)液中，于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，將3×105個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔板，每孔DMED培養(yǎng)基定容至3 mL，培養(yǎng)24 h后，采用lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑按試劑說明轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-IL-33與空載體，并設(shè)空白對(duì)照，10 h后棄去轉(zhuǎn)染液，換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染后24 h分別收集實(shí)驗(yàn)孔及空載體對(duì)照孔、空白對(duì)照孔的細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞IL-33基因表達(dá)；于轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間用冰冷細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞裂解產(chǎn)物，Western blot法檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞IL-33表達(dá)，檢測(cè)方法按試劑說明進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR擴(kuò)增小鼠IL-33基因

分離小鼠肺組織總RNA，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下可見3條清晰條帶，分別為28S RNA、18S RNA和5S RNA(圖1A), 28S RNA與18S RNA無彌散現(xiàn)象，說明RNA未被降解。總RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行PCR反應(yīng), 將產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳可見一亮帶，大小約801 bp，與IL-33基因片斷預(yù)期大小相符(圖1B)。

2.2 pcDNA3.1-IL-33真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

HindⅢ與XbaⅠ雙酶切后的小鼠肺組織IL-33的PCR產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳回收，與上述酶酶切后的pcDNA3.1/myc-HisA進(jìn)行定向連接，連接后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)菌。抽提質(zhì)粒，行HindⅢ與XbaⅠ雙酶切鑒定，經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果與預(yù)期相符(圖2)。南京金斯瑞生物科技有限公司DNA測(cè)序結(jié)果與IL-33cDNA序列一致。

圖1 小鼠IL-33基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 RT-PCR of IL-33A：Tranzol提取小鼠肺總RNA，M：DL2 000 DNA Marker；1：小鼠肺組織總RNA；2：小鼠肺組織IL-33PCR產(chǎn)物；B：RT-PCR擴(kuò)增小鼠IL-33，M：DL2 000 DNA MarkerA：Total RNA was extracted from mouse lung using Tanszol. M：DL2 000 DNA Marker；1：Total RNA of mice lung； B：Amplify mouse IL-33 cDNA by RT-PCR. M：DL2 000 DNA Marker；2：PCR products of IL-33

圖2 pcDNA3.1-IL-33真核表達(dá)質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果Fig.2 Identification of recombinant plasmidpcDNA3.1-IL-33 byenzyme digestionM：DL2000 DNA Marker；1：pcDNA3.1-IL-33雙酶切；2：pcDNA3.1-IL-33；M′:λ-HindⅢ digest DNA MarkerM：DL2000 DNA Marker；1：pcDNA3.1-IL-33digested with HindⅢand XbaⅠ；2：pcDNA3.1-IL-33；M′:λ-HindⅢ digest DNA Marker

2.3 重組質(zhì)粒在COS-7細(xì)胞中的表達(dá)

分別收集空白對(duì)照、pcDNA3.1-IL-33與空載體轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明, 從重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞中可擴(kuò)增出IL-33基因, 而空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞中未擴(kuò)增出目的條帶(圖3A)，Western blot法證實(shí)pcDNA3.1-IL-33轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后的細(xì)胞裂解產(chǎn)物可檢測(cè)到IL-33，而空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞未檢測(cè)到其表達(dá)(圖3B)。

圖3 重組質(zhì)粒在COS-7細(xì)胞中的表達(dá)結(jié)果Fig.3 Western blot and RT-PCR analysis of IL-33 prokaryotic expressionA：RT-PCR檢測(cè)重組質(zhì)粒在COS-7細(xì)胞中的表達(dá)，M：DL2000 DNA Marker；1：空載體轉(zhuǎn)染引物擴(kuò)增；2：pcDNA3.1-IL-33轉(zhuǎn)染引物擴(kuò)增；3：空白對(duì)照引物擴(kuò)增；B：Western blot檢測(cè)重組質(zhì)粒在COS-7細(xì)胞中的表達(dá)，1：未轉(zhuǎn)染細(xì)胞；2：pcDNA3.1-IL-33轉(zhuǎn)染細(xì)胞；3：空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞A： RT-PCR analysis of IL-33 prokaryotic expression，M：DL2000 DNA Marker；1：COS-7 cell transfected by pcDNATM3.1/myc-HisA；2：COS-7 cell transfected bypcDNA3.1-IL-33；3：COS-7 cell；B:Western blot analysis of IL-33 prokaryotic expression，1：COS-7 cell；2：COS-7 cell transfected bypcDNA3.1-IL-33；3：COS-7 cell transfected bypcDNATM3.1/myc-HisA

3 討 論

IL-33作為新近發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞因子和核因子，在炎癥性腸病中扮演重要角色[8]。有研究認(rèn)為IL-33具有“警報(bào)素”作用，當(dāng)各種原因?qū)е履c上皮細(xì)胞破壞時(shí)，IL-33作為一種危險(xiǎn)信號(hào)從細(xì)胞中釋放，激活肥大細(xì)胞和嗜堿、嗜酸性粒細(xì)胞等，促進(jìn)多種炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，并促進(jìn)初始性T細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化，趨化Th2細(xì)胞到達(dá)病灶，發(fā)揮促炎作用[9-11]。同時(shí)，還有研究發(fā)現(xiàn)IL -33能使炎癥性腸病動(dòng)物模型炎癥程度減輕，癥狀改善，說明IL-33能抑制炎癥進(jìn)展[12-14]?？傊?，目前研究表明IL-33在炎癥性腸病發(fā)病中可能具有雙重作用，其參與炎癥性腸病炎癥進(jìn)展的具體作用機(jī)制仍未完全清楚，且需進(jìn)一步發(fā)掘并探索IL-33是否具有治療價(jià)值。

本研究選擇真核表達(dá)載體pcDNATM3.1/myc-HisA，成功構(gòu)建了pcDNA3.1-IL-33真核表達(dá)質(zhì)粒，通過體外轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞能夠成功表達(dá)帶Myc、 His 標(biāo)簽的小鼠IL-33全長蛋白。下一步可以通過 6×His標(biāo)簽對(duì)IL-33融合蛋白進(jìn)行純化，通過pull-down實(shí)驗(yàn)研究篩選IL-33相互作用蛋白。此外，Myc標(biāo)簽還可以用于免疫共沉淀和免疫印跡實(shí)驗(yàn)，為研究IL-33蛋白在體內(nèi)的作用及信號(hào)通路提供了有力的工具[15]。

雖然本研究已經(jīng)成功構(gòu)建全長IL-33的真核表達(dá)質(zhì)粒，但由于不同大小IL-33的活性及作用一直存在爭議，需要進(jìn)一步克隆不同大小的IL-33序列并構(gòu)建其真核表達(dá)質(zhì)粒，為進(jìn)一步研究IL-33的功能和活性提供工具。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了帶His、Myc雙標(biāo)簽的pcDNA3.1-IL-33真核表達(dá)質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染到COS-7細(xì)胞并在體外成功表達(dá)了帶HisA和Myc雙標(biāo)簽的小鼠IL-33全長蛋白，為下一步研究IL-33在炎癥性腸病的作用及其分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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Construction & Expression of Eukaryotic Expression Plasmid of Mouse IL-33

ZHU Jun-feng1,2, SANG Li-xuan1, YANG Fang-li1, LI Yan1, ZHAI Jing-bo1, GAO Zhi-peng1,DENG Fang-bo2, SUN Xun1, WANG Da-nan1, Lü Chang-long1

(1.Teach. &Res.Div.ofImmunol.,ChinaMed.Uni.,Shenyang110122; 2.Schl.ofLifeSci.,LiaoningUni.,Shenyang110036)

Mouse IL-33 cDNA was cloned and constructed its eukaryotic expression plasmids and transfected into COS-7 cells to determine its expression. Total RNA of the lung of C57BL/6 mouse was extracted and amplified mouse IL-33 cDNA by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). Then the resulting gene fragment was inserted into pcDNATM3.1/myc-HisA vector after digested by restriction enzyme to construct eukaryotic expression plasmid pcDNA-3.1-IL-33. The recombinant plasmid was transfected into COS-7 cells. The expression of target gene was detected by RT-PCR and Western blotting. The inserted DNA sequence in pcDNA3.1-IL-33 was identical to mouse IL-33 cDNA, which was verified correctly by sequencing. The corresponding gene expression was detected in the recombinant plasmid-transfected COS-7 cells. The mouse IL-33 cDNA was successfully cloned and its eukaryotic expression plasmid was constructed.

IL-33; gene cloning; construction of expression plasmid; eukaryotic expression

遼寧省科學(xué)計(jì)劃項(xiàng)目(2011415052-1)

朱俊豐 男，實(shí)驗(yàn)師，博士研究生。研究方向?yàn)轲つっ庖?。Tel: 024-62202232，E-mail: zhujunfeng@lnu.edu.cn

* 通訊作者。教授，博士生導(dǎo)師。研究方向?yàn)轲つっ庖?。Tel: 024-23256666-5345，E-mail: cllu@mail.cmu.edu.cn

2015-04-09；

2015-05-16

Q93-31

A

1005-7021(2015)06-0060-04

10.3969/j.issn.1005-7021.2015.06.011