韓民泳, 陳慧黠, 斯 晗, 劉 洋, 陳亞東

(大連海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023)

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刺參消化道中蛭弧菌類的生物多樣性分析

韓民泳, 陳慧黠*, 斯 晗, 劉 洋, 陳亞東

(大連海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023)

研究了刺參消化道中蛭弧菌類生物多樣性。用刺參腸道內(nèi)容物提取微生物總DNA，分別使用蛭弧菌類生物特異性引物Bd、Bac擴(kuò)增獲得16S rDNA目的片段，連接pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選及陽性克隆篩選，通過核糖體DNA擴(kuò)增片段限制性內(nèi)切酶分析(ARDAR)對陽性克隆進(jìn)行分型，使用HaeⅢ和MspⅠ雙酶切各60個陽性克隆，選取不同ARDAR型的陽性克隆測序，并進(jìn)行生物學(xué)分析。結(jié)果顯示：引物Bd、Bac的16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物分別分離獲得3個和2個差異性序列，各屬于一個類群，分屬于蛭弧菌屬(Bdellovibrio)和噬菌弧菌屬(Bacteriovorax)。這些序列與數(shù)據(jù)庫中相應(yīng)菌株序列的最大相似性均為95.0%，這5個序列的菌株可能為潛在的新種。

蛭弧菌類生物；刺參；腸道；核糖體DNA擴(kuò)增片段限制性內(nèi)切酶分析(ARDRA)；雙酶切；多樣性

蛭弧菌于1962年首次在土壤中被發(fā)現(xiàn)。Snyder等[1]使用“Bdellovibrio-and-like organisms(BALOs, 蛭弧菌及其類似生物)”一詞描述這類細(xì)菌。近年來，國內(nèi)外對蛭弧菌類生物的研究日益增多。研究表明BALOs對常見的水產(chǎn)養(yǎng)殖中主要病原菌具有較強(qiáng)的裂解作用[2-5]，對真核細(xì)胞無不良影響，具有廣闊的應(yīng)用前景[6]。國內(nèi)關(guān)于蛭弧菌多樣性的研究較少，溫崇慶等[7-8]對廣東省湛江市海域多個集中對蝦養(yǎng)殖區(qū)的BALOs多樣性進(jìn)行了系統(tǒng)的研究分析，薛明等[9]對對蝦池中可分離蛭弧菌多樣性進(jìn)行了研究。而其他少量研究則是從動物消化道內(nèi)分離蛭弧菌，用于防病研究[10-11]。在刺參養(yǎng)殖領(lǐng)域?qū)ALOs多樣性的研究鮮見報道，刺參腸道內(nèi)蛭弧菌多樣性的研究將為蛭弧菌的分離、培養(yǎng)、鑒定打下基礎(chǔ)，有助于研究其對刺參疾病的防治作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 刺參購自大連莊河寶發(fā)海珍品養(yǎng)殖廠(暫養(yǎng)于農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)，平均體重10 g。隨機(jī)選取10頭活體刺參，解剖，每頭參取等量腸道內(nèi)容物混合，加入適量無菌生理鹽水，-20 ℃保存。

1.1.2 引物 擴(kuò)增16S rDNA目的條帶使用引物分別為噬菌蛭弧菌特異性引物Bac(Bacteriovorax-specific)：Bac676F(5′-ATTTCCGCATGTAGGGGTA-3′)和Bac1442R(5′-GCCACGGCTTCAGGTAAG-3′)，蛭弧菌特異性引物Bd(Bdellovibrio-specific)：Bd529F(5′-GGTAAGACGAGGGATCCT-3′)和Bd1007R(5′-TCTTCCAGTACATGTCAAG-3′)[12-13]，陽性克隆篩選通用引物M13F(5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′)和M13R(5′-AGCGGATAACAATTTCACACA-3′)(生工生物工程(上海)股份有限公司)。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基；選擇培養(yǎng)基：含100 μL氨芐青霉素(100 g/L)的LB培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 總DNA提取及PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的回收 將刺參腸道內(nèi)容物樣品在4 ℃條件下，5 000 r/min離心10 min，取沉淀用DNA提取試劑盒提取微生物總DNA樣品，1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，獲得的DNA樣品于-20 ℃貯存、備用。采用特異引物Bac和Bd分別對提取的總DNA進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，72 ℃延伸7 min，4 ℃保存，40個循環(huán)。PCR產(chǎn)物使用DNA純化回收試劑盒回收。

1.2.2 PCR產(chǎn)物的質(zhì)粒載體連接和大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化 擴(kuò)增得到的DNA片段克隆到pMD 19-T載體上，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌(E.coli)DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，進(jìn)行菌落通用引物PCR，篩選出陽性克隆。

1.2.3 陽性克隆的ARDRA雙酶切分型 分別各選取60個陽性克隆菌株用限制性內(nèi)切酶HaeⅢ和MspⅠ進(jìn)行ARDRA分析。酶切反應(yīng)體系如下：10 μL酶HaeⅢ反應(yīng)體系包含酶HaeⅢ 0.5 μL，10×M buffer 1 μL，PCR產(chǎn)物8.5 μL；10 μL酶MspⅠ反應(yīng)體系包含酶MspⅠ0.5 μL，10×T buffer 1 μL，BSA 1 μL，PCR產(chǎn)物7.5 μL。37 ℃水浴1 h，2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，根據(jù)大小不同的酶切片段對其進(jìn)行分型，將兩種酶切帶型一致的菌株定為同一種ARDRA型。分別在不同的ARDRA型中隨機(jī)選取1～2個陽性克隆測序驗(yàn)證，由北京六合華大基因有限公司，通過M13引物雙向測序。

1.2.4 序列分析 所得序列使用在線VecScreen(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/vecscreen/)工具去除載體片段，獲得目的基因片段。應(yīng)用BLASTN程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)搜索相似性序列，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。利用Clusta1.81對序列進(jìn)行多重比對，使用MEGA5軟件中的Neighbor-Joining的建樹方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA的提取和特異性擴(kuò)增

腸道中提取的微生物總DNA如圖1所示，條帶清晰，以總DNA為模板，進(jìn)行特異性引物(Bac、Bd)PCR擴(kuò)增，Bac引物擴(kuò)增得到大小約為800 bp的特異性條帶，引物Bd擴(kuò)增得到大小約為500 bp的特異性條帶(圖2)。結(jié)果表明，在刺參消化道中存在數(shù)量眾多的能被引物Bac、Bd特異擴(kuò)增的BALOs。

2.2 陽性克隆檢測

依據(jù)藍(lán)白斑篩選，從兩種引物陽性擴(kuò)增轉(zhuǎn)化平板上分別隨機(jī)挑取單克隆60個，并編號Bac1-60和Bd1-60進(jìn)行陽性驗(yàn)證。結(jié)果表明陽性結(jié)果清晰可見，僅少部分檢測結(jié)果在目標(biāo)區(qū)域沒有條帶出現(xiàn)，為陰性結(jié)果。分別保留陽性克隆菌株用作ARDRA分型。

圖1 刺參消化道內(nèi)容物微生物總DNAFig.1 Total DNA of microorganisms in alimentary canal of A. japonicas1：總DNA；M：Marker(DL2 000)1: Total DNA；M：Marker(DL2 000)

圖2 16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.2 PCR amplification of 16S rDNA1：Bac引物擴(kuò)增產(chǎn)物；M:Marker(DL2 000);2：Bd引物擴(kuò)增產(chǎn)物M:Marker(DL5 000)1: Amplification with primer Bac;M:Marker(DL2 000) 2: Amplification with primer Bd;M:Marker(DL5 000)

2.3 ARDRA分型

對于上述陽性克隆的ARDRA分型如圖3、圖4所示(為部分ARDRA分型圖譜)。肉眼觀測Bac擴(kuò)增產(chǎn)物約有2種明顯不同ARDRA型(類型A、B)及少量差異分型；Bd擴(kuò)增產(chǎn)物約有4種明顯不同ARDRA型(類型a～d)及少量差異分型。分別對引物Bac和Bd擴(kuò)增產(chǎn)物對應(yīng)的陽性克隆選取9和14個送樣測序。

測序結(jié)果經(jīng)過多重序列比對，共獲得5個差異序列，引物Bac和Bd分別獲得2和3個差異性16S rDNA序列。將該序列上傳至GenBank核酸數(shù)據(jù)庫中，Bd擴(kuò)增序列分別獲得接受號為GenBank KP303689～KP303691，Bac擴(kuò)增序列分別獲得接受號為GenBank KP303692、KP303693。如圖5所示，Bac擴(kuò)增產(chǎn)物陽性克隆中，Bac4(KP303693)代表菌株為優(yōu)勢種，ARDRA型(類型B)占總類型的56.0%；Bd擴(kuò)增產(chǎn)物中Bd41(KP303689)代表菌株為優(yōu)勢種，有63.3%(類型a)。

圖3 Bac擴(kuò)增產(chǎn)物部分雙酶切分型凝膠圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis of primer Bac amplified products digested by double enzymes上半部分為Bac擴(kuò)增產(chǎn)物的Hae Ⅲ酶切；下半部分為其Msp Ⅰ酶切；M：Marker(DL2 000)The upper part of the map is the primer Bac amplified products digested by Hae Ⅲ ; the lower part is the products digested by Msp Ⅰ; M: Marker(DL2 000)

圖4 Bd擴(kuò)增產(chǎn)物部分雙酶切分型凝膠圖Fig.4 Agarose gel electrophoresis of primer Bd amplified products digested by double enzymes上半部分為Bd擴(kuò)增產(chǎn)物的Hae Ⅲ酶切；下半部分為其Msp Ⅰ酶切；M：Marker(DL2 000)The upper part of the map is the primer Bd amplified products digested by Hae Ⅲ; the lower part is the products digested by Msp Ⅰ;M: Marker (DL2 000)

圖5 ARDRA型在各60個蛭弧菌16S rDNA重組克隆子中的分布Fig.5 ARDRA distribution in 16S rDNA clones of BALOsA、B為Bac擴(kuò)增產(chǎn)物雙酶切分型類型；a～d為Bd擴(kuò)增產(chǎn)物雙酶切分型類型A、B are ARDRA patterns of primer Bac amplified products; a～d are ARDRA patterns of primer Bd amplified products

2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析(圖6)，分離到的16S rDNA基因序列菌株分屬于兩個類群，其中Bac2(KP303692)和Bac4(KP303693)親緣關(guān)系較近，分布于類群Ⅰ中，隸屬于噬菌弧菌屬(Bacteriovorax)；Bd41(KP303689)、Bd58(KP303690)和Bd39(KP303691)親緣關(guān)系較近，分布于類群Ⅳ中，隸屬于蛭弧菌屬(Bdellovibrio)。同時，上述菌株的序列與各自親緣性最近的菌株的序列同源性最大值均為95.0%，可以認(rèn)為這5個基因序列的菌株可能為潛在的新種。

3 討 論

蛭弧菌類生物的生態(tài)學(xué)研究，以往依賴直接培養(yǎng)的方法，由于微生物分離培養(yǎng)技術(shù)的局限性，通常只能分離那些易于人工培養(yǎng)的微生物，因此限制了其中大多數(shù)不可培養(yǎng)的BALOs的研究。Zheng等[14]利用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)對一個海水樣品中Bacteriovoraxspp.進(jìn)行定量，其結(jié)果顯示比經(jīng)典雙層平板法計數(shù)的結(jié)果高出兩個數(shù)量級。本研究使用特異的16S rDNA克隆文庫序列分析研究刺參消化道中的BALOs的系統(tǒng)多樣性。該方法從類群的水平上分析了消化道BALOs的多樣性及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。

圖6 基于16S rDNA基因序列的BALOs生物系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.6 Phylogenetic tree of intestine BALOs of A. japonicus based on the 16S rDNA gene sequences本研究中的序列用黑色實(shí)心圓圈標(biāo)記；大于50%的置信值顯示在系統(tǒng)進(jìn)化樹的各節(jié)點(diǎn)處；Cluster I：噬菌弧菌屬；Cluster Ⅱ：吞菌弧菌屬；Cluster III：其他；Cluster IV：蛭弧菌屬The clones obtained in the present study are marked with black solid circle; Bootstrap values (>50%) are shown at nodes; Cluster I: Bacteriovorax; Cluster II: Peredibacter; Cluster III: other; Cluster IV: Bdellovibrio

蛭弧菌包括在δ-變形細(xì)菌綱(Deltaproteobacteria)蛭弧菌目(Bdellovibrionales)，目前被分為蛭弧菌科(Bdellovibrionaceae)和噬菌弧菌科(Bacteriovoracaceae)兩個科[15]。本研究從刺參消化道中分離的KP303689～KP303691和KP303692～KP303693分別分布在這兩個科中。噬菌弧菌科(Bacteriovoracaceae)目前包含噬菌弧菌屬(Bacteriovorax)和吞菌弧菌屬(Peredibacter) ，特異性引物分別為Bac和Per。本研究對這兩種引物同時進(jìn)行擴(kuò)增，然而只獲得Bac引物的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，腸道內(nèi)容物中Per的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物并未得到，該產(chǎn)物在養(yǎng)殖水環(huán)境中擴(kuò)增得到(另見報道)。而蛭弧菌科微生物由于耐鹽性較差，目前未從大于5%鹽水中分離到[16]，本研究前期試驗(yàn)未在刺參養(yǎng)殖海水中檢測到該類微生物，溫崇慶等[7-8]也未在海水中檢測到，而本研究從刺參消化道中檢測到蛭弧菌科微生物。另外張志祥[10]、李楠[11]也從鰻鱺等動物腸道內(nèi)容物中分離得到蛭弧菌菌株。說明蛭弧菌科菌株在海洋生物體內(nèi)普遍存在，而在海洋環(huán)境中的分布量較噬菌弧菌科微生物少，而刺參腸道內(nèi)噬菌弧菌科吞菌弧菌屬的微生物相對較少。

本研究表明刺參消化道中存在著由Bacteriovorax和Bdellovibrio兩大類別組成的多樣性的BALOs。此次分離的5個16S rDNA序列的菌株為未報道的新菌株，與各自親緣性最近的菌株序列同源性最大值均為95.0%，可以認(rèn)為這5個基因序列的菌株可能為潛在的新種。由于環(huán)境條件的復(fù)雜性、研究方法的局限性，并且根據(jù)其較強(qiáng)的突變能力推斷[17]，刺參消化道中仍然存在未知的BALOs，其多樣性的研究將在進(jìn)一步工作中逐步完善。當(dāng)前刺參養(yǎng)殖領(lǐng)域病害頻發(fā)，將BALOs作為一種綠色環(huán)保的方式用于預(yù)防和清除養(yǎng)殖環(huán)境中的致病菌顯得尤為重要，本研究工作致力于弄清刺參消化道中蛭弧菌的多樣性及其優(yōu)勢種類，為BALOs作為疾病生物防治工具大規(guī)模應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

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Diversity Analysis ofBdellovibrio-Like Organisms in Spiny Sea Cucumber (Stichopusjaponicus) Intestine

HAN Min-yong, CHEN Hui-xia, SI Han, LIU Yang, CHEN Ya-dong

(KeyLab.ofMaricult. &StockEnhance’tinN.China,DalianOceanUni.,Minist.ofAgric.,Dalian116023)

The diversity ofBdellovibrio-like organisms inside the intestine of spiny sea cucumber (Apostichopusjaponicas) was studied. Total microbial DNA was extracted using intestinal content from the sea cucumber. The purpose fragments of 16S rDNA of BALOs were amplified using primers Bd and Bac respectively and connected to pMD 19-T vector, then transformed intoE.coliDH5 α. The 60 positive clones were selected respectively by blue white screening and verified by PCR detection. The patterns of different clones were determined using amplified ribosomal DNA restriction analysis (ARDRA) with double restriction enzymesHaeⅢ andMspI to cut 60 positive clones, respectively. Then, the positive clones sequence of different ARDAR patterns were selected and carried out biological analysis. The results showed that 3 and 2 different 16S rDNA sequences of primers Bd and Bac amplified products were obtained respectively. They belong to two different clusters ofBdellovibrioandBacteriovoraxrespectively. Comparison of these ssequences to those corresponding sequences in database all had a maximum similarity at 95%. These five sequences’ strains possibly are potential new species.

Bdellovibrio-like organisms; spiny sea cucumber (Apostichopusjaponicus); intestine; amplified ribosomal DNA restriction analysis (ARDRA); double enzyme digestion; diversity

遼寧省教育廳計劃項(xiàng)目(L2012255)

韓民泳 男，碩士研究生。研究方向?yàn)楹Ｑ笪⑸镅芯?。E-mail: minyhan@163.com

* 通訊作者。女，講師，碩士生導(dǎo)師。研究方向?yàn)楹Ｑ笊镅芯俊-mail: chenhuixia@dlou.edu.cn

2015-06-02；

2015-07-08

Q78；Q93

A

1005-7021(2015)06-0044-05

10.3969/j.issn.1005-7021.2015.06.008