費維成， 陳曉琳， 任 沖， 邢育文， 戴 薇， 韓國民

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 合肥 230036)

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高效除藻真菌云芝F21a遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立

費維成， 陳曉琳， 任 沖， 邢育文， 戴 薇， 韓國民*

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 合肥 230036)

以藍藻高效降解菌云芝F21a (Trametesversicolor)為出發(fā)菌株，對其原生質(zhì)體的制備、再生條件及限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化進行研究。結(jié)果表明：在PDA培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)4 d的菌絲最適于原生質(zhì)體制備； 0.6 mol/L KCl為最適等滲條件；30 ℃混合酶液(2% cellulase+2% snailase+2% lywallzyme)酶解4 h，原生質(zhì)體產(chǎn)量達到2.375×107個/mL，此時再生率達0.74%。采用限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)技術(shù)可將質(zhì)粒pAN7-1導(dǎo)入云芝F21a的原生質(zhì)體，在含有150 μg/mL 潮霉素的RM培養(yǎng)基中能夠獲得再生菌株，PCR驗證初步表明該質(zhì)粒已經(jīng)轉(zhuǎn)入云芝F21a原生質(zhì)體。連續(xù)傳代轉(zhuǎn)接顯示，陽性轉(zhuǎn)基因菌株外源基因可以穩(wěn)定表達，本結(jié)果為研究真菌高效消除藍藻的分子機制奠定基礎(chǔ)。

云芝F21a；原生質(zhì)體制備；條件優(yōu)化；限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)；遺傳轉(zhuǎn)化

近年來由于富含氮磷的農(nóng)藥、工業(yè)廢水和生活污水的大量使用和排放，導(dǎo)致我國許多地區(qū)和大型湖泊出現(xiàn)了水華的藍藻爆發(fā)性生長[1]。藍藻的爆發(fā)會嚴重影響水源水質(zhì)，使水生生物窒息死亡，而且藍藻能分泌毒素，直接危害人類的生存與健康[2]。利用生物學(xué)方法治理藍藻，特別是利用微生物控藻法與物理化學(xué)方法相比，具有方法簡單、不易引起污染等優(yōu)點，已成為藍藻水華治理研究的熱點[3-4]。然而現(xiàn)有的生物學(xué)方法，如病毒由于易發(fā)生突變使其作為控制藻華的應(yīng)用前景變得撲朔迷離；溶藻細菌的大量繁殖會嚴重影響水體的透明度；釋放抗生素除藻真菌會對其他水生生物帶來許多不利影響；寄生真菌由于大規(guī)模的培養(yǎng)比較困難也限制了其實際應(yīng)用[5-6]。目前，生物除藻研究多集中于發(fā)掘具有優(yōu)良特性的溶藻細菌菌株及噬藻病毒[7]方面，而對利用真菌控藻關(guān)注較少。最近發(fā)現(xiàn)了一種新的真菌去除藍藻的模式：真菌冷杉附毛孔菌BG-1302 (Trichaptumabietinum)菌絲體將活體藻細胞包裹后，活體藻細胞完全被分解，藻溶液最終變?yōu)橥该鞒吻?。本課題組負責人前期通過對大量不同種類的真菌進行除藻能力分析，篩選獲得了1株效率更高的相同除藻模式的真菌——云芝F21a(T.versicolor)，在相似條件下30 h內(nèi)可徹底分解所有供試的藍藻細胞，處理后的水體變?yōu)槌吻逋该鱗8]。然而，對此新型除藻方法的研究主要是表面影響因素有關(guān)的研究，而此新型除藻方法的分子機制尚不明確。為進行此方面研究，建立高效降解活體藍藻的真菌云芝F21a遺傳轉(zhuǎn)化體系是進一步驗證除藻分子機制的基礎(chǔ)。本研究以高效降解活體藍藻的真菌云芝F21a為供試菌，對其原生質(zhì)體的制備與轉(zhuǎn)化進行研究。通過研究酶種類、菌齡、酶解時間、滲透壓穩(wěn)定劑、滲透壓等因素優(yōu)化了原生質(zhì)體形成條件；采用原生質(zhì)體介導(dǎo)真菌遺傳轉(zhuǎn)化方法，通過限制性內(nèi)切酶的方法將pAN7-1轉(zhuǎn)入云芝F21a原生質(zhì)體并進行轉(zhuǎn)基因驗證分析，初步確定轉(zhuǎn)化云芝F21a成功。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 云芝F21a和表達載體 pAN7-1保存于安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實驗室。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①PDA培養(yǎng)基(g/L)：馬鈴薯 200，葡萄糖20，瓊脂 20；②PDB培養(yǎng)基(g/L)：馬鈴薯 200，葡萄糖20； ③RM再生培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖 20 g/L，瓊脂 20 g/L，KH2PO43 g/L，MgSO41.5 g/L，維生素B10.03 g/L，KCl 0.55 mol/L，酵母膏10 g/L。

1.1.3 主要試劑及配制方法 纖維素酶、蝸牛酶購自合肥博美生物公司；溶壁酶購自廣東省微生物研究所；潮霉素B(Hygromycin B，HmB)，Taq酶及PCR擴增試劑，SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒，引物合成均購自上海生物工程公司，Hind Ⅲ 購自TaKaRa 生物公司，其他常規(guī)試劑均為分析純。所有的酶液均用0.6 mol/L KCl配制，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，保存于-20 ℃冰箱中備用。

1.2 方法

1.2.1 云芝F21a原生質(zhì)體的制備與再生 用接種針挑取少量邊緣菌絲接種于PDA培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)5 d，用打孔器取菌落邊緣直徑5 mm菌絲塊接種于100 mL PDB培養(yǎng)基，28 ℃、150 r/min 搖床培養(yǎng) 4 d ，收集 0.2 g 濕菌絲，無菌水洗滌2次后，0.6 mol/L KCl穩(wěn)滲劑洗滌3次，加入混合酶液(2% cellulase+2% snailase+2% lywallzyme)，28 ℃、80 r/min 搖床酶解4 h。原生質(zhì)體用滅菌的4層擦鏡紙包裹注射器抽濾2次，濾液經(jīng)4 000 r/min離心10 min，棄2/3上清，顯微鏡下觀察原生質(zhì)體形態(tài)并計數(shù)原生質(zhì)體數(shù)量[9]。取100 μL原生質(zhì)體涂布于RM再生培養(yǎng)基上，28 ℃倒置培養(yǎng)7～10 d后統(tǒng)計再生菌落數(shù)，以不含穩(wěn)滲劑的低滲培養(yǎng)基為對照，計算再生率。

X：再生率；A：原生質(zhì)體數(shù)量；B：再生的菌落數(shù)；C：對照組的菌落數(shù)量。

1.2.2 不同因素對云芝F21a原生質(zhì)體制備的影響 為了獲得更高的原生質(zhì)體得率，通過改變某些制備過程中的單一因素來優(yōu)化原生質(zhì)體制備條件。分別測試了單一種類分解酶及混合酶解體系、不同菌齡菌絲、不同穩(wěn)滲劑、穩(wěn)滲劑濃度、酶解時間等條件來優(yōu)化制備F21a原生質(zhì)體的得率，重復(fù)3次，以確定最適條件。顯微鏡下觀察原生質(zhì)體形態(tài)并用血球計數(shù)板計數(shù)原生質(zhì)體數(shù)量。

1.2.3 限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化 ①云芝F21a菌絲體對潮霉素的敏感性實驗：將培養(yǎng)5 d的云芝F21a接種到含有0～200 μg/mL潮霉素B的PDA平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)7 d后觀察菌落生長情況，確定最佳的抑制供試菌生長的潮霉素濃度。②pAN7-1質(zhì)粒的提取及線性化：將保藏的 pAN7-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)中進行轉(zhuǎn)化實驗，待長出轉(zhuǎn)化子后37 ℃搖菌，用SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒提取pAN7-1質(zhì)粒，將獲得的pAN7-1質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ于37 ℃酶切4 h，整個酶切在20 μL的反應(yīng)體系中進行[10]。③原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化：原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化參考文獻[11]，用0.6 mol/L KCl穩(wěn)滲劑懸浮制備好的云芝F21a原生質(zhì)體，離心收集。再用STC(sorbitol 0.55 mol/L，10 mmol/L Tris-HCl pH 7.0，10 mmol/L CaCl2)沖洗2遍，用等滲液STC調(diào)整原生質(zhì)體濃度為5×107個/mL左右，分成150 μL/mL每管。每管加入20 μg線性化質(zhì)粒和30 U限制性內(nèi)切酶HindⅢ，冰浴30 min。逐滴加入1 mL PTC(PEG4000 40%，25 mmol/L Tris-HCl pH 7.5，25 mmol/L CaCl2)，冰浴20 min，取出后室溫放置20 min。取100 μL轉(zhuǎn)化液加入10 mL 1.0%瓊脂的RM培養(yǎng)基中，混合后倒入平板，再次倒入10 mL 2.0%瓊脂的潮霉素 B 150 μg/mL RM培養(yǎng)基。28 ℃培養(yǎng)10～15 d，即可長出轉(zhuǎn)化子，連續(xù)轉(zhuǎn)接幾次后用于PCR驗證[12]。

1.2.4 轉(zhuǎn)化子驗證 隨機取性狀穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子，利用CTAB法[7]提取轉(zhuǎn)化子和對照未轉(zhuǎn)化云芝F21a的總DNA。針對pAN7-1質(zhì)粒的潮霉素hph基因片段設(shè)計引物，上游引物5′-GATTTGTGTACGCCCGACAG-3′，下游引物5′-CGCAAGGAATCGGTCAATAC-3′。引物擴增片段大小為500 bp左右。PCR程序設(shè)計如下：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)拍照觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 云芝F21a原生質(zhì)體的形態(tài)

云芝F21a酶解的過程如圖1A所示，可以觀察到有些菌絲正在酶解，菌絲剛被分解成節(jié)狀的長方形細胞，菌絲尖端可見開始形成的原生質(zhì)體，而有些真菌的菌絲已經(jīng)完全酶解產(chǎn)生許多單個球形的原生質(zhì)體。圖1B為用4層擦鏡紙過濾后用血球計數(shù)板記錄原生質(zhì)體的放大640倍的圖片，可以清晰地看到云芝F21a的球形原生質(zhì)體。

圖1 云芝F21a原生質(zhì)體的制備Fig.1 The preparation of Trametes versicolor F21a protoplast A：酶解1 h的酶液顯微鏡觀察；B：酶解4 h酶液的顯微鏡觀察A：microscopic examination of enzymolysis(1 h)；B: microscopic examination of enzymolysis(4 h)

2.2 酶種類對原生質(zhì)體產(chǎn)率的影響

不同的真菌細胞壁成分差異較大，適合的酶對原生質(zhì)體的制備得率有重要的影響。本研究分別利用單一酶和復(fù)合酶酶解云芝F21a菌絲體，從表1可以看出復(fù)合酶酶解獲得的原生質(zhì)體高于單一酶酶解的產(chǎn)量。不同種類的單一酶酶解原生質(zhì)體產(chǎn)率也有很大區(qū)別，溶壁酶的產(chǎn)量顯著高于纖維素酶和蝸牛酶(P<0.01)。

表1 不同酶對云芝F21a原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

Table 1 Effect of different enzymes on the protoplast yield

ofTrametesversicolorF21a

酶原生質(zhì)體產(chǎn)量/(1×107個·mL-1)2%cellulase0.2502%snailase0.2002%lywallzyme2.1002%cellulase+2%snailase+2%lywallzyme2.375

2.3 菌齡對原生質(zhì)體制備的影響

不同培養(yǎng)時期的菌齡原生質(zhì)體的產(chǎn)率不同，從圖2可以看出云芝F21a在生長到4 h時用于原生質(zhì)體制備，酶解產(chǎn)生的原生質(zhì)體最多。

圖2 菌齡對原生質(zhì)體制備的影響Fig.2 Effect of mycelial age on protoplast yield

2.4 穩(wěn)滲劑種類對原生質(zhì)體制備的影響

不同種類的穩(wěn)滲劑對原生質(zhì)體制備的影響很大，適合的穩(wěn)滲劑對原生質(zhì)體的產(chǎn)量起到很重要的作用。參考其他課題組研究，使用0.7 mol/L的濃度比較幾種穩(wěn)定劑對云芝F21a原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響。由圖3可以明顯地看出氯化鉀作為穩(wěn)滲劑可以產(chǎn)生更多的原生質(zhì)體，硫酸鎂次之，蔗糖、山梨醇和葡萄糖相對較少。

2.5 穩(wěn)滲劑濃度對原生質(zhì)體制備的影響

滲透壓過大或過小都會影響原生質(zhì)體的產(chǎn)量，過大會使原生質(zhì)體破裂，過小不利于原生質(zhì)體的釋放且產(chǎn)生的原生質(zhì)體偏小。由圖4可以看出氯化鉀的濃度為0.6 mol/L時原生質(zhì)體的產(chǎn)量最高，此時制備的原生質(zhì)體形態(tài)也最好。

圖4 滲透壓濃度對云芝原生質(zhì)體的影響Fig.4 Effect of different concentration of KCl on protoplast yield

2.6 酶解時間對原生質(zhì)體制備的影響

酶解時間不宜過長或過短，過長酶液會破壞原生質(zhì)體膜，過短則酶解不完全而得不到原生質(zhì)體。由圖5可以看出酶解4 h最好，此時產(chǎn)量最高，達到2.375×107個/mL。

圖5 酶解時間對云芝原生質(zhì)體的影響Fig.5 Effect of different enzymatic hydrolysis time on protoplast yield

2.7 原生質(zhì)體的再生及轉(zhuǎn)化子驗證

利用RM培養(yǎng)基可以獲得大量的再生菌落，如圖6A所示，云芝F21a原生質(zhì)體再生率可達0.74%。再生菌落轉(zhuǎn)接3代后的菌落形態(tài)已經(jīng)完全變成正常菌落形態(tài)(圖6B)。

圖6 云芝F21a的再生菌落Fig.6 The regeneration colonies of Trametes versicolor F21a A：轉(zhuǎn)化子；B：轉(zhuǎn)化子連續(xù)轉(zhuǎn)接3代A：transformant；B：three consecutive generations of transformant

云芝F21a菌絲體在150 μg/mL潮霉素B的PDA平板上出現(xiàn)抑制現(xiàn)象，因此確定150 μg/mL潮霉素B為最適轉(zhuǎn)化子篩選濃度。采用150 μg/mL 潮霉素B濃度篩選云芝F21a原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化子，獲得了幾個再生菌落，將這幾個可能的再生轉(zhuǎn)基因菌落連續(xù)轉(zhuǎn)接至少3次。為了初步檢測pAN7-1質(zhì)粒是否轉(zhuǎn)入云芝F21a原生質(zhì)體中，挑選抗性菌落提取其總DNA，進行PCR擴增驗證。有2個轉(zhuǎn)化子(泳道5、6)在500 bp 左右擴增出明顯的條帶，與陽性對照擴增的大小相同(與預(yù)期507 bp 的片段大小相符)，而陰性對照未轉(zhuǎn)化的云芝則未擴增出任何條帶(圖7)。初步表明pAN7-1質(zhì)粒DNA已經(jīng)轉(zhuǎn)入到云芝F21a原生質(zhì)體中，獲得轉(zhuǎn)基因菌落。

圖7 轉(zhuǎn)化子PCR驗證Fig.7 Analysis of transformants by PCR

M：DL2000 Maker；1：質(zhì)粒pAN7-1作為陽性對照；2：未轉(zhuǎn)化的云芝F21a作為陰性對照；3～7：隨機挑選的轉(zhuǎn)化子

M：DL2000 Maker；1：Plasmid pAN7-1 as the positive control;2：UntransformedTrametesversicolorF21-a total DNA as the negative control; 3～7： Random selected transformants

3 討 論

利用真菌菌絲體將活體藻細胞包裹后并將其完全分解不但是一種新型的真菌-藍藻相互作用，具有一定的理論意義，而且具有潛在的藍藻治理應(yīng)用價值。對于這種新型真菌除藻的分子機理研究報道很少，一個主要的原因是該菌遺傳轉(zhuǎn)化體系尚未建成，而成功的噬藻真菌轉(zhuǎn)化技術(shù)在分子機理研究過程中將發(fā)揮重要作用。

高質(zhì)量制備原生質(zhì)體是轉(zhuǎn)化技術(shù)的前提和基礎(chǔ)。生長時間較短的幼嫩菌絲最適于原生質(zhì)體的制備，本研究以生長4 d的真菌菌絲最為合適，這與張鵬等研究杏鮑菇原生質(zhì)體相近[13]。不同種或者同一種不同分布區(qū)域菌體的細胞壁結(jié)構(gòu)存在差異，用酶法破壁制取原生質(zhì)體，需要尋找合適的酶系統(tǒng)?，F(xiàn)已有多種破除真菌細胞壁的酶類，一般用混合酶類比單一酶效果好，本研究也是混合酶的效果最好。混合酶酶解后的原生質(zhì)體更利于轉(zhuǎn)化實驗，原因在于不同酶之間存在作用的互補能夠更好的酶解細胞[14]。由于酶本身往往含有一些對原生質(zhì)體有害酶類如過氧化物酶、核糖核酸酶等，酶解時間過長可能會破壞原生質(zhì)體細胞膜。原生質(zhì)體對滲透壓非常敏感，合適濃度的滲透壓穩(wěn)定劑對原生質(zhì)體的制備起著重要作用。常用的滲透壓穩(wěn)滲劑有KCl、NaCl、CaCl2、MgSO4、蔗糖、山梨醇等，本研究云芝F21a以KCl最為適合，這與一般絲狀真菌以無機鹽作為穩(wěn)定劑比較適宜一致[15]。在原生質(zhì)體制備中，不僅要考慮原生質(zhì)體的數(shù)量，更重要的是原生質(zhì)體的產(chǎn)量，即原生質(zhì)體的活力和再生率[11]。但原生質(zhì)體的再生率也受再生條件如穩(wěn)定劑的種類、濃度以及再生培養(yǎng)基各種營養(yǎng)成分的影響。真菌的再生培養(yǎng)基中常常補加酵母膏、蛋白胨、糖類或氨基酸等作為營養(yǎng)因子，這些物質(zhì)可作為細胞壁合成的前體物質(zhì)，也可能通過代謝轉(zhuǎn)化成細胞壁的前體物質(zhì)或起到促進代謝，加速細胞壁合成的作用。而且許多研究發(fā)現(xiàn)Ca2+、Mg2+的存在可以顯著提高原生質(zhì)體的再生率[16]。故本實驗的RM培養(yǎng)基中都包含了這些對原生質(zhì)體再生有很大影響的營養(yǎng)因子，也取得了較好的再生效果。

限制酶介導(dǎo)的插入突變機理尚不十分清楚。有研究認為可能是在轉(zhuǎn)化過程中，限制性酶和線性化質(zhì)粒DNA一起進入細胞中，真菌染色體DNA的相應(yīng)限制性酶位點被切開，盡管大多數(shù)切點沒有整合外源DNA而重新連接，但也有可能外源DNA片段的粘性末端與染色體DNA的粘性末端連接后插入到染色體DNA某一酶切位點形成轉(zhuǎn)化子。外源DNA帶有抗性標記基因，通過培養(yǎng)基中加入的相對抗生素對轉(zhuǎn)化子進行篩選及分子生物學(xué)驗證即可獲得轉(zhuǎn)基因菌株[17]。相對于其他幾種轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，REMI提高了轉(zhuǎn)化效率、增加了單拷貝插入的幾率，能夠通過酶切與PCR等技術(shù)快速分離被標簽的目的基因。但REMI也存在一些缺點，如大約30%～50%轉(zhuǎn)化子不是由DNA轉(zhuǎn)化子引起的，這給進一步分離基因帶來困難，造成基因的誤譯。

絲狀真菌的轉(zhuǎn)化大多數(shù)采用帶潮霉素抗性標記的質(zhì)粒(如pCBl003、pAN7-1、pV2等)[18]。pAN7-1中含有來自構(gòu)巢曲霉gpdA基因的啟動子和潮霉素hph基因，本研究也采用此質(zhì)粒用于云芝F21a的遺傳轉(zhuǎn)化。研究結(jié)果也顯示pAN7-1中構(gòu)巢曲霉gpdA啟動子驅(qū)動的潮霉素hph基因能夠在云芝F21a中表達，并且構(gòu)成云芝F21a轉(zhuǎn)化的一個較為理想的抗性選擇性標記。以該hph基因標記設(shè)計PCR驗證引物可以進行轉(zhuǎn)化子篩選，而以來自構(gòu)巢曲霉的啟動子序列設(shè)計引物一般不適合用于篩選云芝轉(zhuǎn)化子。這是由于構(gòu)巢曲霉與云芝同源性較高，利用gpdA啟動子設(shè)計引物需要首先驗證其在未轉(zhuǎn)化云芝中的擴增情況。本文經(jīng)過連續(xù)傳代3代以上后經(jīng)PCR驗證，初步表明pAN7-1可以導(dǎo)入到云芝F21a原生質(zhì)體中并成功再生菌落，高效噬藻真菌云芝F21a的轉(zhuǎn)化成功為進一步研究該新型真菌-藍藻相互作用奠定基礎(chǔ)。

[1] 李大命，孔繁翔，于洋，等．太湖藍藻水華期間水體和底泥中產(chǎn)毒微囊藻種群豐度研究[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2011，31(2)：292-298．

[2] Hudnell HK.The state of US freshwater harmful alglal blooms assessments,policy and legislation[J]．Toxicon，2011，55(5)：1024-1034．

[3] Imai I,Kimura S.Resistance of the fish-killing dinoflagellateCochlodiniumpolykrikoidesagainst algicidal bacteria isolated from the coastal sea of Japan[J]．Harmful Algae，2008，7(3)：360-367．

[4] Keawtawee T,Fukami K, Songsangjinda,et al.Isolation and characterization of Noctiluca-killing bacteria from a shrimp aquaculture pond in Thailand[J]．Fisheries Science，2011,77(4)：657-664．

[5] Lee YK,Ahn CY,Kim HS,et al.Cyanobactericidal effect ofRhodococcussp. Isolated from eutrophic lake onMicrocystissp.[J]．Biotechnology Letters，2010，32(11)：1673-1678．

[6] Wang Q,Su M.F,Zhu W.Q,et al.Growth inhibition ofMicrocystisaeruginosaby white-rot fungusLophariaspadicea[J]．Water Science and Technology，2010，62(2)：317-323．

[7] Paul C,Pohnert G.Interactions of the Algicidal Bacterium Kordia with Diatoms:Regulated Protease Excretion for Specific Algal Lysis[J]．PLoSONE，2011，6(6)：e21032．

[8] Jia Y,Han GM,Wang CY,et al.The efficacy and mechanisms of fungal suppression of freshwater harmful algal bloom species[J]．Journal of Hazardous Materials，2010，183(1-3)：176-181．

[9] 劉莉，肖招燕，郭麗瓊，等．PEG介導(dǎo)的猴頭菌遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立[J]. 菌物學(xué)報,2014,33(1):121-128．

[10]Lau S K P, Chow W N, Wong A Y P, et al. Identification of microRNA-like RNAs in mycelial and yeast phases of the thermal dimorphic fungusPenicilliummarneffei[J]．PLoS neglected tropical diseases，2013，7(8)：e2398．

[11]Li C, Yang J, Zhou W, et al. A spindle pole antigen gene MoSPA2 is important for polar cell growth of vegetative hyphae and conidia, but is dispensable for pathogenicity inMagnaportheoryzae[J]．Current genetics，2014：1-9．

[12]Gruber S,Seidl-Seiboth,V Self versus non-self:fungal cell wall degradation inTrichoderma[J]．Microbiology，2012，158：26-34．

[13]張鵬，龔玲鳳，莊衛(wèi)東，等．杏鮑菇原生質(zhì)體制備條件初探[J].中國農(nóng)學(xué)通報, 2013, 29(31): 91-95.

[14]Wubie A J, Hu Y, Li W, et al. Factors Analysis in Protoplast Isolation and Regeneration from a Chalkbrood Fungus, Ascosphaera apis[J]. International Journal of Agriculture and Biology，2014，16(1)：89-96．

[15]周慶新，陳靜，于愷，等．疏綿狀嗜熱絲孢菌原生質(zhì)體的制備與再生[J]．菌物研究，2006，4：1-5．

[16]賈永峰，梁劍光，王永紅，等．鹽霉素產(chǎn)生菌原生質(zhì)體的制備與再生[J]．中國抗生素雜志, 2014, 39(3): 198-203.

[17]Kim JE,Myong K,Shim WB,et al. Functional characterization of aeetylglutamate synthase and phosphofibosylamine-glyeine ligase genes inGibberellazeae[J]．Curr Genet,2006,51： 99-108．

Establishment of Genetic Transformation System of High Effective Algicidal fungusTrametesversicolorF21a

FEI Wei-cheng, CHEN Xiao-lin, REN Chong, XING Yu-wen, DAI Wei, HAN Guo-min

(Schl.ofLifeSci.,AnhuiAgric.Uni.,Hefei230036)

Cyanobacteria high-degrading fungusTrametesversicolorF21a as a starting strain was studied for its protoplasts preparation, regeneration conditions, and restriction endonuclease mediated genetic transformation. The results showed that the fungal mycelia cultured on the PDA medium at 28 ℃ for 4 days is the most suitable for protoplast preparation; 0.6 mol/L KCl was the optimal isotonic conditions for the protoplasts; 30 ℃ mixed enzyme solution (2% cellulase + 2% helicase + 2% cell-wall-lysozyme) zymolyzed for 4 hours. The protoplast production reached as high as 2.375×107/mL with the regeneration rate as high as 0.74%. The plasmid pAN7-1 could be introduced intoT.versicolorF21a protoplasts using restriction endonuclease-mediated technology, could be verified by PCR. Continuous transfer of the mycelia indicated that the exogenous gene could be stable expression in the positive strains. The results of this study supplied a good foundation for elucidation the molecular mechanism of the algicidal fungi.

TrametesversicolorF21a; protoplast preparation; condition optimization; restriction endonuclease-mediation; genetic transformation

國家自然科學(xué)基金項目(51309003)；教育部博士點基金項目(20133418120003)

費維成 男，碩士。研究方向為環(huán)境微生物。E-mail：15856962718@163.com

* 通訊作者。男，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師。研究方向為環(huán)境微生物。 E-mail：guominhan@ahau.edu.cn

2014-08-28；

2014-10-24

Q933

A

1005-7021(2015)06-0010-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2015.06.002