李勝軍， 張曉清， 尉 冰， 張 荻， 呂昌龍

(1. 中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 免疫學(xué)教研室，遼寧 沈陽 110122；2. 中國醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院 口腔修復(fù)學(xué)教研室 遼寧 沈陽 110001)

?

金黃色葡萄球菌tst-1基因敲除菌株的構(gòu)建

李勝軍1， 張曉清1， 尉 冰1， 張 荻2， 呂昌龍1

(1. 中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 免疫學(xué)教研室，遼寧 沈陽 110122；2. 中國醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院 口腔修復(fù)學(xué)教研室 遼寧 沈陽 110001)

抽提金黃色葡萄球菌834菌株的基因組DNA，PCR克隆擴增tst-1及tst-1的上、下游基因，通過將tst-1上、下游基因分別重組到載體質(zhì)粒pAULA中,形成同源重組質(zhì)粒pAULA-Δtst-1，將pAULA-Δtst-1電轉(zhuǎn)入細菌內(nèi)，進行同源重組，以PCR、Western blot鑒定tst-1基因敲除菌株無tst-1基因片段，且無TSST-1蛋白表達，表明已成功構(gòu)建金黃色葡萄球菌tst-1基因的敲除菌株。

金黃色葡萄球菌；tst-1；基因敲除

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，SA)是人類的主要致病菌[1]，可引起各種類型的化膿性感染，如蜂窩組織炎、肺炎、骨髓炎、感染性心內(nèi)膜炎、敗血癥、中毒性休克綜合征、腸炎等[2-3]。 金黃色葡萄球菌可產(chǎn)生多種與致病力有關(guān)的毒素，如腸毒素(enterotoxin)、毒性休克綜合征毒素I(toxic shock syndrome toxin I，TSST-1)、葡萄球菌溶血素(staphylolysin)等[4]。TSST-1是由噬菌體I群金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的超抗原外毒素，屬于致熱原性超抗原家族，分子量約22 ku[5-6]。TSST-1能引起中毒性休克綜合征(toxic shock syndrome，TSS)，導(dǎo)致患者發(fā)熱、低血壓、多器官衰竭，有必要加深對TSST-1在SA感染中的致病機理的了解。本研究提取金黃色葡萄球菌的基因組，以PCR方法擴增TSST-1編碼基因tst-1及其上游基因SAB0359、下游基因SAB0361，構(gòu)建基因敲除質(zhì)粒，進而以同源重組方法構(gòu)建金黃色葡萄球菌834菌株的tst-1敲除菌株，以研究金黃色葡萄球菌的致病機制及TSST-1的功能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 8周齡的雌性C57BL/6小鼠20只(遼寧長生生物技術(shù)有限公司，動物許可證號：SCXK遼2010-0001)，隨機分為金黃色葡萄球菌834菌株組和金黃色葡萄球菌834菌株的tst-1敲除菌株組，每組10只。

1.1.2 菌株、質(zhì)粒及培養(yǎng)基 金黃色葡萄球菌834標準株(SA 834), 大腸埃希菌DH5α菌株， pCRII質(zhì)粒、pAULA質(zhì)粒(中國醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室)。TSB (Tryptic Soy broth) 培養(yǎng)基、LB (Luria-Bertani)培養(yǎng)基 (BD 公司)。

1.1.3 實驗試劑BamHI、KpnI、SalI (限制性內(nèi)切酶，TaKaRa公司)，DM2000、DM10000(DNA Marker，北京康為世紀生物科技有限公司)，T4 DNA ligase(Promega公司)，堿性磷酸酶(TaKaRa公司)，基因組DNA小量抽提試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所), 細菌PCR試劑盒(GENERON公司),DNA凝膠回收試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所), Plasmid mini kit I(Omega公司)，Western blot試劑盒(藍基生物科技)。

1.1.4 實驗儀器 PTC-200型PCR儀(MJ RESEARCH公司)，MUPID電泳儀(Advance公司), GDS-8000型全自動凝膠成像分析儀(UVP公司)。

1.2 方法

1.2.1 制備金黃色葡萄球菌834標準株基因組DNA SA 834經(jīng)TSB培養(yǎng)基37 ℃恒溫振蕩過夜培養(yǎng),收集菌體,使用基因組DNA抽提試劑盒抽提基因組DNA。

1.2.2 克隆、擴增tst-1及其上下游基因片段(SAB0359、SAB0361) 以基因組DNA為模板, 采用正向引物和反向引物(表1)進行PCR擴增，反應(yīng)條件: 94 ℃ 4 min, 94 ℃ 30 s, 60 ℃ 30 s, 72 ℃ 55 s, 72 ℃ 4 min,共29個循環(huán)。PCR產(chǎn)物電泳后，回收目的基因片段。連接回收的基因片段與載體質(zhì)粒pCRII,轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌DH5α菌株, 在平板培養(yǎng)后篩選陽性克隆，在37 ℃恒溫振蕩條件下培養(yǎng)24 h, 從培養(yǎng)后的大腸埃希菌中提取質(zhì)粒，并分別命名為pCRII-tst-1、pCRII-SAB0359、pCRII-SAB0361。分別以限制性內(nèi)切酶KpnI、BamHⅠ和BamHⅠ、SalI雙酶切3種質(zhì)粒，電泳后回收目的基因片段。

1.2.3 構(gòu)建敲除質(zhì)粒 以限制性內(nèi)切酶KpnI、BamHⅠ雙酶切載體質(zhì)粒pAULA, 在pAULA線性化后，以堿性磷酸酶使pAULA線性化載體質(zhì)粒尾端去磷酸化，回收、純化pAULA線性化載體質(zhì)粒。連接SAB0359片段與pAULA線性化載體質(zhì)粒?；厥者B接物，常規(guī)轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α，以KpnI、BamHⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切鑒定連接成功的質(zhì)粒，并命名為pAULA-SAB0359。以同樣的方法，在用BamHⅠ、SalI限制性內(nèi)切酶雙酶切pAULA-SAB0359后,連接SAB0361片段與pAULA-SAB0359線性化載體質(zhì)粒，獲得pAULA-Δtst-1敲除質(zhì)粒。

表1 研究中所用引物序列

1.2.4 構(gòu)建基因敲除菌株 將pAULA-Δtst-1敲除質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入SA 834，反應(yīng)條件為2.5 kV、5 ms，以LB-Em培養(yǎng)基篩選出溫度敏感突變株(Δtst)[7]。

1.2.5 蛋白質(zhì)的提取與鑒定 以TSB培養(yǎng)基在37 ℃下振蕩培養(yǎng)SA 834、Δtst，24 h后回收細菌，細菌裂解后，離心并取上清液，進行蛋白定量，然后以Western blot方法鑒定TSST-1。

1.2.6 生存率分析 將SA 834、Δtst濃度調(diào)整為2×107cfu/mL，分別尾靜脈注射0.1 mL至小鼠體內(nèi)，觀察小鼠14 d生存率。

2 結(jié)果與分析

2.1tst-1及其上下游基因片段的克隆、擴增及鑒定

將PCR擴增的tst-1、SAB0359、SAB0361與 pCRII連接后，常規(guī)轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α,從LB-Amp-X-gal選擇性平板上挑取單個生長的白色菌落，擴增后小量抽提質(zhì)粒，雙酶切后以瓊脂糖凝膠電泳檢測基因片段。檢測結(jié)果證明已成功地克隆出tst-1(678 bp)、SAB0359(570 bp)、SAB0361(327 bp)基因片段 (見圖1)。

2.2 敲除質(zhì)粒的構(gòu)建、鑒定

以KpnⅠ和SacⅠ酶切鑒定敲除質(zhì)粒，在瓊脂糖凝膠上可見敲除質(zhì)粒的2個條帶：897 bp條帶和未切完全的原質(zhì)粒(約9 kb) 條帶(見圖2) 。

2.3 敲除菌株的鑒定

采用tst基因正向、反向引物，PCR擴增SA 834、Δtst基因組DNA，PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果顯示：SA 834有tst基因片段，Δtst無tst基因片段(圖3)。收集并裂解過夜培養(yǎng)的SA 834、Δtst，離心并取上清液，蛋白定量后以Western blot方法檢測TSST-1，檢測結(jié)果顯示SA 834有TSST-1表達，Δtst無TSST-1表達(圖4)。

圖1 PCR擴增的tst-1、SAB0359、SAB0361序列Fig.1 PCR amplification of tst-1, SAB0359, and SAB03611：DM2 000 marker; 2：tst-1; 3：SAB0359; 4：SAB0361

圖2 對敲除質(zhì)粒pAULA-Δtst-1的限制性酶切分析Fig.2 Restriction enzyme digestion analysis of pAULA-Δtst-11：DM10 000 marker; 2：pAULA-Δtst-1

圖3 PCR擴增的SA 834、Δtst-1的tst-1序列Fig.3 PCR amplification of tst-1 in SA 834 orΔtst-1

圖4 SA 834、Δtst-1的TSST-1表達的Western blot檢測Fig.4 Western blot analysis of TSST-1 in SA834 or Δtst-1

2.4 敲除菌株生長特性的鑒定

過夜培養(yǎng)SA 834、Δtst，調(diào)整培養(yǎng)液的濃度至OD600為1.0，取5 mL接種到100 mL TSB培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)24 h，分別在0、1、2、4、6、12、24 h檢測菌體的生長情況，敲除菌株與標準菌株生長趨勢基本一致(圖5)。

2.5 敲除菌株生存率的觀察

過夜培養(yǎng)SA 834、Δtst，調(diào)整菌液的濃度至2×107cfu/mL，分別取0.1 mL菌液，尾靜脈注射至小鼠體內(nèi)，觀察小鼠14 d生存率(圖6)。

圖5 SA 834、Δtst-1的生長曲線Fig.5 Growth curve of SA 834,Δtst-1

圖6 SA 834、Δtst-1感染小鼠的生存率Fig.6 Survival rate of mice infected with SA 834,Δtst-1

3 討 論

許多研究指出，在金黃色葡萄球菌的感染過程中，金黃色葡萄球菌黏附宿主細胞，金黃色葡萄球菌逃避宿主免疫機制，以及金黃色葡萄球菌在宿主細胞內(nèi)的生存和增殖都發(fā)揮著重要的作用[7-9]。

鑒于TSST-1是SA的重要致病因子，有必要闡明TSST-1在SA侵襲細胞中所發(fā)揮的作用。為此，本研究在已經(jīng)表達、提純重組TSST-1蛋白的基礎(chǔ)上，以PCR的方法擴增SA 834的tst-1基因及其上、下游的SAB0359、SAB0361基因,并構(gòu)建pAULA-Δtst-1基因敲除質(zhì)粒, 將pAULA-Δtst-1轉(zhuǎn)入SA 834后，以同源重組方法構(gòu)建了金黃色葡萄球菌的tst-1基因敲除菌株(Δtst-1)。本研究有助于將來進一步闡明TSST-1在金黃色葡萄球菌感染機制中所發(fā)揮的作用。

[1] Deleo FR, Otto M, Kreiswirth BN, et al. Community-associated meticillin-resistantStaphylococcusaureus[J]. Lancet,2010, 375:1557-1568.

[2] Lowy FD.Staphylococcusaureusinfections[J]. N Engl J Med,1998,339(8):520-532.

[3] Kulhankova K1, King J, Salgado-Pabón W. Staphylococcal toxic shock syndrome: superantigen-mediated enhancement of endotoxin shock and adaptive immune suppression[J]. Immunol Res,2014, 59(1-3):182-187.

[4] Dinges MM, Orwin PM, Schlievert PM. Exotoxins ofStaphylococcusaureus[J].Clin Microbiol Rev,2000, 13(1):16-34.

[5] Li SJ, Hu DL, Maina EK, et al. Superantigenic activity of toxic shock syndrome toxin-1 is resistant to heating and digestive enzymes[J]. J Appl Microbiol,2011, 110(3):729-736.

[6] Thomas D, Dauwalder O, Brun V, et al.Staphylococcusaureussuperantigens elicit redundant and extensive human Vbeta patterns[J]. Infect Immun,2009, 77(5):2043-2050.

[7] Schaefers MM, Breshears LM, Anderson MJ, et al. Epithelial proinflammatory response and curcumin-mediated protection from staphylococcal toxic shock syndrome toxin-1[J]. PLoS One,2012, 7(3):e32813.

[8] Sachse F, Becker K, von Eiff C, et al.Staphylococcusaureusinvades the epithelium in nasal polyposis and induces IL-6 in nasal epithelial cellsinvitro[J]. Allergy,2010, 65(11):1430-1437.

[9] Foster TJ. Colonization and infection of the human host by staphylococci: adhesion, survival and immune evasion[J]. Vet Dermatol,2009, 20(5-6):456-470.

Construction oftst-1-deletion mutant ofStaphylococcusaureus

LI Sheng-jun1, ZHANG Xiao-qing1, WEI Bing1, ZHANG Di2, Lü Chang-long1

(1.Teach. &Res.Div.ofImmun.,Coll.ofBasicMed.Sci.,Shengyang110122; 2.Teach. &Res.Div.ofProstheticDentistry,Coll.ofDentalMed.,ChinaMed.Uni.,Shenyang110001)

The genomic DNA ofStaphylococcusaureusstrain 834 was extracted. Thetst-1 gene and it ’s upstream, downstream genes ofS.aureuswere amplified with PCR and cloned into plasmid pCRII. The upstream, downstream genes oftst-1 gene were inserted into plasmid pAULA to form homogenous recombinant plasmid pAULA-Δtst-1. The pAULA-Δtst-1 was electroporated intoS.aureusto carry out homogenous recombination. Thetst-1-deletion mutant ofS.aureuswas characterized with PCR, Western blot for non-tst-1 fragment, no TSST-1 protein expression was found, suggested that the construction oftst-1-deletion mutant ofS.aureuswas successful.

Staphylococcusaureus;tst-1;gene knockout

遼寧省博士科研啟動基金項目(20111109)

李勝軍 男，副研究員，博士。研究方向為粘膜免疫與感染免疫。 E-mail: lsj73@hotmail.com

2014-09-23；

2014-11-06

Q939.1；R61

A

1005-7021(2015)06-0056-04

10.3969/j.issn.1005-7021.2015.06.010