宋小平，王雅潔，王迎新，沈書文，李光偉

（1.安徽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校藥學(xué)系，安徽合肥230601；2.合肥天麥生物科技發(fā)展公司，安徽合肥230031；3.中國科技大學(xué)生物工程中試基地，安徽合肥230022）

谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶菌株的篩選及其產(chǎn)酶條件研究

宋小平1，王雅潔1，王迎新1，沈書文2，李光偉3

（1.安徽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校藥學(xué)系，安徽合肥230601；2.合肥天麥生物科技發(fā)展公司，安徽合肥230031；3.中國科技大學(xué)生物工程中試基地，安徽合肥230022）

利用蛋白質(zhì)交聯(lián)-絮凝沉淀性能測定方法，從土壤中分離得到1株高產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（microbial transglutaminase，MTG）的菌株，命名為HF-82，初步確定為鏈霉菌屬。單因素試驗確定最適產(chǎn)酶氮源和碳源分別是蛋白胨和葡萄糖，正交試驗確定最適發(fā)酵培養(yǎng)基為（g/L）：葡萄糖25.0，蛋白胨20.0，酵母提取物5.0，MgSO4·7 H2O 2.0，K2HPO4·3 H2O 2.0，NaH2PO42.0，CaCO33.0，pH 7.0。此發(fā)酵工藝條件下，MTG的酶活可達(dá)到0.53 U/mL。

蛋白質(zhì)交聯(lián)-絮凝沉淀法；谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶；菌種選育；產(chǎn)酶條件

谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（Microbial transglutaminase，簡稱MTG，EC2，3，2，13），是一種催化?；D(zhuǎn)移反應(yīng)的轉(zhuǎn)移酶。由于其具有在蛋白質(zhì)間架橋形成ε-（γ-Glu）-Lys的異型肽鍵[1]，將蛋白質(zhì)共價交聯(lián)聚合，使蛋白質(zhì)改性，該酶已經(jīng)在食品工業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)、分析檢測和生物工程等方面取得廣泛應(yīng)用，因而具有很大的研究開發(fā)空間[2-4]。

微生物發(fā)酵法生產(chǎn)的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶成本低，吸引了國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注和興趣。在谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的發(fā)酵生產(chǎn)中，獲得優(yōu)良的菌種十分關(guān)鍵。近年，黃六容[5]利用設(shè)計的低廉簡便的凝膠法從土壤中分離得到1株高產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶。Claucia F[6-7]等報道運用蛋白質(zhì)交聯(lián)－絮凝沉淀法，在亞馬遜河附近篩選到一株產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的菌，該菌產(chǎn)生的MTG能減少酪蛋白、大豆分離蛋白和水解動物蛋白的自由氨基，并對酪蛋白顯示出明顯的蛋白質(zhì)交聯(lián)作用。目前已報道的微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶菌株主要屬于放線菌類的鏈霉菌屬[4-8，9]。

采用蛋白質(zhì)交聯(lián)－絮凝沉淀法初步估測菌株是否產(chǎn)酶[10-12]，再用經(jīng)典的比色法測定酶活大小并對其發(fā)酵條件進(jìn)行了初步探討，為該酶應(yīng)用于發(fā)酵生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 土壤采集

參照土樣采集方法[12-14]，選擇有機(jī)質(zhì)豐富的沃土、堆肥采集土樣[15]，自合肥板橋屠宰場、合肥蜀山奶牛場、岳西縣屠宰場、奶牛場附近菜園、安徽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校校園花圃取土樣共17份，每份重約500 g，土樣采集時間為2011年10月10日至11月10日。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 初篩分離培養(yǎng)基（g/L）

精氨酸0.83，甘油12.5，NaC1 1.0，MgSO4·7H2O 2.0，土壤浸出汁200，瓊脂15.0，水800。滅菌后加入無菌過濾的放線菌酮0.05，制霉菌素0.08。

1.2.2 斜面種子培養(yǎng)基

高氏1號培養(yǎng)基。

1.2.3 液體種子培養(yǎng)基（g/L）

葡萄糖20.0 g，蛋白胨20.0 g，酵母膏5.0，MgSO4· 7H2O 2.0，K2HPO4·3H2O 2.0，NaH2PO42.0，pH 7.0。

1.2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）

葡萄糖25.0，蛋白胨20.0，酵母提取物5.0，MgSO4· 7 H2O 2.0，K2HPO4·3 H2O 2.0，NaH2PO42.0，Ca CO33.0，pH7.0。

1.3 試劑

cycloheximide（放線菌酮），nystatin（制霉菌素），Caseinscase（酪蛋白），CBZ-Gln-GLy和r-單異氧肟酸均購自Sigma公司，其余均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.4 方法

1.4.1 菌種分離

取土壤樣品1.0 g，加入9mL無菌水中制成懸浮液，充分振蕩靜置30min后取上層懸液，依次制備成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5不同濃度的稀釋液，取0．2mL不同濃度的稀釋液涂布于分離培養(yǎng)基平板上，于28℃培養(yǎng)5 d～7 d，觀察菌落形態(tài)，從平板挑取放線菌菌落進(jìn)行劃線培養(yǎng)，直至得到純培養(yǎng)。

1.4.2 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)方法

將分離的菌種于斜面培養(yǎng)基中活化后，取一環(huán)斜面孢子，接入液體種子培養(yǎng)基，接到裝有20mL液體種子培養(yǎng)基的200m L的三角瓶中，28℃，200 r/min條件下培養(yǎng)48h。將培養(yǎng)好的液體種子按10%的接種量接人裝有40mL搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，28℃，200 r/min恒溫培養(yǎng)至第3天，離心得到上清液。

1.4.3 凝膠法初篩產(chǎn)酶菌株[15-17]

1 g酪蛋白用少量NaOH濕潤后，再加入磷酸緩沖液（0.02mol/L，pH 6.5）使酪蛋白濃度達(dá)到12%.酪蛋白溶液與發(fā)酵上清液按一定比例混合均勻，于37℃反應(yīng)3 h后靜置，觀察實驗現(xiàn)象，依據(jù)是否有凝絮或沉淀產(chǎn)生判斷是否產(chǎn)MTG，并大致估計酶活性。

1.4.4 比色法復(fù)篩產(chǎn)酶菌株[16，18]

對產(chǎn)生凝膠現(xiàn)象的菌株再用比色法進(jìn)行復(fù)篩，測定上清液的谷氨酰胺轉(zhuǎn)酶活力，進(jìn)行酶活、細(xì)胞干重和pH測定。

1.4.5 產(chǎn)酶菌株的培養(yǎng)條件優(yōu)化

單因素試驗確定MTG發(fā)酵培養(yǎng)基最佳碳源是葡萄糖，最佳氮源是蛋白胨和酵母膏，在此基礎(chǔ)上，以葡萄糖、蛋白胨和酵母膏為3個優(yōu)化因素，每個因素選取3個水平，確定因素水平表，如表1所示。以MTG酶活為優(yōu)化指標(biāo)，按下表進(jìn)行L9（33）的正交實驗。

表1 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化的因素和水平表Table1 Factors and levels of optimization of fermentation medium

1.5 測定方法

1.5.1 生物量的測定

取10mL發(fā)酵液經(jīng)4 000 r/min離心10min，蒸餾水洗滌沉淀2次，離心收集沉淀，于105℃烘干至恒重，稱重。

1.5.2 MTG酶活測定方法

比色法[14，21-22]等測定酶活，底物試劑中各 物質(zhì)的濃度分別是：鹽酸羥胺0.1mol/L，CBZ-Gln-Gly 30 mmol/L，Tris-乙酸緩沖液0.2mol/L（pH 6.0），還原型谷胱甘肽10mmol/L。1mL底物試劑與0.2m L上清液37℃預(yù)熱5min后，混合、反應(yīng)10 min，迅速加入1 mL終止液（5%FeCl3·6H2O：12%三氯乙酸：3mol/L鹽酸=1∶1∶1）終止反應(yīng)，4 000 r/min離心，棄去沉淀，在525 nm下測上清液的吸光度，參比可用失活的酶液代替。一個MTG酶活單位（U/mL）定義為在37℃，pH 6.0的條件下反應(yīng)1min生成1 umol氧肟酸的量。以L-谷氨酸-γ-單羥胺酸（氧肟酸）作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 初篩試驗

首先，從稀釋梯度涂布平板的上，根據(jù)菌落形態(tài)初步挑出135株放線菌，再結(jié)合生長形狀及顯微鏡檢結(jié)果挑出73株放線菌，將這些放線菌菌落，經(jīng)平板劃線分離并傳代培養(yǎng)2代～3代。

我們對二次初選得到的73株放線菌以蛋白質(zhì)交聯(lián)凝絮-沉淀性能測定試驗進(jìn)行初篩。發(fā)現(xiàn)有4個菌株有明顯的凝絮-沉淀現(xiàn)象產(chǎn)生，所有發(fā)生交聯(lián)凝聚反應(yīng)的菌株均進(jìn)行2次或3次重復(fù)試驗，不同批次實驗中出現(xiàn)的現(xiàn)象基本一致，分別命名HF-11、HF-45、HF-82、HF-105。

2.2 復(fù)篩試驗

對初篩得到的4個菌株進(jìn)行復(fù)篩試驗，搖瓶發(fā)酵得到的上清液進(jìn)行比色反應(yīng)測定MTG酶活，所有菌株都在一定程度上產(chǎn)生MTG，而且菌株的產(chǎn)酶能力和蛋白質(zhì)交聯(lián)凝絮結(jié)果相吻合。試驗結(jié)果酶活性最高的是HF-82號為0.41U/mL，所以以該菌株為出發(fā)菌株作進(jìn)一步鑒定和優(yōu)化分析。

2.3 產(chǎn)MTG菌株的初步鑒定

HF-82菌株在平板上培養(yǎng)7 d后，菌落呈圓形，凸起，灰白色，邊緣不規(guī)則狀。采用插片法培養(yǎng)，于不同時期在顯微鏡下觀察氣生菌絲、基內(nèi)菌絲、孢子絲的形態(tài)特征。氣生菌絲豐富，灰色、基內(nèi)菌絲褐色，孢子絲有不同程度的輪生，符合鏈霉菌的特點。初步鑒定該菌為放線菌中的鏈霉菌屬。

2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.4.1 不同碳源和氮源對HF-82菌株生物量與產(chǎn)酶的影響

分別選擇不同碳源、氮源替代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖、蛋白胨進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶試驗，測定生物量和酶活性，結(jié)果見表2。

表2 HF-82菌株在不同碳源、氮源上的MTG酶活性和生物量Table2 Biomass and MTG activity of strain HF-82 on different carbon sources and nitrogen sources

結(jié)果表明，不同碳源、氮源對HF-82菌株細(xì)胞生長和產(chǎn)酶影響較大，以葡萄糖為碳源時細(xì)胞生長最好，同時酶活也最高，其生物量和酶活分別為16.28 g/L、0.41 U/mL，其次是麥芽糖，生物量和酶活分別為15.67 g/L、0.34U/mL，故以下試驗中采用葡萄糖為碳源；氮源中，牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、酪蛋白等有機(jī)氮源均可顯著促進(jìn)細(xì)胞生長，以蛋白胨為氮源，酶活最高，達(dá)到0.46U/mL，而以無機(jī)硫酸銨為氮源時，不產(chǎn)酶，可見蛋白胨在供試氮源中為最好的氮源，因而后續(xù)試驗以蛋白胨為最佳氮源。

2.4.2 最適產(chǎn)酶培養(yǎng)基配方的確定

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以葡萄糖、蛋白胨和酵母膏為3個優(yōu)化因素，每個因素選取3個水平，以MTG酶活為優(yōu)化指標(biāo)，按下表進(jìn)行L9（33）的正交實驗，結(jié)果如表3所示。

表3 正交設(shè)計實驗結(jié)果Table 3 Experimental results of orthogonal design

從表3可以看出，3個因素對產(chǎn)酶的影響程度為：葡萄糖>蛋白胨>酵母提取物。說明葡萄糖、蛋白胨對酶活影響最大，為主要影響因素；酵母提取物對酶活影響小，為次要影響因素。因此，葡萄糖選取A2，蛋白胨選取B2，次要影響因素酵母提取物以節(jié)約為原則選取C1或C3，并用A2B2C1和A2B2C3各做1次驗證試驗，結(jié)果如表4所示。

表4 正交試驗的驗證試驗Table4 Proof testing of orthogonal experiment

正交試驗的驗證試驗表明，A2B3C2的酶活為0.52 U/mL，A2B3C1酶活為0.53U/mL，故確定最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基為A2B3C1。所以，本試驗中MTG發(fā)酵培養(yǎng)基組合為（g/L）：葡萄糖25.0，蛋白胨20.0，酵母提取物5.0，MgSO4·7H2O2.0，K2HPO4·3H2O2.0，NaH2PO42.0，CaCO33.0，p H7.0。此時酶活達(dá)0.53U/m L。

2.5 菌體細(xì)胞的生長與產(chǎn)酶曲線

在HF-82菌株發(fā)酵產(chǎn)酶過程中，每隔8小時取樣，測得菌體細(xì)胞的生長與產(chǎn)酶曲線分別見圖1和圖2。

圖1 菌體細(xì)胞的生長曲線Fig.1 The growth curve of HF-82

圖2 菌體細(xì)胞的產(chǎn)酶曲線Fig.2 The enzyme activity curve of HF-82

由圖1、2可知，菌體生長量和MTG的酶活與時間呈相關(guān)性；在發(fā)酵中期，細(xì)胞生長量和MTG酶活都不斷增加，經(jīng)過一段時間之后，菌體生長從指數(shù)生長末期開始進(jìn)人穩(wěn)定生長期，酶活也達(dá)到最高，并隨發(fā)酵時間的延長而略有下降。所以，最佳的發(fā)酵時間為80 h，此時酶活最大，為0.53U/m L。

3 結(jié)論

本研究從土壤中篩選分離得到的菌株HF-82初步優(yōu)化后，其發(fā)酵液的MTG酶活達(dá)0.53U/mL，但是與內(nèi)外研究的最大表達(dá)量尚有差距。下一步將通過擴(kuò)增谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒，建立高密度發(fā)酵工藝和簡便有效的MTG包涵體復(fù)性方法，提高HF-82菌株的酶活。

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Screening of Microbial Transglutaminase Producing Strain and Optimazation of Fermentation Conditions

SONG Xiao-ping1，WANG Ya-jie1，WANG Ying-xing1，SHENG Shu-wen2，LI Guang-wei3
（1.Department of Pharmacy，Anhui Medical College，Hefei230601，Anhui，China；2.Hefei Tianmai Biopharmaceutical Technology Co.，Ltd.，Hefei 230031，Anhui，China；3.Biology Engineering Test Base，University of Science and Technology of China，Hefei 230022，Anhui，China）

A high transglutaminase-producing strain was isolated through a protein cross-linked-flocculation precipitate method，which was identified primarily to be a species of Streptomyces sp.The single factor experiments showed that the optimal carbon and nitrogen sources were glucose and peptone.The optimum medium composition was glucose25.0 g/L，Peptone 20.0 g/L，Yeast extract 5.0 g/L，MgSO4·7H2O 2.0g/L，K2HPO4·3H2O 2.0 g/L，NaH2PO42.0 g/L，CaCO33.0g/L received by Orthogonal Experimental Design.Under this fermentation process，the enzyme activity was promoted to0.53U/mL.

proteincross-linked-flocculation precipitate method；transglutaminase；screening；fermentation conditions

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.01.030

2014-06-29

安徽省教育廳自然科學(xué)研究重點項目（KJ2010A201）；安徽省專業(yè)帶頭人培養(yǎng)資助項目（皖教秘人[2013]189號）

宋小平（1968—），女（漢），教授，碩士，從事生物制藥的教學(xué)和研究工作。