刁小琴，關(guān)海寧，魏雅冬，馬雪，李楊，郭麗，馬松艷

（綏化學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，黑龍江綏化152061）

窖藏馬鈴薯干腐病病原菌的分離及綠色防治技術(shù)研究

刁小琴，關(guān)海寧，魏雅冬，馬雪，李楊，郭麗，馬松艷

（綏化學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，黑龍江綏化152061）

窖藏“黃麻子”馬鈴薯干腐病的病原菌主要為燕麥鐮刀菌。4℃的低溫可以抑制鐮刀菌的生長。該菌在pH 3～11范圍內(nèi)均能生長，低于5和高于9時生長較緩慢。殼聚糖和VC均能抑制該病原菌的生長，0.5%的殼聚糖抑菌效果顯著，VC含量越高，抑菌效果越明顯。臭氧對該病原菌有一定的抑制作用，每隔一天用輸出量400mg/mL的臭氧發(fā)生器處理8min，可有效抑制該病原菌。

馬鈴薯；干腐病；分離；綠色防治

馬鈴薯是世界上僅次于水稻、小麥、玉米的第四大作物，營養(yǎng)十分豐富[1]，在黑龍江省種植廣泛，是重要的經(jīng)濟(jì)作物。馬鈴薯除鮮銷外，其余均用于貯藏便于反季銷售。然而在窖藏過程中，塊莖常發(fā)生腐爛，不但影響商品品質(zhì)，而且縮短了貯藏期，造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)調(diào)查，由鐮刀菌引起的干腐病是馬鈴薯的主要采后病害，貯藏期間發(fā)病率可高達(dá)30%[2-3]，該病害嚴(yán)重阻礙了馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展。目前，有研究對不同地區(qū)馬鈴薯干腐病鐮刀菌進(jìn)行了分離鑒定[4-5]，而對于黑龍江省引起“黃麻子”馬鈴薯干腐病病原菌的分離鑒定及抑制研究很少有報道。同時對于病害的抑制方面，多采用噴灑化學(xué)殺菌劑，該法雖然可以進(jìn)行有效控制，但由于存在藥物殘留、環(huán)境污染等問題而逐漸被限制。因此，本研究在對病原菌鑒定的基礎(chǔ)上采用消費(fèi)者可以接受的綠色防治技術(shù)抑制菌體的生長，以期為防治窖藏馬鈴薯干腐病提供理論基礎(chǔ)，同時對黑龍江省農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整、新農(nóng)村建設(shè)及促進(jìn)農(nóng)民增收具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 病原菌的分離、純化和鑒定

供試馬鈴薯塊莖預(yù)冷后貯藏于窖中，選擇表皮局部顏色發(fā)暗、褐色，發(fā)病部略微凹陷的薯塊用蒸餾水洗凈，用解剖刀切取約5mm的病健交界處的薯塊，于75%的乙醇中浸泡30 s，用無菌生理鹽水沖洗3遍，將其置于PDA培養(yǎng)基中分離和純化。將純化后的菌種移至PDA平板28℃條件培養(yǎng)，依據(jù)真菌手冊鑒定。

1.2 病原菌致病性鑒定

根據(jù)柯赫氏法則進(jìn)行致病性測定。將分離純化后的分離物配成106個孢子/mL的菌懸液用于接種。將馬鈴薯塊莖清洗后用無菌水沖洗，70%酒精表面消毒，用滅菌刀切開一切口，用滅菌棉花蘸菌懸液涂切口，常溫貯藏，10 d后觀察發(fā)病癥狀和病癥形態(tài)，分離培養(yǎng)進(jìn)一步確認(rèn)鑒定致病菌。

1.3 抑制病原菌生長試驗

供試菌種經(jīng)5 d平板培養(yǎng)，用直徑6mm的打孔器打取菌落邊緣的菌塊，移入新的PDA平板內(nèi)，根據(jù)不同要求進(jìn)行處理，每個處理均設(shè)3個重復(fù)。每隔1天使用十字交叉法測量不同處理下的菌落直徑，統(tǒng)計各處理間的差異顯著性。

1.3.1 溫度試驗

將移植有菌塊的PDA平板置于0、4、15、28、35℃環(huán)境下培養(yǎng)。

1.3.2 pH試驗

用1mol/LHCl和1mol/LNaOH將PDA培養(yǎng)基調(diào)配成3、5、7、9、11等5種不同的pH，移入菌塊在28℃下培養(yǎng)。

1.3.3 添加殼聚糖試驗

用1.0%（體積分?jǐn)?shù)）的醋酸溶解殼聚糖，配成濃度為5.0mg/mL，經(jīng)高壓滅菌后，加入無菌融化的PDA中，分別獲得殼聚糖濃度為0.25%、0.5%、0.75%、1%的培養(yǎng)基，移入菌塊在28℃下培養(yǎng)。

1.3.4 添加抗壞血酸試驗

將抗壞血酸用無菌水配成濃度為4.0mg/mL的溶液，加入無菌融化的50℃的PDA中，分別獲得抗壞血酸濃度為0.1、0.2、0.3、0.4mg/mL、的培養(yǎng)基，移入菌塊在28℃下培養(yǎng)。

1.3.5 臭氧試驗

將移植有菌塊的PDA平板置于PE塑料袋中，用臭氧輸出量400mg/h的臭氧發(fā)生器分別處理2、4、6、8、10min后，扎緊袋口30min，打開袋子在室溫下培養(yǎng)。每隔1天用臭氧處理1次。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用statistix 8.0（Analystical Software Inc.，USA）的Linear Models程序進(jìn)行，用Tukey HSD程序?qū)Σ町愶@著性（P＜0.05）或差異極顯著性（P＜0.01）進(jìn)行分析，采用Sigmaplot10.0軟件作圖。每個實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的鑒定

病原菌菌落在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)8d后，大部分培養(yǎng)基上產(chǎn)生大量絮狀白色菌絲，表面呈玫瑰紫色。大型分生孢子兩端漸尖，通常為5隔，小型孢子為1隔～2隔，厚垣孢子鏈生或簇生。菌落形態(tài)及孢子形態(tài)見圖1。

圖1 菌落形態(tài)及孢子形態(tài)Fig.1 Morphology of colony and spore

根據(jù)病原菌形態(tài)特征，同時參考《真菌鑒定手冊》和《中國真菌志》，初步認(rèn)定為該病原菌為燕麥鐮刀菌（F.avenaceum）。

2.2 病原菌致病性鑒定

馬鈴薯有傷接種10 d后，薯塊表面出現(xiàn)黑褐色凹陷斑塊，切開后組織呈黑色至黑褐色，薯塊內(nèi)有空洞，且空洞內(nèi)有白色菌絲。與自然發(fā)病干腐病癥狀相同，從回接發(fā)病的馬鈴薯塊莖中可分離得到原接種病菌。上述結(jié)果證明燕麥鐮刀菌是引起黃麻子馬鈴薯干腐病的主要病原菌。

2.3 病原菌生長的抑制試驗

2.3.1 溫度對病原菌菌落直徑的影響

溫度是影響馬鈴薯發(fā)病的重要因素之一，適宜的溫度有利于病原菌的繁殖、傳播[6]，不同溫度對病原菌菌落直徑的影響見圖2。

圖2 不同溫度對病原菌菌落直徑的影響Fig.2 The influence of different temperature on pathogenic bacteria colony diameter

圖2可以看出，病原菌在0℃以上均可以生長，隨著溫度的升高繁殖速度加快，當(dāng)溫度超過28℃，菌落生長速度又呈下降趨勢。低溫不能完全抑制菌落的生長，但培養(yǎng)10 d后，4℃的處理和0℃的處理差異不顯著（P＜0.5），而和其它處理差異顯著（P＞0.5）。因此，馬鈴薯貯藏在4℃的環(huán)境中，可以較其它溫度更好的抑制病原菌的生長。而貯藏溫度為0℃，雖然也能較好的抑制病原菌的生長，但0℃的環(huán)境利于水解酶活性的增高，淀粉水解，單糖積累，食用時變甜[7]。因此綜合考慮選擇4℃貯藏較適宜。

2.3.2 pH對病原菌菌落直徑的影響

pH對病原菌菌落直徑的影響見圖3。

圖3 不同pH對病原菌菌落直徑的影響Fig.3 The influence of different pH on the pathogenic bacteria colony diameter

圖3可以看出，馬鈴薯病原菌能適應(yīng)較寬的pH范圍，pH在3～11范圍內(nèi)均有不同程度的生長，但生長的最適pH5～9，雖然pH過高、過低都對菌絲生長有一定影響，但不能完全抑制，這說明該菌對pH的適應(yīng)性較強(qiáng)，給該病害的控制帶來一定的困難。

2.3.3 殼聚糖對病原菌菌落直徑的影響

殼聚糖在微生物細(xì)胞外形成物理屏障，阻礙細(xì)胞內(nèi)外的物質(zhì)代謝且破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，導(dǎo)致胞內(nèi)物質(zhì)外滲，同時會誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)發(fā)生一系列的生化反應(yīng)[8]。不同殼聚糖濃度對病原菌菌落直徑的影響見圖4。

圖4 不同殼聚糖濃度對病原菌菌落直徑的影響Fig.4 The influence of different chitosan concentration on the pathogenic bacteria colony diameter

圖4可以看出，殼聚糖處理能夠抑制病原菌的生長，且隨著濃度的增大，抑菌效果逐漸增強(qiáng)，當(dāng)濃度超過0.5%后，各處理差異不顯著（P＜0.5）。因此考慮到利用殼聚糖涂膜時，如果濃度過高，可能會造成馬鈴薯的無氧呼吸，因此殼聚糖選擇0.5%作為抑菌濃度較合適。

2.3.4 抗壞血酸（VC）對病原菌菌落直徑的影響

抗壞血酸由于本身具有酸性或產(chǎn)生的特殊抗壞血酸的氧化物使其具有殺菌作用。不同濃度的抗壞血酸對病原菌的抑制見圖5。

圖5 不同抗壞血酸濃度對病原菌菌落直徑的影響Fig.5 The influence of different VCconcentration on the pathogenic bacteria colony diameter

由圖5可以看出，隨著抗壞血酸濃度的增大，抑菌效果逐漸增強(qiáng)。當(dāng)培養(yǎng)10 d后，VC含量為0.4mg/mL的抑菌率超過60%。因此通過用抗壞血酸處理馬鈴薯不僅可以增加馬鈴薯的維生素含量，還可以防止其腐爛變質(zhì)[9]。

2.3.5 臭氧殺菌時間對病原菌菌落直徑的影響

臭氧是一種強(qiáng)氧化劑，安全、無毒無污染，生產(chǎn)成本低，具有廣譜殺滅微生物的作用[10]，不同臭氧殺菌時間對病原菌生長的影響見圖6。

圖6 不同臭氧處理時間對病原菌菌落直徑的影響Fig.6 The influence of different ozone processing time on the pathogenic bacteria colony diameter

圖6可以看出，隨著臭氧殺菌時間的延長，病原菌被殺滅的程度逐漸增大，培養(yǎng)10 d后，每天處理8min的菌落直徑與每天處理10min的菌落直徑差異不顯著（（P＜0.5），因此選用每天8min的殺菌強(qiáng)度即可抑制馬鈴薯干腐病的病原菌。

3 結(jié)論與討論

從感病馬鈴薯上分離的病原菌，經(jīng)病害外部癥狀觀察及菌落、孢子形態(tài)特征鑒定及致病性檢測，確定馬鈴薯干腐病的主要病原菌為鐮刀菌。該病原菌在4℃的環(huán)境下被抑制。該菌對pH的適應(yīng)性較強(qiáng)，這給該病害的控制帶來一定的困難。0.5%的殼聚糖能夠很好的抑制該病原菌，雖然殼聚糖濃度越高，抑菌效果越好，但考慮到如用高濃度的殼聚糖涂膜，可能會導(dǎo)致馬鈴薯無氧呼吸而加快腐爛，因此并不是殼聚糖濃度越高越好。而抗壞血酸的添加量應(yīng)該越高越好，這不僅可以抑制病原菌從而減少腐爛變質(zhì)，還可以提高馬鈴薯的VC含量。每天用臭氧處理8min就可以很好的抑制該病原菌，且安全、無污染，如采用更長的時間，抑菌率會有一定程度的提高，但大大造成了資源的浪費(fèi)。

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Study on Isolation and Green Control Technique of Pathogens Causing Potato Dry Rot Disease during Storage

DIAO Xiao-qin，GUAN Hai-ning，WEI Ya-dong，MA Xue，LI Yang，GUO Li，MA Song-yan
（College of Food and Pharmaceutical Engineering，Suihua University，Suihua 152061，Heilongjiang，China）

The growth of Fusarium could be inhibited at4℃.The bacteria can grow within pH range of 3～11 and grow more slowly below 5 and above 9.Chitosan and VCcan inhibit the growth of the pathogen and antibacterial effect is remarkable by 0.5% chitosan.VCcontent is higher，the antibacterial effect is more obvious.Ozone has certain inhibitory effect and 8min ozone treatment can effectively inhibit the pathogen.

potato；dry rot disease；isolation；green control technique

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.01.032

2013-08-05

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目（面上）[12531836]

刁小琴（1979—），女（漢），講師，研究生，主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏的研究教學(xué)工作。