田雨，侯玉柱，柯潤(rùn)輝，尹建軍，宋全厚

(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京，100027)

ATP生物發(fā)光法是新近發(fā)展起來(lái)的一種微生物快速檢測(cè)技術(shù)［1］，具有快速、簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)［2］，目前主要應(yīng)用在食品生產(chǎn)企業(yè)的日常衛(wèi)生管控方面［3-4］，它與涂抹法結(jié)合可快速測(cè)定食品生產(chǎn)加工環(huán)節(jié)各個(gè)衛(wèi)生關(guān)鍵控制點(diǎn)的衛(wèi)生狀況［5-6］，快速評(píng)估，及時(shí)發(fā)現(xiàn)問題，降低微生物污染發(fā)生的可能性［7-8］。

由于ATP生物發(fā)光法無(wú)法定性鑒別細(xì)菌種類［9-12］，因此不同細(xì)菌 ATP 含量是否一致［13-14］，對(duì)該方法的檢測(cè)結(jié)果影響較大。鑒于此，本研究以ATP生物發(fā)光法為基礎(chǔ)，輔以GB4789.2-2010方法，選擇大腸埃希氏菌、枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、乳酸鏈球菌、乳酸片球菌等6種常見細(xì)菌，分析和對(duì)比不同常見細(xì)菌中ATP含量的差異性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

大腸埃希氏菌(CICC10389、CICC20234);枯草芽孢桿菌(CICC10275);蠟狀芽孢桿菌(CICC20511);乳酸鏈球菌(CICC20711);乳酸片球菌(CICC20719)。

1.1.2 儀器與試劑

ATP熒光檢測(cè)儀(SF0012型)，購(gòu)于中質(zhì)賽福(北京)科技儀器有限公司;恒溫培養(yǎng)箱;渦旋振蕩器;高壓滅菌鍋。

ATP標(biāo)準(zhǔn)品(三磷酸腺苷二鈉鹽);復(fù)合熒光試劑(產(chǎn)品編號(hào)ZF0011)，購(gòu)于中質(zhì)賽福(北京)科技儀器有限公司;平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基(PCA);無(wú)菌生理鹽水;無(wú)菌水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 建立6株細(xì)菌的菌落總數(shù)(CFU/mL)與ATP熒光值(RLU/50μL)的數(shù)學(xué)模型

自冷藏的斜面培養(yǎng)基中挑取6株細(xì)菌——大腸埃希氏菌(CICC10389、CICC20234)、枯草芽孢桿菌(CICC10275)、蠟狀芽孢桿菌(CICC20511)、乳酸鏈球菌(CICC20711)、乳酸片球菌(CICC20719)，分別劃線接種于培養(yǎng)皿中，36℃培養(yǎng)24 h。將10 mL無(wú)菌生理鹽水注入已劃線培養(yǎng)24 h的平皿培養(yǎng)基表面，打散其上的菌落并收集于無(wú)菌玻璃試管中，振蕩搖勻，作為菌懸液原液。吸取每株細(xì)菌的菌懸液原液各1 mL放入無(wú)菌玻璃試管中，加4 mL生理鹽水混合均勻，配制成稀釋度為10-1的6株細(xì)菌的混合液。以無(wú)菌生理鹽水10倍梯度稀釋各細(xì)菌的菌懸液原液及其混合液，配制成10-1～10-8梯度稀釋菌液。吸取 10-6、10-7、10-8梯度稀釋菌液各 1 mL，按照GB4789.2-2010測(cè)定其菌落總數(shù)。再吸取各菌株及其混合菌液的梯度稀釋液各50 μL于樣品杯中，加25 μL復(fù)合熒光試劑，放入ATP熒光檢測(cè)儀中測(cè)定其熒光值。以菌液的菌落總數(shù)(CFU/mL)及ATP熒光值(RLU/50μL)建立數(shù)學(xué)模型。

1.2.2 建立ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度與其熒光值的數(shù)學(xué)模型

稱取ATP標(biāo)準(zhǔn)品0.055 1 g，以無(wú)菌水定容于100 mL容量瓶，即得10-6mol/mL的ATP基礎(chǔ)溶液。吸取ATP基礎(chǔ)溶液1 mL，以無(wú)菌水定容于100 mL容量瓶，即得10-8mol/mL的ATP基礎(chǔ)稀釋溶液。對(duì)10-8mol/mL的ATP基礎(chǔ)稀釋溶液進(jìn)行10倍梯度稀釋，配制濃度為10-9～10-13mol/mL的ATP標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。吸取ATP標(biāo)準(zhǔn)系列溶液各50 μL于樣品杯中，加25 μL復(fù)合熒光試劑，以微量熒光檢測(cè)儀測(cè)定其熒光值。根據(jù)ATP標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的濃度(mol/mL)與相應(yīng)的熒光值(RLU/50μL)，建立數(shù)學(xué)模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 各細(xì)菌的ATP熒光值(RLU/50μL)與菌落總數(shù)(CFU/mL)的關(guān)系

分別測(cè)定大腸埃希氏菌(CICC10389、CICC20234)、枯草芽孢桿菌(CICC10275)、蠟狀芽孢桿菌(CICC20511)、乳酸鏈球菌(CICC20711)、乳酸片球菌(CICC20719)等6株細(xì)菌的ATP熒光值和菌落總數(shù)，由于每次可測(cè)得5～6對(duì)數(shù)據(jù)，為獲得統(tǒng)計(jì)學(xué)中的大樣本數(shù)量(n≥30)，多次重復(fù)測(cè)定，保證每株細(xì)菌測(cè)得30對(duì)或30對(duì)以上的數(shù)據(jù)用于建立數(shù)學(xué)模型。表1內(nèi)是6株細(xì)菌及其混合菌液的菌落總數(shù)對(duì)數(shù)值［log10(CFU/mL)］與ATP熒光值對(duì)數(shù)值［log10(RLU)］的數(shù)學(xué)模型，由表1的數(shù)學(xué)模型，可計(jì)算出6株細(xì)菌在相同熒光值下對(duì)應(yīng)的菌落總數(shù)，見表2。

表1 六株細(xì)菌的菌落總數(shù)與ATP熒光值的數(shù)學(xué)模型Table 1 Mathematical models between aerobic plate count and ATP fluorescence value of six strains

表2 六株細(xì)菌及其混合物在不同ATP熒光值下的菌落總數(shù)CFU/mLTable 2 Aerobic plate counts of six strains and their mixture with different ATP fluorescence values CFU/mL

由表2可知，當(dāng)熒光值為100時(shí)，6株細(xì)菌及其混合物的菌落總數(shù)基本維持在104CFU/mL左右，并且隨著熒光值的10倍遞增，菌落總數(shù)也呈現(xiàn)10倍遞增趨勢(shì)，當(dāng)熒光值達(dá)到1 000 000(儀器的最大量程為7位數(shù))時(shí)，菌落總數(shù)始終保持在108CFU/mL的水平。因此，當(dāng)熒光值相同時(shí)，無(wú)論是單一純菌樣品還是含有多種混合細(xì)菌的樣品，其菌落總數(shù)都保持在相同或相近的數(shù)量級(jí)上。

為了進(jìn)一步確認(rèn)在ATP熒光值均相同的情況下，6株細(xì)菌及其混合菌液的菌落總數(shù)是否存在明顯差異，對(duì)表2中6株細(xì)菌的菌落總數(shù)進(jìn)行無(wú)重復(fù)的雙因素方差分析，結(jié)果見表3。

由表 3可知，F(xiàn)行=8.13＞F行crit=2.87，P=4.62×10-4＜0.05，表示當(dāng) ATP熒光值(在100～1 000 000RLU/50 μL范圍內(nèi))數(shù)量級(jí)不同時(shí)，實(shí)驗(yàn)所用的6株細(xì)菌的菌落總數(shù)有明顯差異。即ATP熒光值的數(shù)量級(jí)對(duì)各細(xì)菌的菌落總數(shù)有顯著影響。而F列=1.31＜F列crit=2.71，P=0.30＞0.05，表示當(dāng) ATP熒光值(在100～1 000 000 RLU/50μL范圍內(nèi))相同時(shí)，各細(xì)菌的菌落總數(shù)無(wú)顯著差異。即細(xì)菌的種類雖然會(huì)導(dǎo)致ATP生物發(fā)光法所測(cè)得的菌落總數(shù)各不相同，但差異并不明顯，不會(huì)對(duì)菌落總數(shù)的報(bào)告結(jié)果產(chǎn)生顯著影響。

表3 六株細(xì)菌在相同熒光值下的菌落總數(shù)的無(wú)重復(fù)雙因素方差分析CFU/mLTable 3 No repeat two-way ANOVA of aerobic plate counts of six strains and their mixture with same ATP fluorescence value CFU/mL

2.2 ATP濃度與熒光值的關(guān)系

表4 ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度與相應(yīng)的熒光值Table 4 Concentration of ATP standard solution and their fluorescence value

根據(jù)ATP濃度的對(duì)數(shù)值和熒光值的對(duì)數(shù)值建立數(shù)學(xué)模型，如圖1。

圖1 ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度與其相應(yīng)熒光值的數(shù)學(xué)模型Fig.1 A mathematical model between concentration of ATP standard solution and their fluorescence values

可知ATP含量與其熒光值的相關(guān)數(shù)學(xué)模型為:

Y=0.968 5X+15.443 4

其中，Y為ATP熒光值的對(duì)數(shù)值［log10(RLU)］;X為ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的對(duì)數(shù)值［log10(mol/mL)］;二者相關(guān)系數(shù)(R2)為0.994 3，數(shù)學(xué)模型線性良好。

2.3 各細(xì)菌的菌落總數(shù)與ATP濃度的關(guān)系

將ATP濃度與熒光值的數(shù)學(xué)模型Y=0.968 5X+15.443 4(見圖1)代入表1中的6株菌落總數(shù)與熒光值的數(shù)學(xué)模型，可推導(dǎo)出株菌落總數(shù)對(duì)數(shù)與ATP濃度對(duì)數(shù)值的數(shù)學(xué)模型，見表5。

表5 六株細(xì)菌的菌落總數(shù)與ATP含量的數(shù)學(xué)模型Table 5 Mathematical models between aerobic plate count and ATP content

根據(jù)表5中的數(shù)學(xué)模型，可計(jì)算不同菌落總數(shù)水平下的各細(xì)菌ATP含量(mol)。但由于受本研究所使用的ATP熒光檢測(cè)儀量程所限(見表2)，僅選取104～108CFU/mL(與ATP熒光檢測(cè)儀100～1 000 000 RLU的量程相對(duì)應(yīng))共5個(gè)數(shù)量級(jí)的菌落總數(shù)，代入表5的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行計(jì)算。

表6 六株細(xì)菌在不同菌落總數(shù)下的ATP含量Table 6 ATP contents of six strains with different aerobic plate counts

由表6可知，6株細(xì)菌的ATP含量均隨菌落總數(shù)的10倍增長(zhǎng)而逐級(jí)提高，當(dāng)菌落總數(shù)為104CFU/mL時(shí)，6種細(xì)菌的ATP總量基本都在10-14mol/mL的水平。當(dāng)菌落總數(shù)為108CFU/mL時(shí)，6種細(xì)菌的ATP總量基本都在10-10mol/mL的水平。雖然大部分細(xì)菌的ATP總量并不是絕對(duì)嚴(yán)格地隨菌落總數(shù)的10倍遞增，其兩位有效數(shù)字往往有所不同;但當(dāng)菌落總數(shù)相同時(shí)，各細(xì)菌的ATP含量都在相同或相近的數(shù)量級(jí)上。

為確定在菌落總數(shù)均相同的情況下，6株細(xì)菌的ATP總含量是否存在顯著差異，對(duì)表6中的數(shù)據(jù)進(jìn)行無(wú)重復(fù)的雙因素方差分析，結(jié)果如下:

由表7可知，F(xiàn)行=10.11＞F行crit=2.87，P=1.21×10-5＜0.05，表示當(dāng)菌落總數(shù)的數(shù)量級(jí)(1～108CFU/mL)不同時(shí)，實(shí)驗(yàn)所用的6株株細(xì)菌的ATP總含量有明顯的差異。即菌落總數(shù)的數(shù)量級(jí)對(duì)各細(xì)菌的ATP總含量有顯著影響。而F列=1.24＜F列crit=2.71，P=0.33＞0.05，表示當(dāng)菌落總數(shù)相同時(shí)，不同細(xì)菌的ATP含量無(wú)明顯差異。即細(xì)菌的種類不會(huì)對(duì)ATP生物發(fā)光法所測(cè)得的各細(xì)菌的ATP總含量產(chǎn)生顯著影響。而根據(jù)圖1中的數(shù)學(xué)模型，ATP含量與其熒光值線性相關(guān)(R2=0.994 3)，因此雖然6株細(xì)菌種屬不同，但當(dāng)其菌落總數(shù)相同時(shí)，所測(cè)定的ATP熒光值無(wú)明顯差異。

表7 六株細(xì)菌在不同菌落總數(shù)下的ATP含量的無(wú)重復(fù)因素方差分析mol/LTable 7 No repeat two-way ANOVA of ATP contents of six strains with different aerobic plate counts mol/L

3 結(jié)論

目前，對(duì)ATP生物發(fā)光法的研究，多集中在溫度、pH值、提取劑等外在因素對(duì)微生物檢測(cè)結(jié)果的影響［15-16］，關(guān)于不同種類細(xì)菌中ATP含量的研究較為稀少［17］。張國(guó)龍［18］、張虹妍［19］等為了驗(yàn)證抗結(jié)核藥物的作用，曾以ATP生物發(fā)光法測(cè)定結(jié)核分枝桿菌的ATP含量，但并未橫向比對(duì)不同細(xì)菌種類之間的差別。本研究分析和比對(duì)了大腸埃希氏菌、枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、乳酸鏈球菌、乳酸片球菌等6株常見細(xì)菌的ATP含量，這對(duì)ATP生物發(fā)光法的實(shí)際應(yīng)用具有重要意義——在使用該方法快速檢測(cè)樣品的細(xì)菌數(shù)量時(shí)，可以忽略體積相似或相近的細(xì)菌的種屬差異，根據(jù)數(shù)學(xué)模型推算菌落總數(shù)，為食品生產(chǎn)加工企業(yè)的衛(wèi)生管控提供快速、準(zhǔn)確的技術(shù)支撐。

［1］ 尹子波，侯玉柱，尹建軍，等.ATP生物發(fā)光技術(shù)在微生物檢測(cè)中的應(yīng)用［J］.食品研究與開發(fā)，2012，33(2):228-231.

［2］ 李連紅，陸燁，胡國(guó)慶.ATP生物熒光技術(shù)在醫(yī)院感染預(yù)防與控制中的應(yīng)用進(jìn)展［J］.中國(guó)消毒學(xué)雜志，2014，31(4):386-388.

［3］ Kathryn A W，Lindsay A S，Joanna V.The detection of food soils and cells on stainless steel using industrial methods:UV illumination and ATP bioluminescence［J］.International Journal of Food Microbiology，2008，127(1/2):121-128.

［4］ Jo?o Niza-Ribeiro，Armando C L，Paula S，et al.Monitoring the microbiological quality of raw milk through the use of an ATP bioluminescence method［J］.Food Control，2000，11(3):209-216.

［5］ Narsaiah K，Jha S N，Jaiswal P，et al.Estimation of total bacteria on mango surface by using ATP bioluminescence［J］.Scientia Horticulturae，2012，146:159-163.

［6］ 趙奇，劉吉起，張玉勤，等.ATP熒光檢測(cè)法在衛(wèi)生監(jiān)測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用［J］.中國(guó)消毒學(xué)雜志，2014，31(2):217-218.

［7］ Seema P，Simleen K，Selwyn A W D，et al.Evaluation of growth based rapid microbiological methods for sterility testing of vaccines and other biological products［J］.Vaccine，2011，29(45):8 012-8 023.

［8］ Emanuele A，Claudia D.Use of ATP bioluminescence for assessing the cleanliness of hospital surfaces:A review of the published literature(1990—2012)［J］.Journal of Infection and Public Health，2014，7(2):92-98.

［9］ 唐倩倩，王劍平，蓋玲，等.ATP生物發(fā)光法檢測(cè)E.coli O157:H7的研究［J］.光譜學(xué)與光譜分析，2009，29(2):309-312.

［10］ 劉曉紅，趙愛華，羅金平，等.光學(xué)生物傳感器用于快速檢測(cè)卡介苗活菌數(shù)研究［J］.傳感技術(shù)學(xué)報(bào)，2010，23(1):1-4.

［11］ Lucia P，F(xiàn)rancesco C F，Carmine L，et al.Strengths and weaknesses in the determination of Saccharomyces cerevisiae cell viability by ATP-based bioluminescence assay［J］.Enzyme and Microbial Technology，2013，52(3):157-162.

［12］ 張博，康懷興，米志強(qiáng)，等.基于裂解酶與ATP生物發(fā)光法特異定量檢測(cè)炭疽桿菌方法的研究［J］.生物技術(shù)通訊，2014，25(1):9-12.

［13］ Hawronskyj J M，Holah J.ATP:A universal hygienemonitor［J］.Trends in Food Science and Technology，1997，8(3):79-84.

［14］ Hattori N，Sakakibara T，Kajiyama Y，et al.Enhanced microbial biomass assay using mutant luciferase resistant to benzalkonium chloride ［J］.AnalyticalBiochemistry，2003，319(2):287-295.

［15］ 李利霞，伍金娥，常超，等.ATP生物發(fā)光檢測(cè)技術(shù)的建立及應(yīng)用可行性分析［J］.食品科技，2012，37(1):275-278.

［16］ 黃彬，余元善，唐道邦，等.CTAB提取ATP的生物熒光法快速檢測(cè)細(xì)菌總數(shù)準(zhǔn)確性研究［J］.現(xiàn)代食品科技，2014，30(2):269-273.

［17］ Shama C，Malik D J.The uses and abuses of rapid bioluminescence-based ATP assays［J］.Internatinal Journal of Hygiene and Environmental Health，2013，216(2):115-125.

［18］ 張國(guó)龍，石瑞如，張霞，等.生物熒光法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌ATP含量［J］.醫(yī)學(xué)研究雜志，2010，39(6):52-55.

［19］ 張虹妍，石瑞如，史慧敏，等.生物熒光法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌 ATP含量［J］.醫(yī)藥論壇雜志，2011，32(17):1-2.