郭峰，胡花麗，吳朝霞，李鵬霞

1(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工所，江蘇南京，210014)2(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)，110866)

芹菜(Apium graveolens)，屬傘形科植物，是1種耐寒性柱狀葉類蔬菜，清香鮮嫩、風(fēng)味獨(dú)特，具有降壓降脂等功效［1-2］。但采后芹菜的呼吸作用和生理代謝旺盛，極易失水、黃化，致使芹菜衰老加速，貨架期縮短，因此采后芹菜的貯藏保鮮技術(shù)是生產(chǎn)實(shí)踐中備受關(guān)注的問(wèn)題［3］。

果蔬的成熟衰老與活性氧代謝及膜脂過(guò)氧化作用密切相關(guān)。果蔬中活性氧物質(zhì)主要包括H2O2、·OH和 O-2·等。剛采收果蔬體內(nèi)的 SOD、POD、CAT等內(nèi)源抗氧化酶活性較高，能及時(shí)清除組織代謝產(chǎn)生的過(guò)量活性氧，維持活性氧的穩(wěn)態(tài)，使其不會(huì)對(duì)果蔬造成傷害［4］;然而，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，果蔬體內(nèi)的抗氧化能力減弱，導(dǎo)致組織內(nèi)活性氧的積累，當(dāng)活性氧的積累超過(guò)一定的閥值，即對(duì)細(xì)胞膜系統(tǒng)造成傷害，從而加速果蔬的衰老［5］。

薄膜包裝可通過(guò)薄膜的滲透作用與果蔬的呼吸作用在包裝袋內(nèi)形成高濃度CO2和低濃度O2氣體微環(huán)境，進(jìn)而影響果蔬的新陳代謝，達(dá)到延長(zhǎng)果蔬貯藏壽命的目的［6-8］。此外，薄膜包裝具有方便、無(wú)公害等特點(diǎn)，已在多種果蔬保鮮中被廣泛應(yīng)用［9-12］。不同種類的果蔬對(duì)薄膜包裝的貯藏適應(yīng)性差異較大，需針對(duì)產(chǎn)品找出相適應(yīng)的薄膜種類［13］。

本試驗(yàn)以鮮切芹菜為材料，研究了鮮切芹菜在薄膜包裝貯藏過(guò)程中抗氧化能力及其相關(guān)酶活性的變化，旨在探討不同薄膜包裝對(duì)芹菜衰老的影響。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與預(yù)處理

本試驗(yàn)芹菜材料為清晨采收的南京地產(chǎn)香芹，采收后1 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。切去莖基部和葉柄，保留莖長(zhǎng)度20～25 cm，挑選長(zhǎng)度一致、成熟度相近、色澤鮮艷、無(wú)機(jī)械傷、無(wú)病害的鮮切芹菜作為試驗(yàn)材料。采用P1-12.75 μm 聚乙烯袋［滲透系數(shù):CO2，553 525.26 mL/(m2·d);O2，440 129.22 mL/(m2·d)］、P2，32.70 μm聚乙烯袋［滲透系數(shù):CO2，31 616.57 mL/(m2·d);O2，4 329.00 mL/(m2·d)］對(duì)芹菜進(jìn)行包裝處理，以12.75 μm聚乙烯袋打孔(上下各開(kāi)一直徑2 cm圓孔)包裝作對(duì)照處理(CK)。每袋裝芹菜(800±50)g，置于(7±1)°C進(jìn)行自發(fā)氣調(diào)貯藏，相對(duì)濕度為80%～90%。貯藏期間每5 d取樣1次，每處理取樣(500±20)g，用于各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 袋內(nèi)CO2和O2比例的測(cè)定

用CYES-Ⅱ氧CO2氣體測(cè)定儀測(cè)定薄膜包裝袋內(nèi)O2和CO2含量。

1.2.2 葉綠素含量測(cè)定

切除芹菜根部和頂部6～7 cm，保留的中間部分作為指標(biāo)測(cè)定用樣品。參考李合生［14］的方法，采用乙醇浸提法測(cè)定葉綠素含量。稱取樣品5 g，體積分?jǐn)?shù)95%乙醇勻漿定容15 mL，避光浸提，于649、665 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值，計(jì)算葉綠素含量。

1.2.3 丙二醛(MDA)含量測(cè)定［14］

樣品選取方法同1.2.2。取5 g樣品，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%三氯乙酸15 mL，研磨勻漿，3 000 r/min下離心10 min，取上清液2 mL，加入2 mL 0.67%硫代巴比妥酸，混合后沸水浴30 min，冷卻后離心，取上清液測(cè)定在450、532、600 nm波長(zhǎng)處的吸光值，計(jì)算MDA含量。

1.2.4 抗氧化能力的測(cè)定［15-16］

樣品選取方法同1.2.2。提取液的制備:稱取5 g樣品，加入10 mL 95%乙醇勻漿，浸提5 h，10 000 r/min離心20 min，上清液即為提取液。

1.2.4.1 DPPH清除能力的測(cè)定

反應(yīng)液為2.5 mL 1.0×10-4mol/L DPPH溶液，1 mL樣品提取液，于波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光值，計(jì)算清除能力。

1.2.4.2 羥基自由基(·OH)清除能力測(cè)定

在試管中分別加入2 mL磷酸緩沖液(pH 7.4)，0.3 mL 5 mmol/L的鄰二氮菲溶液，0.2 mL 7.5 mmol/L FeSO4溶液，每加一管后立即混勻。加入0.5 mL提取液，混勻后加入1 mL 0.02%的H2O2最后補(bǔ)充體積至6 mL。于37°C水浴1 h，于510 nm處測(cè)定吸光值，計(jì)算清除能力。

1.2.4.3 超氧陰離子自由基(O2-·)清除能力測(cè)定

取2.5 mL 0.05 mol/L Tris-HCl緩沖溶液(pH 8.2)，置于25°C水浴20 min，分別加入0.5 mL提取液和0.5 mL 25 mmol/L的鄰苯三酚溶液，混勻后于25°C水浴5 min，8 mol/L HCl溶液0.5 mL用于終止反應(yīng)，于425 nm處測(cè)定吸光值，計(jì)算清除能力。

1.2.5 酶活性的測(cè)定［17］

1.2.5.1 過(guò)氧化物酶(POD)活性的測(cè)定

采用愈創(chuàng)木酚法，樣品選取方法同1.2.2。取5 g樣品，加入10 mL 50 mmol/L磷酸緩沖液(pH 7.0，內(nèi)含1%PVP)，冰浴下研磨，4°C下10 000 r/min下離心20 min，上清液即為POD粗提液。取1 mL粗酶提取液，加入2 mL 0.05 mol/L愈創(chuàng)木酚(用0.2 mol/L pH 6.4的磷酸緩沖液配成)中，在30°C水浴中平衡5 min，然后加入1 mL 0.2%H2O2(用0.2 mol/L pH 6.4的磷酸緩沖液配成)混勻，以每分鐘OD470變化0.01為表示1個(gè)過(guò)氧化物酶活性單位計(jì)算POD活性。

1.2.5.2 過(guò)氧化氫酶(CAT)活性的測(cè)定

樣品選取方法同1.2.2。取5 g樣品，加入10 mL 50 mmol/L磷酸緩沖液(pH 7.0，內(nèi)含1%PVP)，冰浴下研磨，4°C下10 000 r/min下離心20 min，上清液即為CAT粗提液。取1 mL粗酶液，加入2 mL 0.05 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.8)，在25°C水浴下預(yù)熱5 min，加入1 mL 0.2%H2O2，以每分鐘 OD240減少0.1個(gè)單位為一個(gè)酶活性單位計(jì)算CAT活性。

1.2.5.3 超氧化物歧化酶(SOD)活性的測(cè)定

采用氮藍(lán)四唑(NBT)法，樣品選取方法同1.2.2。取5 g樣品，加入15 mL 50 mmol/L磷酸緩沖液(pH 7.8，內(nèi)含1%PVP)冰浴下研磨，于4°C下10 000 r/min離心20 min，上清液即為SOD粗提液。取1 mL上清液，加入1.5 mL 50 mmol/L磷酸緩沖液、0.3 mL 130 mmol/L Met溶液、0.3 mL 750 μmol/L NBT 溶液、0.3 mL 100 μmol/L EDTA-Na2液、0.3 mL 20 μmol/L核黃素，置于4 000 lux日光燈下反應(yīng)20 min，于560 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，計(jì)算SOD活性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Origin 8.5進(jìn)行作圖，顯著性采用SPSS 20.0軟件ANOVA進(jìn)行鄧肯式多重差異分析(P＜0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 薄膜包裝袋內(nèi)CO2和O2的比例

由表1可知，P2包裝袋內(nèi)CO2濃度高于P1，O2濃度低于P1，分別維持在1.10% ～1.97%和12.53%～17.63%之間，這與P2薄膜包裝更低的氣體滲透性［CO2滲透系數(shù):31 616.57 mL/(m2·d);O2滲透系數(shù):4 329 mL/(m2·d)］有直接聯(lián)系?？梢?jiàn)，P2薄膜包裝極大地限制了包裝袋內(nèi)氣體與空氣間的滲透。

表1 薄膜包裝袋內(nèi)CO2和O2的比例Table 1 CO2and O2content in bags during film packaging storage

2.2 不同薄膜包裝對(duì)鮮切芹菜葉綠素含量的影響

芹菜采后呼吸旺盛，極易黃化［1］，由此影響保鮮和銷售。表2表明，在貯藏過(guò)程中，芹菜葉綠素含量整體呈下降趨勢(shì)。在貯藏第5、10、25天時(shí)，P2處理的芹菜葉綠素a、b和總?cè)~綠素含量均顯著高于P1和CK(P＜0.05)，總?cè)~綠素含量分別為 CK的1.19、1.26、2.34倍，表明P2薄膜包裝可有效延緩芹菜葉綠素分解，顯著提高芹菜貯藏品質(zhì)及壽命。

表2 鮮切芹菜在薄膜包裝貯藏過(guò)程中葉綠素含量的變化Table 2 chlorophyll content of fresh-cut celery during film packaging storage

2.3 不同薄膜包裝對(duì)鮮切芹菜丙二醛(MDA)含量的影響

MDA含量是反映膜脂過(guò)氧化程度的一個(gè)重要指標(biāo)。由圖1可看出，在鮮切芹菜貯藏過(guò)程中，MDA含量整體呈上升趨勢(shì)，其中P1和P2處理芹菜的MDA含量均低于CK。在整個(gè)貯藏過(guò)程中，P2處理芹菜的MDA含量顯著低于P1和CK(P＜0.05)，且在第10天達(dá)到最小值，為0.34 μmol/g?？梢?jiàn)，在鮮切芹菜貯藏過(guò)程中，薄膜包裝可有效抑制丙二醛含量的增加，其中P2薄膜包裝處理的效果更好。

圖1 鮮切芹菜在薄膜包裝貯藏過(guò)程中丙二醛(MDA)含量的變化Fig.1 MDA content of fresh-cut celery during film packaging storage

2.4 不同薄膜包裝對(duì)鮮切芹菜自由基清除能力的影響

圖2-A表明，在鮮切芹菜在貯藏過(guò)程中，DPPH清除能力先上升后下降。CK、P1、P2處理芹菜的DPPH清除能力均在貯藏第20天時(shí)達(dá)到峰值。在貯藏第5、10、15、20、25 天時(shí)，P2 處理芹菜的 DPPH 清除能力分別是 CK 的 1.19、1.27、1.21、1.20、1.46 倍，且該處理芹菜對(duì)DPPH清除能力顯著高于CK(P＜0.05)。然而，整個(gè)貯藏過(guò)程中，P1處理與CK相比無(wú)顯著性差異。

由圖2-B可知，整個(gè)貯藏過(guò)程中，P1、P2處理芹菜的羥基自由基清除能力均高于CK;在貯藏第5、10、15、25天時(shí)，P1處理芹菜的·OH清除能力與P2無(wú)顯著性差異，而在第20天時(shí)，P2處理芹菜的·OH清除能力比P1處理高9.51%?？梢?jiàn)，P2薄膜包裝處理芹菜可維持較高的·OH清除能力。

由圖2-C可知，貯藏期間，鮮切芹菜超氧陰離子自由基清除能力上升后迅速下降。CK芹菜中O2-·清除率峰值出現(xiàn)在第10天，為11.57%;P1、P2處理O2-·清除率的峰值則均出現(xiàn)在第15天，分別為15.62%、18.65%?？傮w來(lái)看，貯藏10 d后，P1、P2處理芹菜中的O2-·清除能力顯著高于CK(P＜0.05)。

2.5 不同薄膜包裝對(duì)鮮切芹菜內(nèi)源抗氧化酶活性的影響

圖2 鮮切芹菜在薄膜包裝貯藏過(guò)程中自由基清除能力的變化Fig.2 Radical scavenging activity of fresh-cut celery during film packaging storage

2.5.1 不同薄膜包裝對(duì)鮮切芹菜超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響

圖3 鮮切芹菜在薄膜包裝貯藏過(guò)程中SOD活性的變化Fig.3 SOD activity of fresh-cut celery during film packaging storage

由圖3可看出，鮮切芹菜在貯藏期間，其SOD活性整體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，且在貯藏15 d后SOD活性下降速率明顯加快。除第5天外的整個(gè)貯藏過(guò)程中，P2處理芹菜的SOD活性顯著高于CK(P＜0.05)。整個(gè)貯藏過(guò)程P1處理芹菜的SOD活性與CK無(wú)顯著性差異?？芍?，P2薄膜包裝可有效延緩鮮切芹菜SOD活性的降低。

2.5.2 不同薄膜包裝對(duì)鮮切芹菜過(guò)氧化物酶(POD)活性的影響

圖4表明，鮮切芹菜在貯藏期間，POD活性在前期緩慢上升，之后呈波動(dòng)上升的趨勢(shì)。在貯藏0～10 d時(shí)，P1、P2處理芹菜的POD活性均高于CK;貯藏10 d之后，CK、P1處理芹菜的POD活性開(kāi)始波動(dòng)上升，且CK高于P1(P＜0.05)。P2處理芹菜的POD活性在貯藏15 d后出現(xiàn)波動(dòng)?？芍琍2處理薄膜包裝可有效延緩鮮切芹菜過(guò)氧化物酶(POD)活性峰值的出現(xiàn)。

圖4 鮮切芹菜在薄膜包裝貯藏過(guò)程中POD的變化Fig.4 POD activity of fresh-cut celery during film packaging storage

2.5.3 不同薄膜包裝對(duì)鮮切芹菜過(guò)氧化氫酶(CAT)活性的影響

圖5 鮮切芹菜在薄膜包裝貯藏過(guò)程中CAT的變化Fig.5 CAT activity of fresh-cut celery during film packaging storage

由圖5可看出，鮮切芹菜在整個(gè)貯藏過(guò)程中，其CAT活性先上升后下降。CK、P2處理的CAT活性均在第15天出現(xiàn)極大值，分別為1.771 U/g和1.959 U/g;在第15、20天時(shí)，P1處理的CAT活性低于CK處理。整個(gè)貯藏過(guò)程中，P2處理的CAT活性顯著高于CK(P＜0.05)。可知，P2處理可有效維持鮮切芹菜較高的CAT活性。

3 討論與結(jié)論

生物細(xì)胞膜脂過(guò)氧化的一個(gè)主要機(jī)制是活性氧自由基誘發(fā)膜脂不飽和脂肪酸發(fā)生連鎖的過(guò)氧化反應(yīng)，使脂肪酸發(fā)生降解，產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化物［18］。SOD能催化O2-·的歧化反應(yīng)［19］，保護(hù)膜結(jié)構(gòu)，延緩組織衰老。SOD活性下降與MDA含量增加，意味著組織清除活性氧能力的下降和膜脂過(guò)氧化作用的加強(qiáng)。本研究表明，CK處理鮮切芹菜貯藏10 d后SOD活性下降速率加快，O2-·清除率下降，MDA含量迅速升高;SOD活性與MDA含量顯著呈負(fù)相關(guān)(r=-0.793)，這與阮亞楠［20］的研究結(jié)果一致。與對(duì)照相比，薄膜包裝顯著降低了鮮切芹菜MDA的積累，延緩了SOD活性和O2-·清除能力的下降，說(shuō)明薄膜包裝對(duì)抑制膜脂過(guò)氧化損傷具有一定的作用，這可能與其維持包裝袋微環(huán)境中的低濃度O2(12.53%～17.63%)和高濃度CO2(1.10%～1.97%)有關(guān)，這一結(jié)果同樣被胡花麗在草莓［21］中證實(shí)。

CAT催化分解組織中高濃度的 H2O2，從而使H2O2控制在較低水平。POD催化組織中低濃度的H2O2發(fā)生氧化，用以清除過(guò)氧化物和H2O2。POD伴隨果蔬的成熟衰老而不斷發(fā)生變化，其所表現(xiàn)的保護(hù)作用或傷害效應(yīng)因植物種類和品種不同而異［22］。有學(xué)者認(rèn)為可能植物體中存在2種POD作用機(jī)制，一種機(jī)制是它在遇逆境或衰老初期即表達(dá)，表現(xiàn)為保護(hù)效應(yīng)，能增加果實(shí)的耐藏性;另一種則是在逆境后期或衰老后期被啟動(dòng)，表現(xiàn)為傷害效應(yīng)，因此降低果實(shí)的耐藏性［23］。本研究結(jié)果表明，芹菜CAT活性先上升后下降，這與 Bartoli［24］和閆瑞香［25］等的研究結(jié)果一致。POD活性在貯藏前期緩慢上升，此時(shí)POD表現(xiàn)為保護(hù)效應(yīng)，隨后出現(xiàn)的峰值標(biāo)志衰老加速的開(kāi)始［26-27］，POD 活性出現(xiàn)波動(dòng)和上升，這與聶華堂［28］等的研究結(jié)果一致。與對(duì)照相比，P2薄膜包裝顯著提高了CAT活性，延緩POD活性峰值的出現(xiàn)并在貯藏后期抑制POD活性波動(dòng)上升，表明P2薄膜包裝可有效保持鮮切芹菜活性氧自由基代謝的平衡，延緩其衰老進(jìn)程。

自由基清除能力是判定果蔬抗氧化活性的重要指標(biāo)，抗氧化物質(zhì)(酚類、黃酮類、Vc)和抗氧化酶(SOD、CAT、POD)系統(tǒng)共同維持植物體內(nèi)的自由基平衡。研究結(jié)果表明，與對(duì)照相比，P2薄膜包裝維持鮮切芹菜較高的DPPH、·O2-、·OH的清除能力，說(shuō)明P2薄膜包裝可有效保持鮮切芹菜較高的抗氧化活性，減少自由基對(duì)組織的損傷，這也與MDA含量變化的結(jié)果一致。

綜上所述，鮮切芹菜在貯藏過(guò)程中，SOD活性下降，CAT活性先上升后下降，POD活性在貯藏前期緩慢上升，后期出現(xiàn)峰值和波動(dòng)，表明芹菜衰老加速。結(jié)果表明，與對(duì)照相比，薄膜包裝可提高鮮切芹菜DPPH、O2-·、·OH的清除能力及 CAT、POD的活性。此外，P2薄膜包裝更有效延緩了MDA的積累和SOD活性下降，并延遲了POD活性峰值的出現(xiàn);另外，P2薄膜包裝還有效減緩了組織中葉綠素的降解，這與其低滲透性所形成的高比例CO2和低比例O2密切相關(guān)。因此，薄膜包裝可有效延緩鮮切芹菜的衰老進(jìn)程，其中P2薄膜包裝效果更佳。

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