岳麗，熱那汗·買買提，敬思群

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆烏魯木齊，830046)

環(huán)磷酸腺苷 (cyclic adenosine monophosphate，cAMP)是一種重要的生物活性物質(zhì)，廣泛存在于植物細(xì)胞中［1］，具有重要的生理調(diào)節(jié)作用［2-3］，可用于調(diào)節(jié)免疫［4-5］、治療心血管疾病，具有營(yíng)養(yǎng)心肌、舒張血管的作用。cAMP還是細(xì)胞內(nèi)參與調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝和生物學(xué)功能的重要物質(zhì)，是激素作用的“第二信使”，在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮激素調(diào)節(jié)生理機(jī)能和物質(zhì)代謝作用，對(duì)糖、脂肪、蛋白質(zhì)代謝的調(diào)控以及對(duì)基因表達(dá)、細(xì)胞分化與增殖的調(diào)節(jié)、免疫機(jī)能的影響、動(dòng)物生產(chǎn)性能的調(diào)控等起著重要的作用［6-8］。

紅棗營(yíng)養(yǎng)豐富，含有多種營(yíng)養(yǎng)成分，其中多糖、cAMP和三萜酸是最具特色和優(yōu)勢(shì)的三類功能性成分。據(jù)報(bào)道，成熟棗的果肉中cAMP含量可達(dá)100～500nmol/g［9］，為所有已測(cè)動(dòng)植物中最高的，是一般動(dòng)植物的數(shù)千至數(shù)萬(wàn)倍［10-11］。我國(guó)每年紅棗產(chǎn)量約6 000多萬(wàn) t，其中“次等棗”(裂棗、落棗、小棗、色差棗等)約占產(chǎn)量的30% ～40%，甚至達(dá)70%以上，如不能進(jìn)行及時(shí)有效的加工，將造成棗資源的巨大浪費(fèi)，鑒于環(huán)磷酸腺苷(cAMP)特殊的生理活性作用，且在紅棗中含量較高，本研究主要以“次等棗”為原料生產(chǎn)紅棗環(huán)磷酸腺苷并將其純化。目前，主要利用大孔樹(shù)脂純化技術(shù)純化cAMP。大孔樹(shù)脂具有比表面積大、吸附容量大、吸附速度快、解吸條件溫和等優(yōu)點(diǎn)，但是再生較麻煩、重復(fù)利用周期較短、物理化學(xué)穩(wěn)定較差。所以本研究為避免上述問(wèn)題及方便工業(yè)化生產(chǎn)，利用了反相硅膠。反相硅膠預(yù)處理較簡(jiǎn)單，用甲醇浸泡即可;裝柱方便;再生較簡(jiǎn)單，可重復(fù)利用周期比大孔樹(shù)脂長(zhǎng)數(shù)百倍;物理化學(xué)穩(wěn)定性較好;分離效率較高。雖然現(xiàn)在已有利用反相硅膠分離純化其他活性成分的報(bào)道［12-13］，但未見(jiàn)關(guān)于反相硅膠純化紅栆cAMP的研究，所以本研究采用C18反相硅膠純化技術(shù)純化“次等棗”cAMP并對(duì)純化條件進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

1.1.1 儀器

電子分析天平，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠;Agilent 1100型高效液相色譜儀，由Agilent G1314A型紫外檢色器、Agilent 1100型高效液相色譜儀等部分組成;FD-1-50冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;電子精密pH指示計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司;HH-S型恒溫水浴鍋，鞏義市英峪予華有限公司。

1.1.2 試劑

試驗(yàn)原料，超聲輔助提取法得到紅棗cAMP提取液。cAMP標(biāo)準(zhǔn)品(色譜純、純度為99%)，美國(guó)Sigma公司;反相硅膠(ODS C18反相硅膠，50目)，加拿大Silicycle公司;甲醇(色譜純);KH2PO4(上海市化學(xué)試劑三廠、色譜純);甲醇(分析純);試驗(yàn)用水，超純水和二重蒸餾水;KI，上海化學(xué)試劑有限公司;CHCl3，上?；瘜W(xué)試劑有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 環(huán)磷酸腺苷純化工藝流程

次等栆→清洗→切片→真空干燥→粉碎→過(guò)60目篩→次等栆粉→稱取樣品→加入溶劑→攪拌均勻→超聲輔助提取→離心→上清液→沉淀(多糖)→濃縮→過(guò)反相硅膠柱吸附→水洗→用甲醇洗脫→濃縮→過(guò)0.45 μm微孔濾膜→含量測(cè)定

操作要點(diǎn):精密稱取一定量的阿克蘇次等栆粉，按照最佳提取工藝條件下超聲輔助提取。于離心機(jī)3 500 r/min條件下離心15 min，取上清液，向上清液中加入3倍體積的無(wú)水乙醇，把紅棗多糖沉淀下來(lái)，剩下的上清液濃縮到一定體積后按照上樣液濃度、上樣液pH、上樣液流速過(guò)反相硅膠柱子吸附，然后先用水洗再以一定濃度、洗脫速度的甲醇洗脫，旋蒸濃縮，過(guò)0.45 μm微孔濾膜［14］。用高效液相色譜法進(jìn)行含量測(cè)定。

1.2.2 環(huán)磷酸腺苷含量測(cè)定

采用高效液相色譜法，按照熱那汗等［15］的方法，得到的回歸方程為:y=31.046x+56.209，R2=0.999 3，根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算環(huán)磷酸腺苷含量。

1.2.3 反相硅膠預(yù)處理

用甲醇浸泡C18反相硅膠，對(duì)其進(jìn)行預(yù)處理。然后勻漿濕法裝柱，用甲醇沖洗反相硅膠，一般情況下常規(guī)清洗、再生可以使用100%的甲醇和丙酮。

1.2.4 反相硅膠靜態(tài)吸附試驗(yàn)

精密量取預(yù)處理好的30.000 g(濕重)反相硅膠置于三角瓶中，同時(shí)做3個(gè)平行樣，加入濃縮好的提取液50 mL，密封，于振蕩器(25℃，100次/min)中振蕩，使其充分吸附12h，取上清液，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾。用高效液相色譜法進(jìn)行含量測(cè)定并計(jì)算其吸附率。

式中:c1，吸附前提取液中環(huán)磷酸腺苷的質(zhì)量濃度，μg/mL;c2，吸附后溶液中環(huán)磷酸腺苷的質(zhì)量濃度，μg/mL;Q，反相硅膠吸附量，μg環(huán)磷酸腺苷/g反相硅膠;V，樣液體積，mL;m，反相硅膠質(zhì)量，g。

1.2.5 反相硅膠靜態(tài)解吸試驗(yàn)

分別將上述充分吸附了cAMP的反相硅膠過(guò)濾，用水沖洗后濾干。再將其置于三角瓶中，分別加入體積分?jǐn)?shù)為50%甲醇溶液200 mL，密封，置于恒溫振蕩器中進(jìn)行解吸，24 h后過(guò)濾，取濾液，濃縮至25 mL，過(guò)0.45 μm微孔濾膜。用高效液相色譜法進(jìn)行含量測(cè)定并計(jì)算其解吸率。

式中:c3，解吸后溶液中環(huán)磷酸腺苷的質(zhì)量濃度，μg/mL;V，解吸液體積，mL;m，反相硅膠質(zhì)量，g;Q，反相硅膠吸附量，μg環(huán)磷酸腺苷/g反相硅膠。

1.2.6 反相硅膠靜態(tài)吸附及解吸試驗(yàn)

通過(guò)靜態(tài)吸附與解吸性能實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行動(dòng)態(tài)上樣液濃度的選擇、上樣液流速的選擇、上樣液pH值的選擇、洗脫液濃度的選擇、洗脫液流速的選擇等動(dòng)態(tài)吸附與解吸性能的考察。

1.2.7 純度的檢測(cè)

對(duì)最佳提取工藝條件下提取的次等栆提取液和用反相硅膠上柱吸附解吸后的洗脫液進(jìn)行濃縮，然后冷凍干燥，分別得到純化前后cAMP。采用高效液相色譜法進(jìn)行含量測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)品的純度為100%，通過(guò)對(duì)比峰面積確定純化前后純度的變化。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件和正交助手軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 反相硅膠靜態(tài)吸附試驗(yàn)

靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明反相硅膠的吸附率為85.59%。尤研［16］研究了 SP-825、D-101、SP-207、HZ-802型大孔樹(shù)脂對(duì)cAMP的吸附率。結(jié)果表明，吸附率最高的是SP-825，吸附率為42.80%;而崔志強(qiáng)［17］的文獻(xiàn)報(bào)道，HPD-400型大孔樹(shù)脂對(duì)cAMP的吸附率為84.1%。由此可以看出，反相硅膠的吸附率大于上述型號(hào)的大孔樹(shù)脂。

2.2 反相硅膠靜態(tài)解吸實(shí)驗(yàn)

靜態(tài)解吸實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明反相硅膠的解析率為86.53%。而尤研［16］的研究表明，大孔樹(shù)脂解析率較高的是 HZ-802、D101，它們的解吸率分別為73.46%、70.74%。反相硅膠的吸附率和解析率大于上述型號(hào)的大孔樹(shù)脂。同樣，王立霞［18］研究了LS-200型樹(shù)脂對(duì)和田玉棗cAMP的吸附率和解析率，吸附率達(dá)80.1%，但是解吸率為54.02%，綜上比較，選擇反相硅膠作為填料，并在靜態(tài)吸附解吸實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附解吸實(shí)驗(yàn)。

2.3 反相硅膠動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)

2.3.1 泄漏曲線

準(zhǔn)確稱取反相硅膠50.000g，裝于層析柱中(下同)，選擇 pH 7、濃度 70μg/mL的阿克蘇次等棗cAMP提取液，控制上樣液流速2mL/min，期間每管收集10mL，測(cè)定流出液中cAMP的濃度，確定漏點(diǎn)，并計(jì)算出每克反相硅膠的最大上樣液體積。

如圖1可知，從收集的第17份流分開(kāi)始，cAMP含量明顯升高。因此，確定第16份為漏點(diǎn)。所以50 g反相硅膠吸附飽和的最大上樣體積確定為160 mL。每克反相硅膠所吸附飽和的最大上樣體積為3.2 mL。

圖1 反相硅膠對(duì)阿克蘇次等栆cAMP的吸附泄露曲線Fig.1 adsorption curve of reverse phase silica gel leaked Aksu inferior jujube cAMP

2.3.2 上樣液濃度的選擇

取pH 7的阿克蘇次等栆cAMP提取液160 mL，選擇上樣液濃度40、50、60、70、80 μg/mL 5 個(gè)水平，以1 mL/min的流速上柱吸附，收集流出液，過(guò)0.45 μm微孔濾膜。進(jìn)行含量測(cè)定并根據(jù)公式計(jì)算其吸附率。

對(duì)于一定量的溶質(zhì)而言，上樣液濃度的增加就會(huì)使溶質(zhì)與反相硅膠接觸的表面積增加，因此反相硅膠對(duì)溶質(zhì)的吸附作用增強(qiáng)，同時(shí)吸附效果也更好。但上樣液濃度過(guò)高，將使吸附選擇性降低、cAMP泄漏時(shí)間提早。因此必須選擇適宜的吸附劑濃度。由圖2可見(jiàn)，上樣液的濃度從50 μg/mL增加到70 μg/mL時(shí)，反相硅膠的吸附量也隨之增大，最大吸附率達(dá)到61.43%。當(dāng)上樣液濃度高于70 μg/mL后，吸附率反而下降。因此上樣液的濃度為70 μg/mL時(shí)，吸附效果最好。

圖2 上樣液濃度對(duì)反相硅膠吸附率的影響Fig.2 effect of the sample concentration on adsorption rate

2.3.3 上樣液流速的選擇

取pH 6、濃度70 μg/mL的阿克蘇次等棗cAMP提取液 160 mL，分別選擇 0.5、1、1.5、2、2.5、3 mL/min 5個(gè)流速上柱吸附，其他操作同2.3.2。

上樣流速是影響上樣液向反相硅膠內(nèi)部擴(kuò)散速度的直接因素，從而影響反相硅膠的吸附效果。從圖3中可以看出，當(dāng)上樣液流速達(dá)到1.5 mL/min時(shí)，吸附率達(dá)到最大值，而隨著流速的加快，吸附率明顯減小。如果上樣過(guò)慢，吸附時(shí)間會(huì)增加，將延長(zhǎng)生產(chǎn)周期。而上樣液流速過(guò)快，反相硅膠的吸附量下降，能耗明顯增加。綜合考慮這2方面的影響，初步選擇1.5 mL/min為上樣液流速。

圖3 上樣液流速對(duì)反相硅膠吸附率的影響Fig.3 effect of the sample flow rate on adsorption rate

2.3.4 上樣液pH值的選擇

取濃度為70 μg/mL的阿克蘇次等栆cAMP提取液 160 mL，調(diào)節(jié) pH 值分別為4、5、6、7、8，以1.5 mL/min的流速上柱吸附，其他操作同2.3.2。

上樣液pH值對(duì)化合物的吸附、分離過(guò)程有很大的影響。吸附過(guò)程中，被吸附的物質(zhì)一般以分子的形式被吸附。因此為了達(dá)到較好的效果，必須使吸附物質(zhì)保持分子狀態(tài)。cAMP是弱酸性物質(zhì)［18］，磷酸基團(tuán)的pKa值約為1.0，因此在酸性或弱酸性條件下容易被吸附。由圖4可知，隨著上樣液pH的提高，cAMP吸附率也隨之提高。當(dāng)上樣液pH值達(dá)到6時(shí)，吸附率達(dá)到最大值。以后隨著上樣液pH值的提高，吸附率反而呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，在pH值小于6時(shí)，吸附情況并不理想。這是因?yàn)榉聪喙枘z表面吸附過(guò)多的酸性離子，影響到cAMP的吸附。因此，適宜的上樣液pH值為5.5～6.5。

圖4 上樣液pH值對(duì)反相硅膠吸附率的影響Fig.4 Effect of sample liquid pH on reverse phase silica gel adsorption rate

2.3.5 正交優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以吸附率%為考察指標(biāo)，采用L9(33)正交表設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 環(huán)磷酸腺苷動(dòng)態(tài)吸附正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果表Table 1 Experimental results of orthogonal test for cAMP dynamic adsorption

表2 環(huán)磷酸腺苷動(dòng)態(tài)吸附正交優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 2 Variance analysis forcAMP dynamic adsorption experiment

由方差分析結(jié)果(表2)可見(jiàn)，因素B(上樣液濃度)顯著(P＜0.05)，因素A(上樣液流速)、因素C(上樣液pH值)不顯著，因素作用的主次順序是B(上樣液濃度)＞C(上樣液pH值)＞A(上樣液流速)，與極差分析得出的結(jié)果一致。對(duì)表1正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析得出最優(yōu)水平組合為A1B2C2，上樣液流速為1mL/min、上樣液濃度為70μg/mL、上樣液pH為6。在此條件下做驗(yàn)證試驗(yàn)3次，結(jié)果平均吸附率為87.70%。

2.4 反相硅膠動(dòng)態(tài)解吸試驗(yàn)

2.4.1 洗脫曲線

準(zhǔn)確稱取100.000 g的反相硅膠，裝于層析柱中，取pH值為6、濃度為70 μg/mL的阿克蘇次等栆cAMP提取液320 mL，以1 mL/min的流速上柱吸附，先水洗，然后選擇體積分?jǐn)?shù)為50%的甲醇，以2 mL/min的流速洗脫，期間每管收集15 mL，過(guò)0.45 μm微孔濾膜后進(jìn)行含量測(cè)定繪制洗脫曲線，并計(jì)算出每克反相硅膠充分吸附后洗脫所需要的最佳洗脫劑用量。

圖5 反相硅膠對(duì)阿克蘇次等栆cAMP的50%甲醇洗脫曲線Fig.5 50%methanol elution curve of reverse phase silica gel leaked Aksu inferior jujube cAMP

如圖5可知，從收集的第12份流份開(kāi)始，收集液中未檢出cAMP含量。因此吸附飽和的100 g反相硅膠充分洗脫所需要的最低洗脫劑用量確定為165 mL。吸附飽和的每克反相硅膠所需要的最低洗脫劑用量為1.65 mL。

2.4.2 洗脫液濃度的選擇

取質(zhì)量濃度為70 μg/mL，pH 6的阿克蘇次等栆提取液320 mL，以1 mL/min的流速上柱吸附，先用水洗然后分別用165 mL的體積分?jǐn)?shù)30%、40%、50%、60%、70%、80%的甲醇溶液以2 mL/min的流速進(jìn)行洗脫，洗脫液濃縮后定容至50 mL，過(guò)0.45 μm微孔濾膜。進(jìn)行含量測(cè)定并根據(jù)公式計(jì)算其解吸率。

由圖6可知，當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)在30% ～60%內(nèi)時(shí)，隨著甲醇濃度的增加，cAMP解吸率也增加。當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到60%時(shí)，解吸率的變化趨勢(shì)基本保持平衡。為了考慮成本問(wèn)題，把60%的甲醇作為最佳洗脫濃度。

圖6 甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)反相硅膠解吸率的影響Fig.6 Influence of methanol concentration on the resolution rate of the reverse phase silica gel

2.4.3 洗脫液流速的選擇

取濃度70 μg/mL、pH 6的阿克蘇次等栆提取液320 mL，以1 mL/min的流速上柱吸附，先水洗，然后用 60%的甲醇 165 mL，分別以 1、2、3、4、5 mL/min 5個(gè)流速洗脫，其他操作同2.4.2。

圖7 洗脫劑流速對(duì)反相硅膠解吸率的影響Fig.7 Influence of eluent flow rate on the resolution rate of the reverse phase silica gel

由圖7可知，當(dāng)洗脫液流速在1～3 mL/min內(nèi)時(shí)，隨著洗脫流速的增大，cAMP解吸率也增加。當(dāng)洗脫劑流速達(dá)到3 mL/min時(shí)，解吸率達(dá)到最大值87.39%，以后隨著洗脫流速的增大，解吸率反而呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。這表明洗脫速度太快，洗脫劑和環(huán)磷酸腺苷還未充分接觸就流過(guò)了反相硅膠柱，不能充分的解吸。所以洗脫液流速定3 mL/min為宜。

2.5 純度的檢測(cè)

由圖8可以看出，純化后雜質(zhì)峰較純化前明顯減少，但是純化前峰、純化后峰與標(biāo)準(zhǔn)品峰的保留時(shí)間存在微小差異，其原因可能是紅棗提取液中的三萜酸類及其他成分影響了保留時(shí)間，引起純化前峰、純化后峰與標(biāo)準(zhǔn)品峰的保留時(shí)間有些偏差。經(jīng)計(jì)算其純化前的純度為0.098%，純化后的純度為44.69%?？梢钥闯?，純化前后純度的變化極其顯著，說(shuō)明采用反相硅膠可以達(dá)到對(duì)阿克蘇次等栆cAMP提取液初步純化的目的。為達(dá)到醫(yī)療等相關(guān)領(lǐng)域的更高要求，需通過(guò)其他純化途徑進(jìn)一步提高制品純度，這還有待于更深的研究。

圖8 純化前的cAMP粗品(a)、純化后的cAMP粗品(b)的液相色譜圖Fig.8 Before purification of of cAMP crude(a)，purified of cAMP crude(b)

3 結(jié)論

通過(guò)反相硅膠靜態(tài)試驗(yàn)和動(dòng)態(tài)試驗(yàn)篩選出純化阿克蘇次等棗cAMP的最佳條件:上樣液流速為1 mL/min、上樣液濃度為70 μg/mL、上樣液pH值為6、洗脫液為體積分?jǐn)?shù)60%的甲醇、洗脫液流速為3 mL/min。在此條件下的吸附率和解析率最高，同時(shí)還確定了最大上樣體積和最佳洗脫劑的用量。

根據(jù)以往文獻(xiàn)報(bào)道，尤逢惠［19］選用XAD 7HP大孔吸附樹(shù)脂純化栆cAMP，得到cAMP粗品，純度為3.55%;王立霞［18］等用LS 200型樹(shù)脂對(duì)和田玉棗中cAMP分離純化，得到 cAMP粗品純度為3.47%，崔志強(qiáng)［20］用HPD.400型樹(shù)脂純化冬棗 cAMP，純化后cAMP純度從0.109%增加到32.453%。本研究采用反相硅膠純化得到的cAMP粗體物的純度達(dá)到了44.69%，與以上結(jié)果對(duì)比，有明顯提高。

［1］ Nikolaus A.The current status of cyclic AMP in high plants［J］.Annual Review of Plant Physiology，1977，2(8):123-132.

［2］ Schwede F，Maronde E，Genieser H，et al.Cyclic nucleotide analogs as biochemical tools and prospective drugs［J］.Pharmacol＆ Therapeutics，2000，87(2):199-226.

［3］ Marin D，Dunphy G B，Mandato C A.Cyclic AMP affects the haemocyte responses of larval Galleria mellonella to selected antigens［J］.Journal of Insect Pysiology，2005，51(5):575-586.

［4］ Yuen L P，Wong A S T，Auersperg N.Gonadotropins regulate N-cadherin-mediated human ovarian surface epithelial cell survival at both post-translational and transcriptional levels through a cyclic AMP/protein kinase a pathway［J］.Journal of Biological Chemistry，2005，280(15):15 438-15 448.

［5］ Fabiana S，Giorgio F，Cecilia F，et al.Bordetella pertussis Inhibition of Interleukin-12(IL-12)p70 in human monocyte-derived dendritic cells blocks IL-12 p35 through adenylate cyclase toxin-dependent cyclic AMP induction［J］.Infection and Immunity，2006，74(5):2 31-2 38.

［6］ 王鏡巖.生物化學(xué)［M］(第三版).北京:高等教育出版社，2008:512-518.

［7］ 高士爭(zhēng)，張曦，程美玲.環(huán)腺苷酸的生物學(xué)作用與動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)代謝調(diào)控［J］.中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2003，30(6):21-23.

［8］ 牟德華，朱艷麗，張艷芳，等.大棗環(huán)腺苷酸及其生物學(xué)功能［J］.食品科技，2007，32(5):273-275.

［9］ Cyong J C.Cyclic Adenosine Monophosphate in the frute of ziziphus Jujuba［J］.Phytochemistry，1980，19:2 747-2 748.

［10］ 蔣勱博，王強(qiáng)，李建貴等.響應(yīng)面法優(yōu)化紅棗中環(huán)磷酸腺苷(cAMP)超聲提取工藝［J］.中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2014(1):114-120.

［11］ 蒲云峰，萬(wàn)英，侯旭杰.HPLC法測(cè)定不同品種紅棗中cAMP含量［J］.食品研究與開(kāi)發(fā)，2011，32(7):109-112.

［12］ 田毅峰，李先國(guó)，沙森潔，等.反相硅膠鍵合相的制備和性能評(píng)價(jià)［J］.2007，29(1):12-14.

［13］ 陳玉，田學(xué)軍，李蕓芳，等.金剛纂萜類成分研究［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2009，44(10):1118-1122.

［14］ 王春霞，路福平，劉逸寒，等.納膜過(guò)濾在提取紅棗環(huán)磷酸腺苷(cAMP)中的應(yīng)用［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2011，37(2):186-190.

［15］ 熱那汗·買買提，敬思群.阿克蘇“次等棗”環(huán)磷酸腺苷提取工藝優(yōu)化［J］.食品科技，2013，38(05):232-235.

［16］ 尤妍.哈密大棗環(huán)磷酸腺苷提取純化工藝研究［D］.烏魯木齊:新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

［17］ 崔志強(qiáng)，環(huán)磷酸腺苷微波輔助萃取工藝研究［J］.食品科技，2008(5):147-149.

［18］ 王立霞，陳錦屏，張娜.和田玉棗中環(huán)磷酸腺苷(cAMP)的分離純化工藝研究［J］.食品科學(xué)，2008，29(12):250-254.

［19］ 尤逢惠，潘見(jiàn)，楊毅.大孔吸附樹(shù)脂分離大棗中cAMP的研究［J］.安徽大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)(增刊)，2006，30:102-104.

［20］ 崔志強(qiáng).冬棗環(huán)磷酸腺苷提取純化工藝研究［D］.沈陽(yáng):沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.