王遠輝，宋燕燕

(河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南鄭州，450001)

艾納香(Blumea balsamifera(L.)DC.)屬菊科植物，主要分布于東亞和東南亞地區(qū)，是我西南地區(qū)傳統(tǒng)草藥，多用于苗藥和瑤藥，我國貴州羅甸為其道地產(chǎn)地［1］?！吨袊幍洹酚涊d艾納香葉與小枝是提取左旋龍腦的天然植物原料［2］，但未發(fā)現(xiàn)用其制備花椒油素的記載。目前，僅有一項專利記載利用酸堿溶液和溶劑萃取艾粉(艾納香粗提物)中花椒油素［3］?；ń酚退?xanthoxylin)，2-羥基-4，6-二甲氧基苯乙酮，分子式C10H12O4，多見于花椒果皮和某些中草藥(如烏桕根皮)中［4～5］。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證實花椒油素可抑制藥物引起的肌肉收縮和血小板凝聚，可引起小鼠心肌的自發(fā)搏動，其衍生物具有多種活性(驅(qū)蟲、殺菌、防霉)［6～9］?；ń酚退厥情g苯三酚衍生物，已有資料顯示多種間苯三酚衍生物具有生理活性，備受研究人員關(guān)注［10］。

花椒油素主要有2個來源，一個是以間苯三酚為原料，經(jīng)過?；甚シ磻?yīng)和甲基化反應(yīng)制備［11］;另一個是從天然植物中提取，常通過溶劑提取和色譜分離收集，多應(yīng)用于分析，極少用于高純產(chǎn)品制備，測定時常用反相液相色譜法［12～13］。目前，花椒油素多存在于花椒的油樹脂和精油中［4］，但蒸餾法尚未被用于制備高純花椒油素。艾納香葉因其左旋龍腦含量高受到關(guān)注，而提取左旋龍腦后的原料葉常被作為廢渣處理，其含有花椒油素的事實常被忽略，近些年才被注意。黃永林等團隊從艾納香中分離出花椒油素，并測定不同部位的含量［12，14］。譚道鵬等將艾納香粗提物艾粉溶于堿液，過濾后調(diào)酸性再萃取，最后重結(jié)晶獲得高純花椒油素［3］。在前期研究中設(shè)計冷凝回流式蒸餾法提取艾納香葉中左旋龍腦，粗提物中左旋龍腦含量超過80%，花椒油素含量極少，基本都保留于艾納香殘葉中［15］，為使艾納香葉中花椒油素得到充分利用，需設(shè)計新的工藝方案制取高純花椒油素。本實驗同時蒸餾萃取法、色譜柱層析、重結(jié)晶純化組成整體工藝制備花椒油素，并通過氣相色譜(GC)進行定量測定，通過核磁共振(NMR)進行定性驗證。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

艾納香葉于2012年12月采樣于貴州羅甸，由貴州農(nóng)科院何元農(nóng)研究員鑒定為菊科植物艾納香Blumea balsamifera(L.)CD.的葉。經(jīng)提取左旋龍腦后剩余的艾納香殘葉，水分含量為79.5%。

AR224CN電子天平，奧豪斯(上海)儀器有限公司;GC-2010氣相色譜儀(配備氫火焰離子化檢測器(FID))，日本島津;AVANCE III 400MHz核磁共振譜儀，瑞士Bruker公司。G254硅膠板和柱層析硅膠(100～200目)，青島海洋;標(biāo)準(zhǔn)品花椒油素(97%)和氘代三氯甲烷(99.8%)，上海 Sigma-Aldrich;萘(99.5%)和其他試劑(均為分析純)，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 花椒油素的測定

GC配備FID檢測器，色譜柱為CP-WAX毛細管柱(30 m × 0.32 mm × 0.5 μm，PEG-20M);升溫程序:80℃保持5 min，以10℃/min升溫，至220℃保持5 min;進樣口溫度250℃;分流比1∶5;檢測器溫度250℃;氮氣(99.99%)體積流量3 mL/min，氫氣體積流量47 mL/min，空氣體積流量400 mL/min;進樣量1 μL。溶解標(biāo)準(zhǔn)品花椒油素和內(nèi)標(biāo)萘于乙酸乙酯分別配制對照品母液，濃度0.20 mg/mL。標(biāo)準(zhǔn)品花椒油素、內(nèi)標(biāo)萘和樣品均溶解于乙酸乙酯進行GC分析。經(jīng)方法學(xué)驗證，GC測定花椒油素的線性范圍0.5 ～1 800 μg/mL，工作曲線 Y=0.893 4X-0.009 1，r為0.999 1(Y:花椒油素相對于內(nèi)標(biāo)的峰面積比，X:花椒油素相對于內(nèi)標(biāo)的濃度比)，回收率為98.63%，精密度RSD為0.22%，滿足測定對精密度和準(zhǔn)確度的要求。

1.2.2 同時蒸餾萃取(SDE)

精密稱取適量艾納香葉，加入1 L蒸餾水于2 L燒瓶中加熱至沸騰，接改進型Likens-Nickerson同時蒸餾萃取裝置，裝置另一側(cè)連接500 mL燒瓶，添加適量無水乙醚，50℃水浴加熱，從艾納香葉提取花椒油素。完成提取后，通過減壓蒸發(fā)收回?zé)o水乙醚并收集粗提物。平行進行10次積累粗提物。利用GC測定粗提物中花椒油素含量，以此確定最佳料水比、溶劑體積和提取時間。不同水平間差異通過方差分析(ANOVA)評價，P＜0.05。計算得率時按照扣去水分的艾納香葉干物質(zhì)計算。得率和回收率按下式計算:

得率/%=得到物質(zhì)質(zhì)量 /艾納香葉質(zhì)量(干基)

回收率/%=此階段收得花椒油素質(zhì)量 /基料中花椒油素質(zhì)量

1.2.3 硅膠柱層析

精密稱取粗提物，溶解于洗脫液中上樣，利用洗脫液從硅膠柱中洗脫分離目標(biāo)化合物。洗脫液按不同體積比配置［乙酸乙酯∶石油醚(60～90℃)］。使用柱層析用硅膠(50 g)裝柱(長400 mm，直徑23 mm)，精密稱量粗提物，溶于5 mL洗脫液上載樣品，以洗脫液作為流動相，以20 mL為一個單元收集流分。每單元用薄層層析點樣跟蹤分析，根據(jù)組分收集流份。通過減壓回收溶劑，收集洗脫出化合物并稱重，通過GC測定花椒油素含量，計算回收率。對層析柱的洗脫液配比(乙酸乙酯∶石油醚)、徑高比、樣品與硅膠質(zhì)量比(上樣量)和洗脫液流速進行優(yōu)化。

1.2.4 重結(jié)晶

將加熱至微沸的石油醚(60～90℃)滴加至盛放花椒油素粗品的容器中，至固體完全溶解，再多加20%的溶劑。迅速過濾，于室溫下靜置冷卻2 h，再置于4℃環(huán)境中存放2 h，最后置于–20℃環(huán)境中靜置12 h。經(jīng)過抽濾使母液和晶體分離，收集晶體;通過旋蒸除去母液中溶劑收集殘留物。再以殘留物作為基料經(jīng)過上述重結(jié)晶步驟再次收集晶體，最大限度收集花椒油素。通過3次重結(jié)晶純化花椒油素粗品，分別測定晶體和母液中殘留物的含量。

1.2.5 核磁共振分析

首先將制備的花椒油素晶體溶解于氘代三氯甲烷(純度99.8%)，濃度10 mmol/L。以四甲基硅烷為內(nèi)標(biāo)物，利用核磁共振儀測定其氫譜(1H-NMR)和碳譜(13C-NMR)。

2 結(jié)果與討論

2.1 花椒油素的提取

在制備前需建立花椒油素的測定方法，目前常用反相高效液相法［12～13］，設(shè)備運行成本較高，前期經(jīng)驗證明氣相色譜(GC)具備測定花椒油素的能力。經(jīng)過方法學(xué)驗證，GC法的工作曲線、相關(guān)系數(shù)、準(zhǔn)確度(回收率)、精密度(標(biāo)準(zhǔn)偏差)等指標(biāo)均滿足《中國藥典》分析測定的要求。首先對同時蒸餾萃取參數(shù)進行優(yōu)化，結(jié)果見圖1。根據(jù)方差分析(P＜0.05)，料水比在小于1∶8(g∶mL)時，花椒油素得率并未顯著提高(圖1-a);無水乙醚用量60 mL時，花椒油素得率遠高于用量為40 mL時，而增加用量對提高得率并無幫助(圖1-b)。無水乙醚用量偏小，使其蒸發(fā)量小，造成萃取不完全，而得率偏低;用量偏大，不僅無助于得率增加，還增加消耗和成本。由圖1-c可知，提取2.5 h后花椒油素得率未顯著(P＞0.05)增加。所以，SDE最佳參數(shù)為料水比1∶8，溶劑(無水乙醚)體積60 mL，提取時間2.5 h。粗提物呈白色(略帶黃色)，經(jīng) GC測定發(fā)現(xiàn)粗提物中花椒油素含量達20.26%(表1)。所用原料為提取左旋龍腦后剩余艾納香殘葉，為增加原料利用度，可提取其所含的花椒油素?；ń酚退氐奶崛《嗍褂靡掖肌⒁宜嵋阴サ扔袡C溶劑［4～5，12，14］，在嘗試有機溶劑提取后發(fā)現(xiàn)粗提物是黑色膏狀物，大量色素與雜質(zhì)的存在使后續(xù)分離操作難度增加。在前期研究中發(fā)現(xiàn)艾納香葉揮發(fā)油含較高比例的花椒油素［16～17］，花椒油樹脂和精油中也含有較多花椒油素［4］。因此，認為通過蒸餾可提取花椒油素，而且蒸餾得到的揮發(fā)物組分類別較少，利于分離。結(jié)果證實，同時蒸餾萃取法可從艾納香葉中獲得花椒油素，粗提物中花椒油素含量達20%(表1)。

圖1 同時蒸餾萃取法中料水比、溶劑體積與提取時間對花椒油素得率的影響Fig.1 Influence of ratio of material to water，solvent volume，and extraction time on yield of xanthoxylin in SDE

2.2 花椒油素的分離

花椒油素隨揮發(fā)物從艾納香葉中蒸餾出來，前期研究發(fā)現(xiàn)艾納香揮發(fā)物多為萜類化合物［16～17］，此類物質(zhì)可使用硅膠柱色譜分離，優(yōu)化得柱參數(shù)見圖2。圖2-a顯示，選擇體積比1∶19的乙酸乙酯∶石油醚作為洗脫液可順利分離出花椒油素，此配比極性偏弱，雖然分離速度偏慢，但分辨率較高。硅膠柱徑高比為1∶10和1∶12時都未能實現(xiàn)分離，當(dāng)徑高比為1∶14時成功分離(圖2-b);圖2-c顯示樣品與硅膠質(zhì)量比(上樣量)為1∶40和1∶60都可實現(xiàn)分離，而再增加上樣量至1∶30時不能實現(xiàn)分離，所以選擇粗提物:硅膠質(zhì)量比為1∶40;圖2-d顯示3個洗脫液流速(1.5、2.5、3.5 mL/min)的洗脫峰基本重疊，都可成功完成分離，因此選擇最大值3.5 mL/min為流速，以獲得最高洗脫效率。硅膠柱是極性柱，自身含有羥基更易吸附極性較強的物質(zhì)［18］，花椒油素在洗脫中段被洗出，說明其極性中等。GC測定顯示柱分離得到的花椒油素粗品純度為72.09%(表1)，回收率達到99.04%，說明柱分離過程幾乎不損失花椒油素。朱廷春等［14］使用300～400目硅膠分離出花椒油素，并應(yīng)用于分析，但處理量偏小。以上參數(shù)說明該色譜系統(tǒng)適合應(yīng)用于大量制備，更有希望放大為工業(yè)級水平。

圖2 洗脫液配比(a)、徑高比(b)、質(zhì)量比(c)、流速(d)對硅膠柱分離的影響Fig.2 Effects of solvent(a)，ratio of diameter to height(b)，loading quantity(c)，and flow rate(d)in silica gel column

2.3 花椒油素的純化

柱分離得到的花椒油素僅為粗品，需進一步純化，重結(jié)晶結(jié)果見表2。1次重結(jié)晶得到的花椒油素晶體純度達98.56%，可回收粗品中59.14%的花椒油素，母液殘留物包含39.51%，總和達98.65%，說明重結(jié)晶適用于純化花椒油素。對母液中剩余的花椒油素再進行重結(jié)晶，以求最大限度收集花椒油素，經(jīng)過2次、3次重結(jié)晶得到的晶體純度分別為98.47%和98.08%。在已有報道中，譚道鵬等［3］使用石油醚等溶劑通過重結(jié)晶制得高純花椒油素(純度 ＞98%)，收率為 62.6% ～83.8%;楊健等［11］使用水通過重結(jié)晶法從合成粗品中制取花椒油素，收率為60%～70%。本文中3次重結(jié)晶所得花椒油素晶體平均純度達 98.37%(表 1);累計回收率達到91.92%，優(yōu)于前輩研究。同時，說明重結(jié)晶不僅實現(xiàn)純化，還可較好的回收花椒油素。最終從艾納香葉中得到的花椒油素得率為0.28%。若再進行多次重結(jié)晶，可進一步提高回收率。

表1 不同步驟花椒油素的產(chǎn)量Table 1 Yields of xanthoxylin in different steps

表2 晶體與母液中花椒油素含量和回收率Table 2 Purities and recoveries of xanthoxylin in crystal and residue

2.4 核磁共振分析

純化后晶體的化學(xué)結(jié)構(gòu)通過核磁共振分析，結(jié)果顯示1HNMR(CDCl3，δ):2.62(3H，s，—CH3)，3.84(3H，s，—OCH3)，4.01(3H，s，—OCH3)，5.90(1H，d，J=2.6 Hz，H—3)，6.02(1H，d，J=2.7 Hz，H—5)，14.07(1H，s，—OH)。13CNMR(CDCl3，δ):32.5(—CH3)，55.5(2C，—OCH3)，90.6(C-5)，93.7(C-3)，106.3(C-1)，162.6(C-2)，166.2(C-6)，167.5(C-4)，203.3(C==O)。與文獻［19］比較，證實此晶體確為花椒油素(圖3)。

圖3 花椒油素化學(xué)結(jié)構(gòu)圖Fig.3 Structure of xanthoxylin

3 結(jié)論

以艾納香殘葉為原料，通過同時蒸餾萃取法、硅膠柱層析和重結(jié)晶純化后制備高純花椒油素。在料水比1∶8(g∶mL)時，同時蒸餾萃取2.5 h后可充分提取殘葉中花椒油素，粗提物中含量為20.26%。經(jīng)過硅膠柱層析，徑高比為1∶14，上樣量為1∶40(粗提物∶硅膠)時，分離出純度為72.09%的粗品，回收率達99.04%。最后通過3次重結(jié)晶制得高純花椒油素(98.37%)，實現(xiàn)回收91.92%的花椒油素，終得率為0.28%。

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