戴亞楠，陳曉宇，楊梅，程文翰，王凡龍，朱華國

（石河子大學農學院/新疆生產建設兵團綠洲生態(tài)農業(yè)重點實驗室，石河子 832003）

體細胞胚胎發(fā)生是植物研究合子胚生長發(fā)育的理想模型，同時也是農桿菌介導的遺傳轉化技術需要借助的重要過程，一般情況下包括愈傷組織誘導、胚性愈傷組織分化、胚狀體分化及植株再生四個過程[1]。棉花是通過體細胞胚胎發(fā)生方式獲得再生植株困難的物種[2]。目前僅有為數(shù)不多的棉花品種（基因型）通過體細胞胚胎發(fā)生過程獲得了再生植株，限制了棉花的轉基因研究和應用[3]。大量研究表明，影響體細胞胚胎發(fā)生的因素很多，其中基因型和植物激素是最重要的兩個原因[4]。

近年來，多胺作為一種重要的生長調節(jié)物質在諸多方面開展了研究?，F(xiàn)有研究表明，多胺含量的升高是體細胞胚發(fā)生前提[5]，且認為植物激素通過多胺介導對體細胞胚胎發(fā)生產生影響，其中多胺起到“第二信使”作用[6]。Kumar等[7]研究表明在胚性愈傷組織中Spm、Spd的含量均明顯高于非胚性愈傷組織，程文翰等[5]發(fā)現(xiàn)在棉花胚狀體形成期亞精胺和精胺含量顯著上升，保持高比例的 Put/(Spd+Spm)有利于胚性細胞的產生[7-13]。此外，外源添加多胺能夠促進云杉的體細胞胚胎發(fā)生[14]，而多胺在棉花組織培養(yǎng)上的應用尚未見報道。

胚性愈傷組織的分化是棉花體細胞胚胎發(fā)生的關鍵環(huán)節(jié)之一，本研究通過對不同體細胞胚胎發(fā)生能力的棉花品種進行多胺和多胺抑制劑處理，觀察多胺對棉花組織培養(yǎng)過程中胚性愈傷組織分化的影響，以期為改良棉花轉基因技術提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料

不同體細胞胚胎發(fā)生能力的4個陸地棉品種豫早1號（Y1）、新彩棉 7號（C7）、新陸早 33號（L33）和新陸早36號（L36）為本實驗供試品種，其體細胞胚胎發(fā)生能力由強至弱，由石河子大學棉花研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 棉花組織培養(yǎng)

種子去殼后，用0.1%的升汞消毒10 min，無菌水清洗3-5次；接種于無菌苗培養(yǎng)基 (1/2 MS大量元素+15 g/L葡萄糖+6.5 g/L瓊脂粉)，28℃暗培養(yǎng)5-6 d備用。將無菌苗下胚軸切為0.5-0.7 cm的小段，接種于愈傷組織誘導培養(yǎng)基(MSB附加0.1 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L KT)。4周后，繼代于生長素減半的胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)基上。

1.2.2 多胺和多胺抑制劑處理

胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)基（MSB附加0.05 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L KT），設為 3 種處理，分別為CK、附加1 mmol/L的腐胺Put和1 mmol/L的多胺抑制劑D-Arg，6周后繼代至胚性愈傷誘導培養(yǎng)基（MSB 附加 0.05 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L KT），并統(tǒng)計3種處理條件下愈傷組織的日增重量；繼代培養(yǎng)4周后，統(tǒng)計胚性愈傷組織分化率。

胚性愈傷組織分化率（%）=每個品種每個處理中分化胚性愈傷組織的下胚軸數(shù)目/每個品種每個處理中接種的下胚軸數(shù)目，每個品種每個處理接種28個下胚軸，3次重復。

1.2.3 多胺含量測定

準確稱取棉花愈傷組織0.4-1.0 g（定量）；將稱取好的材料放入預冷的研缽，加入5 mL預冷的5%高氯酸冰浴研磨（分 3次加入：2、2、1 m L），將研磨液轉移至離心管，渦旋2 min；冰浴浸提1-1.5 h；浸提液4 ℃、12000 r/min離心20 min；取500μL上清液，加入7μL苯甲酰氯、1 mL的2 mol/L NaOH，渦旋30 s，37℃水浴反應25 min；在反應液中加入2 mL飽和NaCl、2 mL乙醚，渦旋1 min后5000 r/min離心5 min；收集1 mL離心后的乙醚相于1.5 mL離心管中，真空抽濾40 min；加入100μL甲醇震蕩5 min，靜置溶解1 h；8000 r/min離心1.5 min，收集至安培瓶，加甲醇定容至500μL，待HPLC檢測。

色譜柱選擇Waters C18反相柱，流動相為甲醇：水（60∶40 v/v），流速 1 mL/min，進樣量 10 μL，檢測溫度30℃，檢測波長為254 nm，保留時間為20 min。外標法計算，峰面積使用Empower 2數(shù)據(jù)處理軟件處理。

2 結果與分析

2.1 多胺對愈傷組織增殖的影響

結果見圖1和2。

（1）不同體細胞胚胎發(fā)生能力品種的愈傷組織狀態(tài)不同，其中發(fā)生能力最強的Y1表現(xiàn)為棕色稀泥狀的愈傷狀態(tài)，且其愈傷組織增殖緩慢，然而隨著體細胞胚胎發(fā)生能力的下降，愈傷組織增殖加快（圖1）。

（2）多胺抑制劑和腐胺處理后，愈傷組織形態(tài)發(fā)生明顯變化。多胺抑制劑D-Arg可以顯著抑制愈傷組織增殖，4個品種都表現(xiàn)出嚴重的褐化（圖1），愈傷組織的日增重均少于對照（圖2），僅為對照的16.78%-50.97%。除了 Y1外，附加腐胺（Put）可以不同程度地促進愈傷組織的增殖，最多可以增加10.57%。

（3）附加腐胺對愈傷組織的形態(tài)影響較大，愈傷組織多表現(xiàn)有利于胚性愈傷組織分化的稀泥狀（圖 1）。

圖1 不處理條件下的愈傷組織狀態(tài)Fig.1 Calli states in different treatments

圖2 不同處理條件下愈傷組織日增重Fig.2 Growth speed of calli in different treatments

2.2 多胺對胚性愈傷組織分化的影響

經多胺抑制劑D-Arg和Put處理6周后繼代于胚性愈傷誘導培養(yǎng)基上，培養(yǎng)4周后統(tǒng)計胚性愈傷組織分化率。對照處理條件下，C7的胚性愈傷組織分化率最高，其次是Y1和L36，L33的胚性愈傷組織分化率最低。多胺抑制劑D-Arg處理后，L33和L36均未見胚性愈傷組織分化（圖3），C7的胚性愈傷組織分化率僅為對照的49.38%，Y1的胚性愈傷組織分化率則為對照的324%，但胚性愈傷組織分化量少，推測Y1在D-Arg處理前胚性細胞團已經存在。Put處理后，所有品種的胚性愈傷組織分化率均表現(xiàn)為提高，其中Y1和L33兩個品種表現(xiàn)最為突出，Put處理后胚性愈傷組織分化率提高了3倍多。

上述結果表明，對于Y1、C7和 L33而言，腐胺可以顯著促進棉花胚性愈傷組織的分化，可以考慮在愈傷組織形成后通過添加腐胺促進棉花胚性愈傷組織分化。

[2] 武秀明，劉傳亮，張朝軍，等.棉花體細胞胚胎發(fā)生的研究進展[J].植物學通報，2008，25(4)：469-475.Xiuming Wu，Chuanliang Liu，Chaojun Zhang，et al.Progress of somatic embryogenesis incotton[J].Chinese Bulletin of Botany，2008，25(4)：469-475.

[3] Jin S X，Zhang X L，Nie Y C，et al.Identification of a novel elite genotype for in vitro culture and genetic transformation of cotton[J].Biologia Plantarum，2006，50(4)：519-524.

[4] 王清連，王敏，師海榮.植物激素對棉花體細胞胚胎發(fā)生的誘導及調節(jié)作用[J].生物技術通訊，2004，15(6)：577-579.WANG Qinglian，WANG Min，SHI Hairong，Hormones regulation on cotton somatic embryogenesis[J].Letters Inbiotechnology，2004，15(6)：577-579.

[5] 程文翰，朱華國，李鵬飛，等.棉花多胺 HPLC的測定方法優(yōu)化及其在體細胞胚胎發(fā)生過程中的變化規(guī)律[J].棉花學報，2014，26(2)：138-144.Cheng Wenhan，Zhu Huaguo，Li Pengfei，et al.Method optimization of polyamine content by high-performance liquid chromatography and its changes in the process of somatic embryogenesis in cotton[J].Cotton Science，2014，26(2)：138-144.

[6] 劉春艷，吳強盛.多胺在植物生長發(fā)育中的作用[J].生物學教學，2010(10)：4-6.Liu Chunyan，Wu Qiangsheng.Role of polyamines in plant growth and development[J].Biology Teaching，2010(10)：4-6.

[7] Kumar V，Giridhar P，Chandrashekar A，et al.Polyamines influence morphogenesis and caffeine biosynthesis in vitro cultures of Coffea canephora P.ex Fr[J].Acta Physiol Plant，2008，30(2)：217-223.

[8] Nabha S，Lamblin F，Gillet F，et al.Polyamine content and somatic embryogenesis in Papaver somniferum cells transformed with sam-1 gene[J].Journal of Plant Physiol，1999，154(S 5/6)：729-734．

[9] Niemi K，Sarjala T，Chen X，et al.Spermidine and methylglyoxalbis（guanylhydrazone）affectmaturation and endogenous polyamine content of Scots pine embryogenic cultures[J].Journal of Plant Physiol，2002，159(10)：1155-1158．

[10] Yadav J S，Rajam M V.Temporal regulation of somatic embryogenesis by adjusting cellular polyamine content in eggplant[J].Plant Physiol，1998，11(6)：617-625．

[11]Shoeb F，Yadav J S，Bajaj S，et al.Polyamines as biomarkers for plant regeneration capacity：improvement of regeneration by modulation of polyamine metabolism in different genotypes of indica rice[J].Plant Sci，2001，160(6)：1229-1235．

[12]黃學林，李筱菊.乙烯與多胺的生物合成與植物體細胞胚胎發(fā)生[J].植物生理學通訊，1995，31(2)：81-85.Huang Xuelin，Li Xiaoju.The relations of biosynthesis of ethylene and polyamines to somatic embryogenesis of plants[J].Plant Physiology Communications，1995，31(2)：81-85.

[13] 張建偉，王軍輝，馬建偉.粗枝云杉胚性愈傷組織增殖后期的體細胞胚發(fā)生方式轉變[J].植物生理學報，2014，50(2)：197-202.ZHANG Jianwei，WANG Junhui，MA Jianwei.The way chanange of somatic embryogenesis at the late stage of embryogenic callus proliferation of picea asperata mast[J].Plant Physiology Journal，2014，50(2)：197-202

[14] 李官德，肖娟麗，羅曉麗，等.不同棉花愈傷組織狀態(tài)與胚胎發(fā)生及其植株再生的關系[J].山西農業(yè)科學，2006，34(1)：29-31.LI Guan-de，XIAO Juan-li，LUO Xiao-li，et al.Somatic embryogenesis and plant regeneration of calli derived from cotton(Gossypium hirsutum L.)depending on their quality[J].Jouranl of Shanxi Agricultural Sciences，2006，34(1)：29-31.