王新敏 ，章樂 ，趙靜 ，李強 ，倪釗 ，李應龍 ，錢彪 ，王勤章

（1石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院泌尿外科，石河子 832002；2石河子大學醫(yī)學院病理生理教研室，石河子 832002；3石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院放療科，石河子 832002）

前列腺癌（Prostate Cancer，PCa）為老年病，傳統(tǒng)的手術、放療、化療和激素療法對激素難治性前列腺癌治療效果不佳，國內(nèi)外許多學者都在探求其在基因水平的調控方法和尋找治療的新靶點。p21活化激酶6(p21-activated kinase 6，PAK6)是一種最近被證實而且很少被了解的p21激活的磷酸化蛋白激酶家族成員之一[1]。在前期的研究中我們發(fā)現(xiàn)前列腺癌組織中，PAK6的蛋白表達和mRNA的表達均呈陽性，并遠遠高于前列腺增生組織，和前列腺癌的分化程度密切相關[2-3]。提示臨床上若要全面阻斷雄激素作用，除要阻斷雄激素受體的信號外，還需抑制其旁路蛋白的激酶活性。本研究使用本課題組前期篩選并保存的靶向PAK6的shRNA，利用RNA干擾技術沉默PAK6基因的表達，研究PAK6沉默后對前列腺癌細胞放療敏感性的影響，探討能否通過干預PAK6增加前列腺癌細胞的放療敏感性，為前列腺癌分子治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

前列腺癌細胞株LNCaP由本室保存，1640培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶購自Gibco公司。攜帶GFP綠色熒光的PAK6-shRNA質粒和shNC對照質粒由上海吉凱基因化學技術有限公司合成，前期篩選出并由本實驗室保存。PAK6多克隆抗體購自Santa Cruz公司；β-actin單克隆抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記的IgG抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司。ECL化學發(fā)光試劑盒購自美國Millipore公司。LipofectamineTM2000、購自美國Invitrogen公司。CCK-8購自DOJINDO公司。

1.2 方法

1.2.1 LNCaP細胞的培養(yǎng) LNCaP細胞在含10%FBS胎牛血清的1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2飽和濕度。

1.2.2 PAK6-shRNA、shNC轉染 LNCaP細 胞轉染前24 h取對數(shù)生長期的LNCaP細胞，胰酶消化，用含10%FBS胎牛血清1640培養(yǎng)液（不含抗生素）重懸，細胞調整密度為2×105/L接種于六孔板中，每孔2 mL，待細胞融合度達到85%轉染為宜。轉染時以250μL OPTI-MEM培養(yǎng)基稀釋10μL LipofectamineTM2000，再以250μLOPTI-MEM培養(yǎng)基稀釋4μg質粒DNA，指腹輕彈混勻。室溫放置5min后將兩者混合，室溫孵育20 min。吸去培養(yǎng)板中的無血清DMEM培養(yǎng)基，然后將500μL shRNALipofectamineTM2000混合液逐滴加入到培養(yǎng)板中，輕混至于37℃ 5%CO2培養(yǎng)。4～6 h后更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)備用。

1.2.3 實驗分組 實驗分為LNCaP組（空白對照組）；LNCaP+shNC組（空質粒對照組）；LNCaP+shRNA組（基因沉默組）。各組轉染24 h后進行PAK6蛋白表達情況測定；并接受0、1、3、5 Gy單次劑量放射治療，48 h后進行增殖和凋亡檢測。

1.2.4 Western Blot分析PAK6蛋白表達情況用核算蛋白測定儀進行蛋白濃度測定、配平。進行SDS-PAGE（12%分離膠、5%濃縮膠）。用 Biorad的半干電轉儀將蛋白轉移到PVDF膜上，電壓23V，40 min。室溫封閉 2 h，分別加入一抗(PAK6和 β-actin抗體)、二抗，用 Millipore公司化學發(fā)光試劑盒顯影并壓片曝光。用凝膠成像儀分析系統(tǒng)Image Lab軟件對Western blot檢測條帶進行灰度值掃描。計算目的蛋白與β-actin灰度值比值和統(tǒng)計學分析。

1.2.5 CCK-8法檢測細胞的增殖情況 將轉染24 h后的各組細胞接種于96孔板繼續(xù)培養(yǎng)，每組設置3個復孔，單次放療48 h后取出相應的孔板，加入 CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后測定450 nm波長處的吸光度值（A值）。

1.2.6 流式細胞儀檢測細胞的凋亡情況 用冷PBS對細胞洗滌2遍，制備單細胞懸液，再用冷PBS洗劑細胞2次；用冷的、制備好的1×binding buffer重懸細胞，調整細胞濃度為 1×106/mL，將不同的處理組各吸取100μL的細胞懸液到干凈流式EP管中。每個管都加入5μL的Annexin V-APC和10μL的7-AAD，輕輕混合，置于4℃冰箱避光 15 min，再增加 380μL的 1×binding buffer置每個EP管，通過流式細胞儀對各組細胞進行檢測。

1.3 統(tǒng)計學分析

利用SPSS16.0軟件處理數(shù)據(jù)，實驗所得數(shù)據(jù)資料進行單因素方差分析(ANOVA)比較各組間差異，P＜0.05表示有統(tǒng)計學顯著性差異。

2 結果

2.1 轉染24h后PAK6蛋白表達情況

轉染24 h后PAK6蛋白表達情況見圖1。

圖1 Western Blot檢測PAK6的表達Fig.1 PAK6 expression in different groups by Western Blot

各組細胞在轉染24 h后β-actin蛋白條帶亮度相似，但PAK6條帶亮度有明顯差異(圖1a)。shRNA質粒轉染組的PAK6蛋白條帶亮度明顯低于LNCaP組和LNCaP+shNC組。LNCaP組和LNCaP+shNC組在24 h無顯著性差異（P＞0.05）。但LNCaP+shRNA與LNCaP組、LNCaP+shNC組相比均存在顯著性差異(P＜0.05)。表明實驗室保存的靶向PAK6-shRNA質?？擅黠@下調LNCaP細胞PAK6蛋白表達水平（圖1b)。

2.2 LNCaP細胞的增殖情況

LNCaP細胞的增殖情況見表1，圖2。各組細胞在轉染 24 h后進行了 0、1、3、5 Gy單次劑量放射治療與對照組相比，shRNA干擾組細胞對放療的敏感性明顯高于LNCaP組和LNCaP+shNC組，細胞增殖明顯受到抑制，并且隨著劑量的增加，基因沉默組的增殖抑制越明顯(P＜0.05)。

注：與 LNCaP+shNC和 LNCaP組比較，*表示 P＜0.05，與 0Gy組比較，#表示 P＜0.05。

圖2 LNCaP細胞的增殖情況Fig.2 The proliferation of LNCaP cells

2.3 LNCaP細胞的凋亡情況

LNCaP細胞的凋亡情況見（表 2，圖 3）。通過檢測各處理組的凋亡率發(fā)現(xiàn)，各組的凋亡率在放射劑量增加時均有顯著提高(P＜0.05)，而 shRNA干擾組的細胞在放射劑量為 0、1、3、5 Gy時均高于LNCaP組和LNCaP+shNC組，并且在放射劑量為5 Gy時明顯高于 0 Gy劑量組(P＜0.05)；而 LNCaP組和LNCaP+shNC組在放射劑量相同時均無明顯差別。

注：與 LNCaP+shNC和 LNCaP組比較，*表示 P＜0.05，與0Gy組比較，#表示 P＜0.05。

圖3 LNCaP細胞的凋亡情況Fig.3 The apoptosis rate of LNCaP cell with the action of PAK6 shRNA assayed with flow cytometry

3 討論

前列腺癌是歐美國家最常見的腫瘤，隨著人類平均壽命的延長和診斷技術的提高，前列腺癌在世界癌癥總發(fā)病數(shù)中占十分之一，全球范圍內(nèi)每年約有20萬患者死于前列腺癌。在美國，前列腺癌已經(jīng)躍居第2位致死癌，約半數(shù)年齡大于50歲男性前列腺中可發(fā)現(xiàn)癌細胞。我國進入了老齡社會，并且人民生活水平有了顯著提高，脂肪性食物攝入過多，前列腺癌的發(fā)病率有明顯增加的趨勢；新疆少數(shù)民族居多，飲食結構較為單一，以肉食為主，所以此類疾病在新疆是極為重要的一種腫瘤性疾病。

大多數(shù)前列腺癌患者早期無明顯臨床癥狀，所以一旦發(fā)現(xiàn)并被確診時往往常常已屬晚期，失去根治性手術時機；且在采用以雄激素全阻斷為主的內(nèi)分泌治療方式一段時期后，常常轉為雄激素非依賴性前列腺癌 (androgen independent prostate Cancer，AlPC)或抵抗性前列腺癌，對常規(guī)內(nèi)分泌治療不再有效，甚至出現(xiàn)復發(fā)或多發(fā)轉移[4]。而傳統(tǒng)的手術、放療、化療和激素療法對這種激素難治性前列腺癌(hormone-refraetory prostat cancer，HRPC)治療效果不佳，所以國內(nèi)外許多學者都在探求對前列腺癌基因水平的調控方法和尋找治療新靶點，還有一些研究嘗試聯(lián)合化療和基因治療結合的方式，以期在前列腺癌的治療上取得突破。

現(xiàn)有研究表明，雄激素在前列腺（癌）的生長、轉移與分化中起決定性作用[5]。雄激素主要是通過雄激素受體（androgen receptor，AR）在前列腺細胞中傳遞信號[4]，同時受到雄激素受體關聯(lián)蛋白（ARAP）等旁路信號的調節(jié)。而新發(fā)現(xiàn)的p21活化激酶6(p21-activated kinase 6，PAK6)可與AR的配體結合域（LBD）上的氨基酸序列629-919結合，它也是通過酵母雙雜交識別出來的新ARAP。PAK6能結合到AR代表著唯一所知的PAK家族成員和雄激素受體之間的相互作用[6]。在前期的研究中我們發(fā)現(xiàn)前列腺癌組織中，PAK6的蛋白表達和mRNA的表達均呈陽性，并遠遠高于前列腺增生組織，和前列腺癌的分化程度密切相關[2-3]。所以PAK6可能參與了前列腺癌與激素相關的腫瘤的生物學行為，因此臨床上若要全面阻斷雄激素作用，除要阻斷雄激素受體的信號外，還需抑制其旁路蛋白的激酶活性。本研究利用前期篩選出的靶向PAK6的shRNA，從細胞水平研究阻斷PAK6表達在前列腺癌放療中的作用，探討其可否作為前列腺癌分子治療的靶點。

本研究用實驗室前期篩選出的靶向PAK6的shRNA作用于激素依賴性前列腺癌細胞株LNCaP，并以空質粒shNC作為對照，檢測在放療劑量為0、1、3、5 Gy的條件下，LNCaP對放療的敏感性是否有所增加。結果發(fā)現(xiàn)，各組的凋亡率在放射治療時均有增加，細胞增殖也明顯受到抑制；并且 shRNA干擾組的LNCaP細胞在放射劑量為0、1、3、5 Gy時凋亡率均高于LNCaP組和LNCaP+shNC組，并且在放射劑量為5 GY時明顯高于0 GY劑量組 (P＜0.05)；其增殖情況則相反，并且隨著放射劑量的增加這種趨勢愈加明顯。而LNCaP組和LNCaP+shNC組在放射劑量相同時凋亡率和增殖情況均無明顯差別。這說明，當我們使用靶向PAK6的shRNA干擾PAK6的基因及蛋白表達時，可能增加LNCaP細胞對放射治療的敏感性，導致殺傷更多的前列腺癌細胞，增加了其凋亡率及抑制了該細胞的增殖。這可能與PAK6參與AR的信號傳導途徑有關。因為有研究表明，在多種腫瘤的靶向治療中，P21活化蛋白激酶家族顯示出很好的開發(fā)潛能[7-9]，有多種腫瘤細胞可以通過抑制激酶蛋白的表達而改變癌細胞對化療藥物的敏感性[10-12]。而ARAP信號通路傳導當中 ，PAK6活 化 與 MKK6 (MAP kinase kinase6)/P38MAPK信號通路密切相關[8]。本實驗產(chǎn)生的結果是否與這一通路有關，我們將做進一步的研究。因此，通過基因沉默的方式干擾PAK6的表達或者干擾其信號通路，有可能對前列腺癌生長調控和干預治療提供一定的幫助，作為臨床上治療前列腺癌的一個有力參考。

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