李佳，蘇珊珊，張雅，方賀，陳文

（石河子大學(xué)藥學(xué)院，石河子 832002）

近年來(lái)，隨著基因工程的發(fā)展，蛋白質(zhì)多肽類(lèi)藥物已實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，因其不良反應(yīng)少，易吸收等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于臨床。但該類(lèi)藥物易降解、變性、半衰期短、生物利用度低[1]，常制備成凍干粉末制劑，用于注射給藥，并需要多次給藥，給患者帶來(lái)了很大的痛苦。因此開(kāi)展蛋白質(zhì)多肽類(lèi)藥物緩釋系統(tǒng)的研究具有重要意義。

Chenite等[2]首先報(bào)道了殼聚糖/β-甘油磷酸鈉（chitosan/β-glycerophosphate，CS/β-GP） 可注射中性溫敏凝膠體系，該體系在室溫下呈液態(tài)，生理溫度下凝膠。由于其具有良好的生物相容性，低的免疫原性，抗菌性及細(xì)胞親和性，已廣泛應(yīng)用于組織工程[3-5]及蛋白質(zhì)類(lèi)藥物傳遞系統(tǒng)[6-7]。近年來(lái)，有學(xué)者研究了CS/β-GP凝膠系統(tǒng)成膜后作為生物醫(yī)用材料的可能性，表明該水凝膠膜生物相容性好，蛋白吸附能力強(qiáng)，但其力學(xué)性能較差，藥物釋放速度快[8-9]，因此不能很好地滿足臨床需要。

多壁碳納米管（multi-walled carbon nanotubes，MWCNTs）具有獨(dú)特的力學(xué)性能、導(dǎo)電性及熱穩(wěn)定性，但不能很好的溶于水和有機(jī)溶劑中，易團(tuán)聚。研究表明，將聚酰胺 -胺（polyamidoamine dendrimers，PAMAMA）接枝到MMWCNTs上得到的胺功能化碳納米管具有分散性好、蛋白吸附能力強(qiáng)及細(xì)胞毒性低等優(yōu)點(diǎn)[10-12]。本研究利用CS/β-GP水凝膠體系在37℃發(fā)生相變的特性，采用溶劑蒸發(fā)法[13]制備CS/β-GP水凝膠膜，利用MWCNTs-PAMAM復(fù)合物，增強(qiáng)CS/β-GP膜的機(jī)械強(qiáng)度，減慢其釋藥速率，從而構(gòu)建一種新型緩釋蛋白類(lèi)藥物的材料。

1 材料與方法

1.1 材料

VXC130型細(xì)胞破碎儀（美國(guó)SONICS公司）；8400S型傅立葉紅外光譜儀（日本島津公司）；SU8010型高分辨場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡（日本電子公司）；ALPHA 1-2LD PLUS型真空冷凍干燥機(jī)（德國(guó)Christ公司）；PHS-3C型精密pH計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；INSTRON3366型拉力機(jī)（美國(guó)英斯特朗公司）；DSA100型接觸角儀（德國(guó)Kruss公司）；Thermo3001型多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司）；聚四氟乙烯模具（4×4 cm，濟(jì)南岱罡生物工程有限公司）；7301型測(cè)厚規(guī)（日本三豐精密儀器有限公司）。CS（Chitosan，分子量：100000-300000，批號(hào)：20120503，成都市科龍化工試劑廠）；β-GP（β-glycerophosphate，純度＞97%，上海源葉生物科技有限公司）；羧基化多壁碳納米管（MWCNTs-COOH，直徑 20-40 nm，長(zhǎng)度＜5 μm，純度＞97%，深圳納米港科技有限公司）；G 3.0PAMAM（美國(guó) Sigma公司）；1-乙基 -（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC·HCL，北京索萊寶生物科技有限公司）；N-羥基琥珀酰亞胺（NHS，北京索萊寶生物科技有限公司）；BSA（Bovine Serum Albumin，純度＞98%，Sigma）；BCA蛋白濃度試劑盒（Protein Assay Kit，批號(hào)：PC0020，北京索萊寶生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 MWCNTs-PAMAM 復(fù)合物的制備[10]

稱取EDC和NHS各100.0 mg，加入100.0 mL于細(xì)胞破碎儀中分散好的0.1 mg/mLMWCNTs-COOH水溶液中，超聲 15 min，靜置反應(yīng) 2 h，13000 r/min離心15 min，蒸餾水清洗3-4次。離心后的產(chǎn)物重新分散于蒸餾水中，緩慢滴加適量PAMAM乙醇溶液，超聲15 min，避光反應(yīng)2 h，所得混合液離心分離，純水透析72 h，雙蒸水清洗 3-4次，55℃烘干備用，由熱重分析得知MWCNTs-PAMAM復(fù)合物中PAMAM的接枝率為6.7%。

1.2.2 水凝膠膜的制備

稱取CS 60.0 mg，加入5.0 mL 0.8%的冰乙酸，磁力攪拌 2 h。取 0.9 gβ-GP，溶于1.0 mL去離子水，逐滴加入到CS溶液中，攪拌 30.0 min，加入一定質(zhì)量的MWCNTs-PAMAM復(fù)合物水溶液，攪拌均勻，靜置2 h脫泡，測(cè)定pH，將混合液注入聚四氟乙烯模具中，水平置入37℃恒溫培養(yǎng)箱中，干燥24 h成膜。同時(shí)制備空白膜（不加MWCNTs-PAM AM）。用測(cè)厚規(guī)測(cè)定各組膜的厚度。

含BSA復(fù)合膜的制備：將10.0 mgBSA溶于500 μL去離子水中，緩慢加入到上述含有MWCNTs-PA MAM的CS/β-GP溶液中，攪拌過(guò)夜，靜置2 h脫泡，注入聚四氟乙烯模具中，水平置入37℃恒溫培養(yǎng)箱中，干燥24 h，制得含0.625 mg/cm2BSA的載藥膜。以不加MWCNTs-PAMAM含相同質(zhì)量BSA的CS/β-GP膜為對(duì)照。

1.2.3 SEM表征

將膜于液氮中脆斷，冷凍干燥后載于導(dǎo)電膠布上，噴金，SEM觀察復(fù)合膜的斷面及表面形貌。

1.2.4 FTIR表征

將膜干燥后研磨成粉末，進(jìn)行溴化鉀壓片，測(cè)試分辨率 2 cm-1，掃描范圍 4000-400 cm-1，同時(shí)采集純CS、β-GP和MWCNTs-PAMAM 粉末的紅外圖譜作對(duì)照。

1.2.5 溶脹度測(cè)定

將膜裁成 1×1 cm大小，37℃干燥至恒重（W0），置于離心管中，加入10 mLpH7.4的PBS溶液，24 h后，擦去表面水分稱重（W），計(jì)算溶脹比（Rs）。

Rs=[(W-W0)/W0]×100%。

1.2.6 力學(xué)性能測(cè)試

將膜裁成10×40 mm的長(zhǎng)條，測(cè)定厚度。室溫下采用萬(wàn)能電子試驗(yàn)機(jī)測(cè)量力學(xué)性能，有效長(zhǎng)度為20 mm，拉伸速度設(shè)定為10 mm/min。

1.2.7 接觸角測(cè)試

將膜裁成10×40 mm的長(zhǎng)條，37℃干燥至恒重，固定于樣品臺(tái)上，蒸餾水作為測(cè)試液體，室溫下測(cè)量液滴剛接觸到膜表面的接觸角。

1.2.8 降解性能考察

將膜裁成1×1 cm大小，37℃干燥至恒重（W0），置于離心管中，加入10 mLpH7.4的PBS溶液，于恒溫水浴搖床中，37℃低速震蕩（振蕩頻率60.0 r/min，振幅24.0 mm），一定時(shí)間取出，37℃干燥至恒重（W），計(jì)算失重率（WL），繪制時(shí)間 -失重率曲線。

WL=[(W0-W)/W0]×100%。

1.2.9 體外釋放BSA試驗(yàn)及釋藥動(dòng)力學(xué)方程擬合

將含有BSA的載藥膜裁成1×1 cm大小，置于離心管中，加入10 mL pH 7.4的PBS溶液，于恒溫水浴搖床中，37℃低速震蕩（振蕩頻率60.0 r/min，振幅24.0 mm），每隔一段時(shí)間取出1 mL釋放液，4℃保存，同時(shí)補(bǔ)充同溫的1 mLPBS，用BCA試劑盒測(cè)定釋放液中的蛋白濃度，計(jì)算BSA累積釋放度，繪制釋放時(shí)間-累積釋放度曲線。

累積釋放度=（BSA釋放量/復(fù)合膜中BSA總量）×100%。

以含 0.5 mg/cm2MWCNTs-PAMAM的 CS/β-GP膜為例，應(yīng)用Origin8.0軟件將釋放結(jié)果用常見(jiàn)的釋放動(dòng)力學(xué)模型進(jìn)行擬合，尋找描述藥物釋放的最佳模型，初步探討該復(fù)合膜的釋藥機(jī)制。

2 結(jié)果與分析

2.1 SEM表征

CS/β-GP膜與 MWCNTs-PAMAM/CS/β-GP膜的SEM表征(圖 1)，CS/β-GP 膜斷面圖（圖 1a）顯示出該膜具有較疏松的結(jié)構(gòu)，但由于CS/β-GP溶液在揮干成膜后，CS分子與β-GP分子間的疏水作用變小或者消失，使得膜的網(wǎng)架結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了一定程度的塌陷，CS/β-GP膜的表面圖（圖1b）表明該膜表面較為光滑。MWCNTs-PAMAM/CS/β-GP膜斷面結(jié)構(gòu)（圖 1c）較CS/β-GP膜致密，未見(jiàn)明顯團(tuán)聚體，MWCNTs-PA MAM/CS/β-GP膜表面（圖 1d）較 CS/β-GP膜明顯粗糙。

圖1 CS/β-GP膜與 MWCNTs-PAMAM/CS/β-GP膜的SEM圖Fig.1 SEMimages of CS/β-GP film and MWCNTs-PAMAM/CS/β-GP film

2.2 FTIR表征

膜的FTIR表征（圖2），CS/β-GP膜的紅外圖譜中(圖2 d)，CS原位于3462 cm-1的羥基（-OH）與氨基（-NH2）重疊振動(dòng)吸收峰發(fā)生了紅移變?yōu)?400 cm-1，峰形變得平緩，說(shuō)明重疊的CS的N-H基與β-GP的O-H基結(jié)合形成氫鍵作用。CS的-NH2位于1654 cm-1和1601 cm-1處的I，II的特征峰也發(fā)生了紅移，暗示-NH2與磷酸根 (PO43-)之間形成離子鍵。同時(shí)無(wú)機(jī)相PO43-位于900-1200 cm-1處的伸縮振動(dòng)吸收峰仍存在，說(shuō)明體系中β-GP只起到中和H+作用。此外，CS的C-H位于2866-2926 cm-1處的對(duì)稱吸收峰減弱，表明C-H與O-H基之間發(fā)生了靜電作用。

MWCNTs-PAMAM/CS/β-GP復(fù)合膜的紅外圖譜（圖2e）中含有CS/β-GP復(fù)合膜和MWCNTs-PAMAM復(fù)合物的特征吸收峰，與CS/β-GP膜紅外光譜比較可知，位于3400 cm-1和1664 cm-1處的吸收峰隨著MWCNTs-PAMAM的加入向低頻方向移動(dòng)，表明-NH2與加入的MWCNTs-PAMAM復(fù)合物形成了氫鍵，推測(cè)MWCNTs-PAMAM復(fù)合物可以影響膜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

2.3 膜的基本性能

CS/β-GP溶液pH為7.15左右，接近生理pH，隨著MWCNTs-PAMAM的加入，pH無(wú)明顯變化，近中性的pH值可以保證蛋白質(zhì)類(lèi)藥物活性不被破壞（表 1）。

干燥成膜后，含有MWCNTs-PAMAM水凝膠膜厚度較單純CS/β-GP膜厚度有所下降，這是由于MWCNTs-PAMAM的加入導(dǎo)致復(fù)合膜三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)變得結(jié)實(shí)密集，使得厚度下降，與SEM結(jié)果一致。CS/β-GP膜溶脹度僅為50%左右，加入MWCNTs-P AMAM后，溶脹度增大2～4倍，由于加入MWCNTs-PAMAM后，氫鍵作用增強(qiáng)，有助于增大膜的溶脹度，并且隨著 MWCNTs-PAMAM參雜量的增加，溶脹度呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)。

2.4 力學(xué)性能測(cè)試

膜的力學(xué)性能隨MWCNTs-PAMAM摻雜量的變化（表2）。加入MWCNTs-PAMAM后，拉伸應(yīng)力較CS/β-GP膜提高了2～3倍，但隨著MWCNTs-PAMAM摻雜量的增加，拉伸應(yīng)力并沒(méi)有持續(xù)增加，當(dāng)MWCNTPAMAM的摻雜量為0.7 mg/cm2時(shí)，增加量下降，由于MWCNTs長(zhǎng)徑比大，摻雜量大時(shí)，易團(tuán)聚，受到外力作用易造成應(yīng)力集中使膜斷裂，使得拉伸應(yīng)力下降。MWCNTs是一種高剛度的材料，因此，摻雜MWCNTs-PAMAM后，膜的彈性模量提高了2-14倍，但加入量為0.7 mg/cm2時(shí)，增加有所下降，由于在網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中，更多的MWCNTs團(tuán)聚，使得復(fù)合膜彈性模量下降。相對(duì)于剛性作用，碳納米管對(duì)復(fù)合膜的斷裂伸長(zhǎng)率貢獻(xiàn)不大。

2.5 接觸角測(cè)試

膜的接觸角隨MWCNTs-PAMAM摻雜量的變化（圖3）。接觸角小于90°即表明該材料親水，因此CS/β-GP 膜（圖 a1，a2）及 MWCNTs-PAMAM/CS/β-GP膜 (圖 b1-d2)均具有一定的親水性，由于CS及β-GP中均含有含氧官能團(tuán)，有利于膜的親水性，因此CS/β-GP膜具有較好的親水性，接觸角為71.38°±1.07°。當(dāng)加入MWCNTs-PAMAM后，復(fù)合膜的水接觸角分別為：63.65°±2.91°，63.15°±3.93°及 61.73°±2.17°，這是由于PAMAM外部具有大量親水基團(tuán)，有助于提高膜的親水性能，因而接觸角下降。

圖3 不同CS/β-GP膜接觸角測(cè)試 n=6 Fig.3 The contact angle test of diffirent CS/β-GP films

2.6 體外降解性能

膜的降解性能隨MWCNTs-PAMAM摻雜量的變化（圖4）。各組膜1 d內(nèi)均出現(xiàn)明顯失重，CS/β-GP膜失重率達(dá)62%，含MWCNTs-PAMAM的CS/β-GP膜達(dá)53%-58%，由于在溶劑揮發(fā)成膜過(guò)程中，大量起中和溶液中 H+作用的β-GP沉積在膜結(jié)構(gòu)中，遇PBS溶解，引起膜的明顯失重。第2 d開(kāi)始，各組失重率均有所減慢逐漸趨于平緩，這是由于交聯(lián)的CS鏈及與CS物理鍵合的β-GP維持膜的結(jié)構(gòu)，在近中性環(huán)境中，CS幾乎不溶解，因此，膜的失重變慢。20 d內(nèi)，CS/β-GP膜失重率達(dá) 88%，摻雜有MWCNTs-PAMAM的CS/β-GP膜達(dá)78%-83%，由于摻雜MWCNTs-PAMAM后，膜結(jié)構(gòu)致密，降解較CS/β-GP膜緩慢，并且MWCNTs-PAMAM摻雜量越高，交聯(lián)程度越高，降解越慢。

圖4 摻雜不同質(zhì)量MWCNTs-PAMAM的CS/β-GP膜體外降解曲線Fig.4 The degradation curves of CS/β-GP films containing diffirent quality of MWCNTs-PAMAM in vitro

2.7 體外釋放BSA曲線

膜體外緩釋BSA曲線隨MWCNTs-PAMAM摻雜量的變化（圖 5）。

各組膜在12 h內(nèi)釋放速率均較快，單純CS/β-GP膜釋放量為32%，含MWCNTs-PAMAM的復(fù) 合 膜 釋 放 量 為 15%～24%。12～48 h內(nèi) 含MWCNTs-PAMAM的 CS/β-GP膜釋放速率有所減慢，累積釋放度為31%～43%，而CS/β-GP膜達(dá)到55%，這是由于CS/β-GP膜網(wǎng)絡(luò)支架中的β-GP溶解，更容易形成孔洞，造成BSA釋放速度快。48 h后各組膜釋放速率均明顯減慢并逐漸趨于平緩，CS/β-GP膜16 d內(nèi)BSA累積釋放度達(dá)到 76%，而含MWCNTs-PAMAM的CS/β-GP膜BSA累積釋放度為60%～68%，且隨著MWCNTs-PAMAM復(fù)合物質(zhì)量的增加，BSA的累積釋放度減小。

由于MWCNTs-PAMAM的存在，藥物分子不易從網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中釋放出來(lái)，在一定程度上減輕了BSA的突釋并減緩了其擴(kuò)散釋放。

圖5 摻雜不同質(zhì)量MWCNTs-PAMAM的CS/β-GP膜累積釋放BSA曲線Fig.5 The cumulative released BSA curves of CS/β-GP films containing diffirent quality of MWCN Ts-PAMAM

2.8 釋藥模型的擬合

以含0.5 mg/cm2MWCNTs-PAMAM的水凝膠膜為例進(jìn)行擬合，各模型擬合方程及擬合相似度見(jiàn)表3，其中Weibull方程的相關(guān)系數(shù)為 0.99158，為最優(yōu)模型，即該膜以擴(kuò)散及溶蝕為釋藥機(jī)制。

3 討論

通過(guò)溶劑揮發(fā)法成功制備出含MWCNTs-PAMAM復(fù)合物的CS/β-GP水凝膠膜。結(jié)果表明，摻雜MWCNTs-PAMAM后，形成的膜表面粗糙，內(nèi)部結(jié)構(gòu)比較致密，這將有助于細(xì)胞的粘附和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的交換，為該膜應(yīng)用于組織工程方面提供了可能。MWCNTs本身具有增加復(fù)合材料力學(xué)強(qiáng)度的屬性，因此摻雜MWCNTs-PAMAM可以顯著增強(qiáng)CS/β-GP膜的力學(xué)性能。由于MWCNTs-PAMAM的加入填補(bǔ)了CS/β-GP水凝膠網(wǎng)絡(luò)的孔隙，影響了凝膠結(jié)構(gòu)，從而為藥物的緩釋提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，同時(shí)MWCNTs-PAMAM本身具有強(qiáng)的蛋白吸附能力，在釋放過(guò)程中，BSA不易解析，一定程度上減緩了BSA的釋放，該膜的釋藥機(jī)制比較復(fù)雜，藥物不僅可以從骨架中擴(kuò)散出來(lái)，并且膜骨架本身也在降解。該水凝膠膜制備工藝簡(jiǎn)單，條件溫和，為應(yīng)用于植入型緩釋蛋白質(zhì)類(lèi)藥物方面提供了可能，本實(shí)驗(yàn)后期將進(jìn)一步研究該材料的細(xì)胞毒性及生物相容性。

[1] Agarwal P，Rupenthal ID.Injectable implants for the sustained release of protein and peptide drugs[J].Drug discovery today，2013，18(7-8)：337-349.

[2] Chenite A，Buschmann M，Wang D，et al.Novel injectable neutral solutions of chitosan form biodegradable gels in situ[J].Biomaterials，2000，21(21)：2155-2161.

[3] Tahrir F G，Ganji F，Ahooyi T M.Injectable thermosensitivebased hydrogels for tissue engineering and drug delivery applications[J].Recent Patents on Drug Deliver，2015，9(2)：107-120.

[4] Riva R，Ragelle H，Rieux A，et al.Chitosan and chitosan derivatives in drug delivery and tissue engineering[J].Chitosan for BiomaterialsⅡ，2011，244：19-44.

[5] Zhou H Y，Jiang L J，Cao P P，et al.Glycerophosphatebased chitosan thermosensitive hydrogels and their biomedical applications[J].Carbohydrate Polymers，2015，117：524-536.

[6] Khodaverdi E，Tafaghodi M，Ganji F，et al.In vitro insulin release from thermosensitive chitosan hydrogel[J].American Association of Pharmaceutical Scientists，2012，13(2)：460-466.

[7] Kim S，Tsao H，Kang Y，et al.In vitro evaluation of an injectable chitosan gel for sustained local delivery of BMP-2 for osteoblastic differentiation[J].Journal of Biomedical Materials Research Part B，2011，99：380-390.

[8] 梁杰，崔軍，許勝，等.新型殼聚糖基引導(dǎo)骨再生膜的蛋白緩釋性能研究[J].中國(guó)口腔種植學(xué)雜志，2014，19(4)：164-168.Liang J，Cui J，Xu S，et al.The studies of protein release properties of chitosanbased guided bone regeneration membranes[J].Chinese Journal of Oral Implantology，2014，19(4)：164-168.

[9] Qing S Z，Qiu X J，Ke X，et al.Preparation and characteristics of novel porous hydrogel films based on chitosan and glycerophosphate[J].Carbohydrate Polymers，2009，76：410-416.

[10]Pan M F，Kong L J，Liu B，et al.Production of multiwalled carbon nanotube/poly(aminoa-mide)dendrimer hybrid and its application to piezoelectric immunosensing for metolcarb[J].Sensors and Actuators B，2013，188：949-956.

[11]Zhang B L，Chen Q，Tang H，et al.Characterization of and biomolecule immobilization on the biocompatible multiwalled carbon nanotubes generated by functionalization with polyamidoamine dendrimers[J].Colloids and Surface B，2010，80(1)：18-25.

[12] 熊慶，任全霞，郭亞可，等.聚酰胺-胺功能化修飾多壁碳納米管及作為神經(jīng)生長(zhǎng)因子載體的性能[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2013，33(13)：1023-1028.Xiong Q，Ren Q X，Guo Y K，et al.Function modifications of multiwalled carbon nanotubes with polyamidoamine dendrimer and the properties for nerve growth factor vectors[J].Chinese Journal of Hospital Pharmacy，2013，33(13)：1023-1028.

[13]Zhao Q S，Ji Q X，Xing K，et al.Preparation and characteristics of novel porous hydrogel films based on chitosan and glycerophosphate[J].Carbohydrate Polymers，2009，76：410-416.