陳 玲，陳昕露，范群艷，張 怡，鐘小花，鄭寶東

(1.廈門市絲濃食品有限公司，福建 廈門361101;2.福建農(nóng)林大學食品科學學院，福建 福州350002)

燕窩是雨燕科幾種金絲燕分泌的唾液及其絨羽混合粘結(jié)所筑成的巢穴[1－2]，主產(chǎn)于馬來西亞、印度尼西亞、泰國和緬甸等東南亞國家及我國的福建和廣東沿海地帶.燕窩含有豐富的糖類、有機酸、游離氨基酸以及特征物質(zhì)——唾液酸，具有滋陰、潤燥和補中益氣等功效，作為藥食兩用的高檔滋補品，深受國內(nèi)外消費者的喜愛[3－6].

唾液酸是一類九碳單糖骨架衍生物的總稱，大約有50余種.唾液酸具有多種生物調(diào)節(jié)功能，如抗老年癡呆、抗病毒、抗炎癥和抑制白細胞的粘附等[7].因此，近年來唾液酸成為了鑒別燕窩優(yōu)劣的主要指標，并且也是開發(fā)燕窩功能性新產(chǎn)品的重要功能成分.燕窩中的唾液酸多以結(jié)合的形式與粘多糖、糖蛋白和糖脂中的低聚糖鏈相連接，正因為如此，在燕窩燉煮的過程中有部分唾液酸無法完全釋放.目前，酶制劑越來越多地用于食品加工中，木瓜蛋白酶作為一種天然酶制劑，具有較強的水解能力及活性，能水解食物中的蛋白類成分[8－9].

本試驗對燕窩的主要營養(yǎng)成分進行研究，測定游離氨基酸、水分、脂肪、蛋白質(zhì)和唾液酸的含量，為燕窩質(zhì)量評判標準的建立提供一定的科學依據(jù);同時研究木瓜蛋白酶在燕窩唾液酸提取中的應用，確定最佳的酶解工藝，旨在為燕窩中唾液酸的綜合利用提供理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

燕窩原產(chǎn)于馬來西亞，由廈門市絲濃食品有限公司提供.

唾液酸標準品、牛血清白蛋白由Sigma公司出品;木瓜蛋白酶(酶活力為2.5×106U·g－1)由北京化學試劑公司出品;鹽酸、氫氧化鈉、冰醋酸、茚三酮、石油醚、考馬斯亮藍G-250等試劑均為分析純(AR).

主要儀器設(shè)備有PL602-L電子天平(梅特勒—托利多儀器上海有限公司)、DHG-9053A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)、L530離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)、UV-2000型紫外可見分光光度計(尤尼科上海儀器有限公司)、THZ-82型水浴恒溫震蕩器(常州國華電器有限公司)、HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司)、L8900氨基酸分析儀(日本Hitachi公司).

1.2 燕窩中氨基酸、水分和脂肪含量的測定

燕窩中的氨基酸含量使用氨基酸分析儀，按照GB/T 5009.124－2003[10]的方法測定;水分含量按照GB 5009.3－2010[11]中的直接干燥法測定;脂肪含量按照 GB/T 5009.6－2003[12]中的索氏提取法測定.

1.3 燕窩中蛋白質(zhì)含量的測定

1.3.1 標準曲線的繪制 蛋白質(zhì)標準樣品的制備如表1所示;以蛋白質(zhì)含量為橫坐標，光密度(D)為縱坐標繪制標準曲線(圖1).

表1 蛋白質(zhì)標準樣品的制備Table 1 Preparation of protein standard sample

圖1 蛋白質(zhì)的標準曲線Fig.1 Protein standard curve

1.3.2 樣品蛋白質(zhì)含量的測定 準確稱取200 mg燕窩放入研缽中，加入5 mL蒸餾水研磨成勻漿，于4000 r·min－1離心10 min.將上清液倒入10 mL容量瓶中，再向殘渣中加入2 mL蒸餾水，懸浮后再離心10 min，合并上清液，定容至刻度.另取1支具塞試管，準確加入0.1 mL樣品提取液，再加入0.9 mL蒸餾水和5 mL考馬斯亮藍G-250，充分混合，放置2 min后，以標準曲線1號試管作參比，在595 nm波長處比色，記錄D.通過標準曲線計算樣品中的蛋白質(zhì)含量.蛋白質(zhì)含量/%=[查得的蛋白質(zhì)含量/(μg·mL－1)×提取液總體積/mL]/[樣品鮮重/g×測定時取用提取液的體積/mL].

1.4 燕窩中唾液酸含量的測定

1.4.1 標準曲線的繪制 分別配制 0、5、10、20、50、100 和 200 μg·mL－1標準唾液酸溶液，吸取 1 mL，加入1 mL冰醋酸和1 mL酸性茚三酮，水浴10 min，待其迅速冷卻后在470 nm波長處測定D.以唾液酸含量為橫坐標，D為縱坐標繪制標準曲線(圖2).

1.4.2 固體燕窩中唾液酸含量的測定 燕窩研磨過篩后，稱取0.12 g放入錐形瓶中，加入10 mL 50%醋酸，在電熱爐上加熱水解，待水解完畢迅速轉(zhuǎn)移到容量瓶中，加水至50 mL，定容.取出10 mL待測的水解液或酶解液至離心管中，加入1.25 g硫酸銨蛋白沉淀劑，攪拌至沉淀劑溶解，在3000 r·min－1高速離心機中離心10 min.取上清液1 mL與1 mL酸性茚三酮和1 mL冰醋酸混合搖勻，在沸水浴中保溫10 min，待其冷卻后在470 nm波長處測定D[13]，通過標準曲線計算樣品中的唾液酸含量.唾液酸含量/%=(c×50×10－6)/(m×0.1347)×100.式中，c:從標準曲線上查到的唾液酸含量/(μg·mL－1);50:提取后定容體積/mL;m:樣品的質(zhì)量/g;0.1347:1 g標準燕窩中唾液酸的含量/(μg·mL－1).

1.5 酶法提取燕窩唾液酸的試驗設(shè)計

1.5.1 步驟 稱取燕窩→磨細過40 目篩→加入一定料液比的水→一定量的木瓜蛋白酶酶解(相對于干燕窩重量 )→酶解液于100℃ 滅 活→隔沸水燉煮30 min→測定唾液酸的提取率.

1.5.2 單因素試驗 單因素試驗設(shè)計如表2所示，分別研究料液比、酶添加量、酶解時間、酶解溫度和pH對燕窩唾液酸提取率的影響.

圖2 唾液酸標準曲線Fig.2 Sialic acid standard curve

表2 單因素試驗設(shè)計水平表Table 2 Levels of single-factor experimentation design

1.5.3 正交試驗 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取液料比(A)、pH(B)、酶解時間(C)和酶解溫度(D)對燕窩唾液酸提取率進行L9(34)正交設(shè)計(表3)，分析各因素對唾液酸提取率的綜合影響，確定木瓜蛋白酶提取唾液酸的最佳工藝條件.固定條件為:酶添加量4%.

表3 正交試驗因素水平表Table 3 The factors and levels of orthogonal test

2 結(jié)果與分析

2.1 燕窩的主要營養(yǎng)成分

2.1.1 氨基酸的種類和含量 從表4可以看出:燕窩中的氨基酸種類豐富，富含苯丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、酪氨酸和精氨酸等.燕窩中的水解氨基酸含量達42.272%，且必需氨基酸含量占氨基酸總量的42%;同時，呈鮮味特征的氨基酸(天門冬氨酸和谷氨酸)和呈芳香味特征的氨基酸(酪氨酸和苯丙氨酸)含量較高，表明燕窩的味道鮮美.

食物營養(yǎng)價值的優(yōu)劣主要取決于所含氨基酸的種類、數(shù)量和比例.聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織提出了食品中必需氨基酸參考模式譜，規(guī)定了人體必需氨基酸占總氨基酸的質(zhì)量比以及必需氨基酸與非必需氨基酸的質(zhì)量比分別為40%和60%[14].

2.1.2 主要營養(yǎng)成分 燕窩中的蛋白質(zhì)含量較高，但與其品種關(guān)系緊密[15].本試驗選用的馬來西亞金絲燕燕窩，其蛋白質(zhì)含量達50.26%.唾液酸又稱燕窩酸，是燕窩主要的生物活性成分，在燕窩中主要以N-乙酰神經(jīng)氨酸形式存在.據(jù)報道，一般燕窩的唾液酸含量可達7%以上[16]，這也是初步鑒定真假燕窩的手段.本試驗測得樣品唾液酸含量為13.47%，脂肪含量為0.18%.

表4 燕窩中的氨基酸含量Table 4 Amino acid content of edible bird's nest %

2.2 單因素對燕窩唾液酸提取率的影響

2.2.1 液料比的影響 從圖3可以看出，燕窩唾液酸的提取率隨著液料比的增大而升高，在料液比為30∶1時達到最大值，此后提取率趨于平緩.因此，確定最佳的液料比為30∶1.

2.2.2 酶添加量的影響 隨著木瓜蛋白酶添加量的增加，燕窩唾液酸中的糖蛋白不斷被分解，導致唾液酸的含量顯著增大.由圖4可知，酶添加量超過4%時，唾液酸提取率趨于平緩.由于木瓜蛋白酶具有特殊氣味，添加量若再增加會給燕窩帶來異味;但若減少木瓜蛋白酶的添加量，則唾液酸的提取率下降.因此選取的酶添加量為4%，并在此條件下進行正交試驗.

2.2.3 酶解時間的影響 由圖5可知:酶解開始時隨著酶解時間的延長，底物酶解越充分，故燕窩唾液酸提取率也越高;當酶解時間超過2 h，唾液酸已充分酶解溶出，隨著酶解時間繼續(xù)延長，唾液酸提取率不再變化.

圖3 液料比對唾液酸提取率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of edible birds'nest sialic acid

圖4 酶添加量對唾液酸提取率的影響Fig.4 Effect of enzyme concentration on extraction rate of edible birds'nest sialic acid

圖5 酶解時間對唾液酸提取率的影響Fig.5 Effect of time on extraction rate of edible birds'nest sialic acid

2.2.4 酶解溫度的影響 在蛋白質(zhì)酶解反應中溫度是重要的參數(shù)之一，溫度影響了蛋白酶催化反應速率及其穩(wěn)定性.由圖6可知，酶解溫度對燕窩唾液酸的提取率影響顯著.溫度為30－50℃時，唾液酸的提取率隨著溫度的升高而迅速提高，在50℃時達到最大值;溫度為50－70℃時，唾液酸的提取率隨著溫度的升高而下降.溫度超過50℃后唾液酸的提取率驟降，這主要是由于反應溫度過高，木瓜蛋白酶活性的降低影響了酶解過程，從而影響唾液酸的溶出.因此酶解溫度應控制在45－55℃.

2.2.5 pH的影響 由圖7可知，燕窩唾液酸的提取率隨著pH的升高而提高，當pH為7時達到最大值，此后隨著pH的升高而下降.這主要是因為木瓜蛋白酶最適的pH為6－7，等電點約為8.75，當pH為9時，酶活力被抑制，唾液酸的提取率也下降.

圖6 酶解溫度對唾液酸提取率的影響Fig.6 Effect of temperature on extraction rate of edible birds'nest sialic acid

圖7 pH對唾液酸提取率的影響Fig.7 Effect of pH on extraction rate of edible birds'nest sialic acid

2.2.6 正交試驗結(jié)果 選取液料比(A)、pH(B)、酶解時間(C)和酶解溫度(D)進行L9(34)正交設(shè)計，結(jié)果如表5所示.

表5 L9(34)正交試驗結(jié)果Table 5 Orthogonal experimental results

由表5可知，影響木瓜蛋白酶酶解提取燕窩唾液酸因素的主次順序為:C＞A＞D＞B，最優(yōu)方案為C3A3D1B2，即酶解時間2.5 h、液料比30∶1、酶解溫度45℃、pH 8.由于最優(yōu)組合C3A3D1B2未出現(xiàn)在試驗方案中，應進行驗證試驗.結(jié)果表明，在酶解溫度45℃、液料比40∶1、pH 8的條件下酶解2.5 h，唾液酸的提取率為(9.98±0.05)%，傳統(tǒng)水提法處理的唾液酸提取率為(9.08±0.12)%，酶法比傳統(tǒng)水提法的提取率高 9.91%.

3 結(jié)論

唾液酸及其衍生物在各種生命活動的調(diào)節(jié)及細胞間相互識別中起作用，在抗流感病毒、促進神經(jīng)細胞生長和抗老年癡呆等方面有很重要的應用價值[17－18].在單因素試驗的基礎(chǔ)上進行正交試驗，得到酶法提取唾液酸的最優(yōu)工藝條件為:酶解溫度45℃、液料比40∶1、酶添加量4%、pH 8，在此條件下酶解2.5 h，唾液酸的提取率為(9.98±0.05)%，比傳統(tǒng)水提法的提取率提高了9.91%.說明此法可有效提高燕窩唾液酸的提取率，同時避免因高溫造成唾液酸的破壞和損失，保護燕窩中的特征營養(yǎng)成分.

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