張 翀，李致瑜，田玉庭，鄭寶東

(福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建福州350002)

大黃魚(yú)(Pseudosciaena crocea)屬石首魚(yú)科黃魚(yú)屬，又名黃花魚(yú)、大王魚(yú)和黃魚(yú)等，是我國(guó)特色海水魚(yú)養(yǎng)殖品種，為傳統(tǒng)四大海產(chǎn)之一[1].大黃魚(yú)含有豐富的蛋白質(zhì)，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，目前以鮮食為主，研究多集中在養(yǎng)殖、保鮮和初級(jí)冷凍加工等方面[2－3]，而在精深加工方面仍比較薄弱，嚴(yán)重制約了大黃魚(yú)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展.因此，積極開(kāi)展大黃魚(yú)精深加工研究，推動(dòng)產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型升級(jí)勢(shì)在必行.

研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)人體內(nèi)的抗氧化體系衰退或被破壞時(shí)，過(guò)量的自由基會(huì)造成細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化，胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸等功能喪失，導(dǎo)致氧化脅迫，引發(fā)一系列疾病，如癌癥和糖尿病等[4].一些合成的抗氧化劑，如沒(méi)食子酸丙酯和二叔丁基對(duì)甲酚等，由于其細(xì)胞毒性等副作用，其應(yīng)用受到一定的限制[5].近年來(lái)，食源性抗氧化肽以其較高的吸收效率和安全指數(shù)，成為抗氧化劑研究的熱點(diǎn)，其來(lái)源主要有畜禽蛋白(鴨肉[6]、雞肉[7])、水產(chǎn)蛋白(鯽魚(yú)[8]、貽貝[9])、植物蛋白(大米[10]、菜籽粕[11])等.其中，海洋蛋白資源豐富，是制備抗氧化肽的重要原料，研究者已從金槍魚(yú)[12]、鯊魚(yú)[13]、藍(lán)圓鰺[14]等多種富含蛋白質(zhì)的海洋生物中水解制備得到抗氧化肽.

本試驗(yàn)以閩東大黃魚(yú)為原料，采用酶法水解制備抗氧化肽，以抗氧化能力和蛋白水解度為指標(biāo)，確定最佳的水解用酶，并通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化水解工藝，旨在為大黃魚(yú)資源的開(kāi)發(fā)與利用提供一定的理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料 大黃魚(yú)由福建福鼎海鷗水產(chǎn)食品有限公司提供，經(jīng)去頭、去皮和去內(nèi)臟，切塊后采用雙層聚乙烯袋包裝，置于－20℃冷凍備用.

1.1.2 試劑 堿性蛋白酶(20萬(wàn)U·g－1)、胰蛋白酶(250 U·mg－1)和中性蛋白酶(6萬(wàn)U·g－1)由北京索萊寶生物科技有限公司提供;木瓜蛋白酶(6萬(wàn)U·g－1)和復(fù)合蛋白酶(16萬(wàn)U·g－1)由諾維信(中國(guó))生物技術(shù)有限公司提供;胃蛋白酶(1萬(wàn)U·mg－1)由Sigma公司提供;鐵氰化鉀、三氯乙酸、氯化鐵、鄰苯三酚、氫氧化鈉、濃鹽酸、磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉等均為分析純.

1.1.3 儀器與設(shè)備 儀器與設(shè)備有PB-10 pH計(jì)[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司]、絞肉機(jī)(永康市迪利工貿(mào)有限公司)、SHA-B恒溫水浴振蕩器(常州國(guó)華電器有限公司)、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)、DHG-9140(A)電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科技有限公司)、H1850R冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司).

1.2 水解工藝條件設(shè)計(jì)

1.2.1 水解工藝流程 流程:大 黃魚(yú)肉→解 凍→破碎、絞 成肉糜→異 丙醇脫脂→揮發(fā)剩余異丙醇→加水勻漿 預(yù)熱 酶 恒溫解→滅酶→離心過(guò)濾→取上清液→大 黃魚(yú) 水 解 液.

1.2.2 水解用酶的篩選 選擇堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和復(fù)合蛋白酶，在各種酶最適的酶解條件下對(duì)大黃魚(yú)魚(yú)肉進(jìn)行單酶水解.每隔一定時(shí)間取樣，考察不同酶解時(shí)間下各種酶對(duì)大黃魚(yú)魚(yú)肉蛋白水解度和水解液還原力的影響，篩選出最佳的水解用酶，用以?xún)?yōu)化大黃魚(yú)魚(yú)肉蛋白水解工藝.蛋白酶種類(lèi)及水解條件如表1所示.

表1 蛋白酶的水解條件Table 1 Hydrolysis conditions of P.crocea by different enzyme

1.2.3 單因素試驗(yàn) 以蛋白水解度及水解液的還原力和超氧陰離子自由基()清除力為主要考察指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，分別研究水解pH、酶添加量、水解溫度、底物濃度和水解時(shí)間對(duì)中性蛋白酶水解大黃魚(yú)效果的影響.

在酶添加量3000 U·g－1、底物濃度15%、水解溫度45℃和水解時(shí)間5 h的條件下，研究不同pH(5.0－8.5)對(duì)大黃魚(yú)水解效果的影響.

在底物濃度15%、pH 7.0、溫度45℃和水解時(shí)間5 h的條件下，研究不同酶添加量(300－3600 U·g－1)對(duì)大黃魚(yú)水解效果的影響.

在酶添加量2400 U·g－1、pH 7.0、水解時(shí)間5 h和底物濃度15%的條件下，研究不同溫度(40－70℃)對(duì)大黃魚(yú)水解效果的影響.

在酶添加量2400 U·g－1、pH 7.0、溫度45℃和水解時(shí)間5 h的條件下，研究不同底物濃度(5%－30%)對(duì)大黃魚(yú)水解效果的影響.

在酶添加量2400 U·g－1、pH 7.0、底物濃度 15%和水解溫度 45 ℃的條件下，研究不同時(shí)間(0.5－10 h)對(duì)大黃魚(yú)水解效果的影響.

1.2.4 水解工藝優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以水解時(shí)間、水解溫度和底物濃度為自變量，以水解液的還原力為響應(yīng)值，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化中性蛋白酶水解大黃魚(yú)制備抗氧化肽的條件，試驗(yàn)因素水平如表2所示.

表2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)因素水平Table 2 Factors and levels of response surface analysis

1.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 蛋白水解度的測(cè)定 蛋白水解度的測(cè)定參照厲望等[15]的方法，計(jì)算公式為:水解度/%=(A1－A0)/A×100.式中，A1為水解液中游離氨基態(tài)氮的含量，A0為水解前樣液中氨基態(tài)氮的含量，A為原料蛋白液中總氮的含量.其中，游離氨基態(tài)氮含量按GB/T 5009.39－2003[16]中的甲醛滴定法測(cè)定.

1.3.3 水解液還原力的測(cè)定 還原力的測(cè)定參照Girgih et al[17]的方法并作修改.將2 mL樣品溶液與2 mL 0.2 mol·L－1磷酸鹽緩沖液(pH 6.6)混合，加入 2 mL 1%鐵氰化鉀，在 50 ℃下保溫 20 min.加入 2 mL 10%三氯乙酸，混勻后在 3000 r·min－1離心 10 min.取 0.5 mL 上清液，加入 3.5 mL 蒸餾水和 0.4 mL 0.1%氯化鐵在試管中反應(yīng)10 min，于700 nm下測(cè)定D.D越高，說(shuō)明樣品的還原力越強(qiáng).

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理采用DPS軟件，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示;響應(yīng)面試驗(yàn)采用Design Expert 8.0.6軟件繪圖并進(jìn)行方差分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 水解用酶的篩選

不同蛋白酶對(duì)肽鍵的作用位點(diǎn)不同，選用不同的蛋白酶水解所得的抗氧化肽有較大差異[10].分別采用堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶和復(fù)合蛋白酶水解大黃魚(yú)魚(yú)肉，水解效果如圖1所示.水解時(shí)間為0.5－8 h時(shí)，各種酶的水解液都具有一定的抗氧化活性，其中以中性蛋白酶的水解效果最好，蛋白水解度和水解液的還原力最高，分別達(dá)到36.69%和0.860，其次為堿性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶，胃蛋白酶的水解效果最差.中性蛋白酶是來(lái)源于枯草芽孢桿菌的水解專(zhuān)一性較弱的內(nèi)切酶，其切割末端，如苯丙氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、色氨酸、精氨酸和甘氨酸殘基等都具有較強(qiáng)的抗氧化能力.顧林等[8]采用中性蛋白酶水解鯽魚(yú)魚(yú)肉，其水解液表現(xiàn)出較強(qiáng)的DPPH·清除力、還原力和抑制油脂氧化能力.綜上，選用中性蛋白酶進(jìn)行大黃魚(yú)水解工藝優(yōu)化研究.

2.2 中性蛋白酶單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 水解pH對(duì)水解效果的影響 溶液中的pH能改變蛋白酶活性位點(diǎn)的構(gòu)象和酶與底物間的相互作用，從而影響水解效果[18].由圖2可知，水解pH對(duì)大黃魚(yú)魚(yú)肉蛋白水解效果的影響顯著(P＜0.05).pH為6.0－8.5時(shí)，蛋白水解度和水解液的抗氧化能力隨著pH的增加表現(xiàn)為先增大后減小的趨勢(shì);pH為7.0時(shí)，蛋白水解度和水解液的抗氧化能力都達(dá)到最大，蛋白水解度及水解液的還原力和清除力分別為34.17%、0.859 和 82.41%.因此，確定最佳的水解 pH 為 7.0.

2.2.2 酶添加量對(duì)水解效果的影響 由圖3可知，當(dāng)?shù)孜餄舛纫欢〞r(shí)，隨著酶添加量的增加，蛋白水解度和水解液的抗氧化能力逐漸增大.酶添加量為2400 U·g－1時(shí)，蛋白水解度及水解液的還原力和清除力達(dá)到最大，分別為 34.50%、0.874和 82.33%;之后蛋白水解度隨著酶添加量的增加變化不大(P＞0.05).這可能是由于底物與酶的結(jié)合基本達(dá)到了飽和，或底物中酶的特定剪切位點(diǎn)被反應(yīng)完全，導(dǎo)致蛋白水解度無(wú)顯著增加[19].水解液的還原力和清除力與蛋白水解度的變化一致，這可能是在一定的蛋白水解度下，水解液具有合適且穩(wěn)定的肽段長(zhǎng)度和氨基酸比例，從而具有良好的抗氧化能力.綜合考慮經(jīng)濟(jì)因素，確定適宜的酶添加量為2400 U·g－1.

圖1 蛋白酶對(duì)蛋白水解度和水解液還原力的影響Fig.1 Effect of different enzyme on hydrolysis degree and reducing ability

圖2 水解pH對(duì)蛋白水解度及水解液還原力和清除力的影響Fig.2 Effect of hydrolysis pH on hydrolysis degree，reducing ability and superoxide anion free radical scavenging ability

圖3 酶添加量對(duì)蛋白水解度及水解液還原力和清除力的影響Fig.3 Effect of enzyme dose on hydrolysis degree，reducing ability and superoxide anion free radical scavenging ability

2.2.3 水解溫度對(duì)水解效果的影響 溫度對(duì)酶的催化反應(yīng)影響較大，只有在一定溫度范圍內(nèi)，酶才能保持較高的催化活性[19].一方面，升高溫度可以增加底物的活化數(shù)值，增強(qiáng)其在溶液中的運(yùn)動(dòng)能力，從而提高與酶有效位點(diǎn)的結(jié)合概率;另一方面，過(guò)高溫度可導(dǎo)致酶構(gòu)象的轉(zhuǎn)變，使酶的催化能力下降甚至喪失[20].此外，溫度還可以影響酶促反應(yīng)本身，包括酶和底物與水分子的相互作用、酶和底物分子解離基團(tuán)的解離常數(shù)、酶與輔酶的結(jié)合[19]，從而影響蛋白質(zhì)的水解.由圖4可知:溫度為40－70℃時(shí)，蛋白水解度和水解液的抗氧化能力呈先增加后減小的趨勢(shì);溫度為45℃時(shí)，蛋白水解度和水解液的抗氧化能力達(dá)到最大，水解效果最佳;溫度超過(guò)55℃時(shí)，蛋白水解度和水解液的抗氧化能力迅速減小(P＜0.05)，二者呈較好的相關(guān)性，這可能是因?yàn)闇囟瘸^(guò)55℃時(shí)，酶構(gòu)象迅速改變導(dǎo)致與底物的反應(yīng)效率降低.因此，選擇45℃為適宜的水解溫度.

圖4 水解溫度對(duì)蛋白水解度及水解液還原力和清除力的影響Fig.4 Effect of hydrolysis temperature on hydrolysis degree，reducing ability and superoxide anion free radical scavenging ability

2.2.4 底物濃度對(duì)水解效果的影響 由圖5可知:底物濃度為5%－20%時(shí)，隨著底物濃度的增加，蛋白水解度和水解液的抗氧化能力呈上升趨勢(shì)(P＜0.05);底物濃度為20%時(shí)，蛋白水解度及水解液的還原力和O·－2清除力達(dá)到最大，分別為34.28%、0.892和84.57%;繼續(xù)增加底物濃度，蛋白水解度和水解液的抗氧化能力呈下降趨勢(shì)，二者具有較好的相關(guān)性.這可能是由于當(dāng)?shù)孜餄舛瘸^(guò)20%時(shí)，酶切位點(diǎn)達(dá)到飽和，底物濃度的增加不再提高反應(yīng)效率[19].另外，底物濃度過(guò)大降低了酶在溶液中的擴(kuò)散能力，過(guò)量的底物可能通過(guò)分子間的作用力與酶形成穩(wěn)定的中間產(chǎn)物，抑制了酶與底物的結(jié)合，導(dǎo)致蛋白水解度降低[21].此時(shí)，底物濃度的提高雖然可提高水解液中的多肽含量，但由于水解效率下降抑制了蛋白的深度水解，導(dǎo)致高活性抗氧化肽段比例下降;同時(shí)，高濃度的肽由于相互作用可能導(dǎo)致功能性位點(diǎn)被屏蔽，使抗氧化能力下降.綜合考慮生產(chǎn)成本，確定適宜的底物濃度為20%.

圖5 底物濃度對(duì)蛋白水解度及水解液還原力和清除力的影響Fig.5 Effect of substrate concentration on hydrolysis degree，reducing ability and superoxide anion free radical scavenging ability

2.2.5 水解時(shí)間對(duì)水解效果的影響 由圖6可知:水解時(shí)間為0.5－6 h時(shí)，水解液的抗氧化能力隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加;水解時(shí)間達(dá)6 h時(shí)，水解液的還原力和清除力分別為0.918和83.94%，此后，隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，抗氧化能力無(wú)顯著提高(P＞0.05).蛋白水解度隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，其與水解液的抗氧化能力相關(guān)性較差.這可能是因?yàn)檫M(jìn)一步水解使肽類(lèi)降解成低活性的氨基酸或生成促氧化多肽，抑制了Fe3+的還原或降低了水解液中多肽穩(wěn)定自由基的能力[15].因此，選擇適宜的水解時(shí)間為6 h.

圖6 水解時(shí)間對(duì)蛋白水解度及水解液還原力和清除力的影響Fig.6 Effect of hydrolysis time on hydrolysis degree，reducing ability and superoxide anion free radical scavenging ability

2.3 水解工藝的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 方差與回歸分析 根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以水解液的還原力(Y)為響應(yīng)值，以水解時(shí)間(A)、水解溫度(B)和底物濃度(C)3個(gè)因素為自變量，采用3因素3水平的響應(yīng)面分析方法.響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果如表3所示.

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Experimental designs and results for response surface analysis

采用 Design Expert 8.0.6軟件對(duì)表3的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果(表4)表明:模型的P＜0.01，說(shuō)明該回歸模型顯著，失擬項(xiàng)(P=0.336)不顯著，說(shuō)明方程擬合度高，可用此模型預(yù)測(cè)水解時(shí)間、水解溫度和底物濃度對(duì)還原力的影響;模型中的二次項(xiàng)A2、B2和C2，一次項(xiàng)A和C以及交互項(xiàng)AC的影響極顯著，一次項(xiàng)B和交互項(xiàng)AB的影響顯著，可判斷出各具體試驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值的影響呈非線(xiàn)性關(guān)系.

對(duì)表3的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合和方差分析，剔除P＞0.05不顯著項(xiàng)，得到還原力對(duì)以上3個(gè)因素的回歸方程:Y=0.940+0.045A－0.018B+0.090C－0.028AB+0.061AC－0.089A2－0.034B2－0.110C2.式中，Y 為還原力的預(yù)測(cè)值，A、B和C分別為水解時(shí)間、水解溫度和底物濃度的編碼值.該方程反映了各因素與還原力之間的變化關(guān)系.此外，方程中的二次項(xiàng)系數(shù)均為負(fù)數(shù)，說(shuō)明方程的拋物線(xiàn)函數(shù)開(kāi)口向下，具有極大值點(diǎn)，可進(jìn)行最大值優(yōu)化分析.

表4 回歸模型的方差分析1)Table 4 Analysis of variance for the fitted regression model

2.3.2 響應(yīng)面分析 采用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)表3的數(shù)據(jù)進(jìn)行模型分析，并繪制響應(yīng)面曲線(xiàn)圖，從響應(yīng)面分析圖上可直觀地看出各因素之間的交互作用.

由圖7可知，水解溫度曲線(xiàn)比較平緩，相對(duì)于水解時(shí)間在試驗(yàn)范圍內(nèi)對(duì)水解液還原力的影響不明顯.當(dāng)水解時(shí)間小于5.5 h時(shí)，水解時(shí)間對(duì)還原力的影響顯著;當(dāng)水解時(shí)間超過(guò)6 h，等高線(xiàn)變得較為稀疏，水解時(shí)間對(duì)還原力的影響逐漸減弱.等高線(xiàn)呈斜向曲率較高的橢圓形，說(shuō)明水解溫度與時(shí)間之間有較好的交互作用.這可能是因?yàn)檠娱L(zhǎng)水解時(shí)間可彌補(bǔ)水解溫度偏離導(dǎo)致的酶活性下降，使還原力維持在較高水平.

圖7 水解時(shí)間和水解溫度對(duì)水解液還原力影響的三維曲面圖和等高線(xiàn)圖Fig.7 Response surface plot and contour plot of influence of hydrolysis time and hydrolysis temperature on reducing ability

由圖8可知，水解時(shí)間與底物濃度的交互作用明顯.當(dāng)水解時(shí)間和底物濃度較低時(shí)，水解液還原力隨著兩者的增加而顯著上升;當(dāng)水解時(shí)間大于6 h，底物濃度大于20%時(shí)，還原力基本穩(wěn)定在較大值.這可能是由于當(dāng)?shù)孜餄舛忍幵谳^高水平時(shí)，水解時(shí)間的延長(zhǎng)可避免底物水解不足.

由圖9可知，當(dāng)?shù)孜餄舛却笥?0%時(shí)，水解溫度對(duì)水解液還原力的影響不顯著，極大值位置幾乎處于同一水平面，說(shuō)明兩者間的交互作用并不明顯，水解溫度對(duì)酶活性的影響不足以顯著改變高濃度底物水解液的還原力.結(jié)合交互項(xiàng)的顯著性分析，表明水解溫度和底物濃度對(duì)還原力的交互作用不顯著.

圖8 水解時(shí)間和底物濃度對(duì)水解液還原力影響的三維曲面圖和等高線(xiàn)圖Fig.8 Response surface plot and contour plot of influence of hydrolysis time and substrate concentration on reducing ability

圖9 水解溫度和底物濃度對(duì)水解液還原力影響的三維曲面圖和等高線(xiàn)圖Fig.9 Response surface plot and contour plot of influence of hydrolysis temperature and substrate concentration on reducing ability

利用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)上述回歸方程求解，得到中性蛋白酶水解大黃魚(yú)魚(yú)肉的最優(yōu)條件組合為:底物濃度 26.55%、水解溫度 46.38 ℃、水解時(shí)間 7.2 h、pH 7.0、酶添加量 2400 U·g－1，此時(shí)水解液的還原力為0.967.考慮到實(shí)際操作，將優(yōu)化后的參數(shù)調(diào)整為:底物濃度26.55%、水解溫度46℃、水解時(shí)間7.2 h、pH 7.0、酶添加量2400 U·g－1.采用調(diào)整后的工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，重復(fù)3次得到的還原力為0.963，實(shí)測(cè)值和理論預(yù)測(cè)值誤差小于1%，說(shuō)明采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的酶解條件可靠.該條件下測(cè)得的清除力為87.46%，蛋白水解度為36.51%.

3 結(jié)論

(1)通過(guò)比較堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和復(fù)合蛋白酶對(duì)大黃魚(yú)魚(yú)肉蛋白的水解效果，篩選出中性蛋白酶為制備大黃魚(yú)抗氧化肽的首選蛋白酶.

(2)采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析對(duì)中性蛋白酶的水解條件進(jìn)行優(yōu)化的結(jié)果表明，水解過(guò)程中魚(yú)肉蛋白的水解度與其抗氧化能力之間有較好的相關(guān)性.中性蛋白酶水解的最優(yōu)工藝條件為:底物濃度26.55%、水解溫度 46 ℃、水解時(shí)間 7.2 h、pH 7.0、酶添加量 2400 U·g－1，在此條件下的蛋白水解度為36.51%，水解液的還原力為 0.967清除力為 87.46%.

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