顧東華，張洪斌，李秋萍，李 瑤，胡雪芹

（合肥工業(yè)大學(xué)醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，安徽 合肥 230009）

放線菌A0101發(fā)酵產(chǎn)物中幾丁質(zhì)酶抑制劑的分離純化及性質(zhì)研究

顧東華，張洪斌*，李秋萍，李 瑤，胡雪芹

（合肥工業(yè)大學(xué)醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，安徽 合肥 230009）

實(shí)驗(yàn)室前期初篩和復(fù)篩得到一株具有高抑制幾丁質(zhì)酶活性的放線菌A0101，本實(shí)驗(yàn)通過活性追蹤的方法對A0101菌株的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，經(jīng)乙醇醇沉、透析、硅膠柱層析及SephadexG-15凝膠柱層析得到活性物質(zhì)純品，高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測顯示其在保留時(shí)間4.1 min為一單峰，3,5二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）比色法驗(yàn)證其抑制率為80.2%，紅外光譜、核磁共振波譜氫譜（1H-nuclear magnetic resonance，1H-NMR）、質(zhì)譜分析結(jié)果初步證明其為一個(gè)多羥基的糖類化合物。

幾丁質(zhì)酶；抑制劑；純化；性質(zhì)

幾丁質(zhì)是N-乙酰-葡萄糖胺以β-1,4糖苷鍵連接起來的直鏈多聚物，是節(jié)肢動(dòng)物外骨骼、真菌細(xì)胞壁、細(xì)胞隔膜及線蟲卵殼的主要組成組分[1]。幾丁質(zhì)酶是降解幾丁質(zhì)的關(guān)鍵酶類，能分解幾丁質(zhì)成幾丁單糖或幾丁寡糖，對多種生物的生長及發(fā)育過程起到重要的作用。如昆蟲在幼蟲蛻皮和化蛾的發(fā)育過程中需要幾丁質(zhì)酶部分降解外骨骼來完成其變態(tài)發(fā)育的過程[2]；真菌需要幾丁質(zhì)酶降解子母細(xì)胞之間的隔以完成其出芽生殖過程[3]。幾丁質(zhì)酶抑制劑能特異性地結(jié)合幾丁質(zhì)酶并抑制其活性，阻止昆蟲蛻皮以及真菌子母細(xì)胞的分離而起到殺蟲和抗真菌作用[2-3]。同時(shí)由于幾丁質(zhì)代謝系統(tǒng)不是哺乳動(dòng)物機(jī)體所必需的生命活動(dòng)代謝系統(tǒng)[4]，故以幾丁質(zhì)酶作為靶標(biāo)的新型綠色生物殺蟲劑及食品保鮮劑等具有對人畜無害、安全環(huán)保、高效低毒的優(yōu)點(diǎn)，很大程度上保證了食品安全。這使得開發(fā)以幾丁質(zhì)酶作為靶標(biāo)的高效低毒生物殺蟲劑、抗真菌劑成為國內(nèi)外關(guān)注的新熱點(diǎn)，在農(nóng)業(yè)、食品、環(huán)保等行業(yè)具有重要的應(yīng)用前景。

目前，國外該領(lǐng)域的研究關(guān)注較多的是探索新篩選模型和對現(xiàn)有幾丁質(zhì)酶抑制劑進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾以獲得新的抑制劑[5]。通常天然產(chǎn)物分子質(zhì)量較大，難以有效合成，但是在發(fā)現(xiàn)新的酶抑制劑上能夠提供很有價(jià)值的線索，Rush等[6]通過對已發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)酶抑制劑精安芬（argifin）的深入研究，確定了其最小活性中心，并作為支架化合物構(gòu)建出幾種新的幾丁質(zhì)酶抑制劑；有報(bào)道指出18家族幾丁質(zhì)酶VhChiA的活性位點(diǎn)和酸性哺乳動(dòng)物幾丁質(zhì)酶AMCase非常相似，這對研究哺乳動(dòng)物來源的幾丁質(zhì)酶提供很好的借鑒[7]；有學(xué)者在研究廣譜幾丁質(zhì)酶抑制劑阿洛氨菌素的生物學(xué)活性時(shí)發(fā)現(xiàn)它是一種良好的抗哮喘藥的前體物[8]。國內(nèi)有關(guān)幾丁質(zhì)酶抑制化合物的研究還處在起步階段，大多致力于產(chǎn)生菌的初篩和相關(guān)合成工藝的改進(jìn)等。張洪斌等[9]利用平板透明圈法和3,5二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）比色法，以棉鈴蟲幾丁質(zhì)酶作為篩選靶標(biāo)對800多株菌株進(jìn)行篩選，篩選出包括A0901#菌株在內(nèi)的具有幾丁質(zhì)酶抑制作用的活性菌株29 株；陳志斌等[10]通過響應(yīng)面法優(yōu)化鏈霉菌A0901產(chǎn)幾丁質(zhì)酶抑制劑的發(fā)酵條件，優(yōu)化后抑制率達(dá)67.58%；Huang Gangliang等[11]通過改進(jìn)優(yōu)化合成工藝，提高了回收率，實(shí)現(xiàn)了阿洛氨菌素的有效合成。盡管至今已報(bào)道的幾丁質(zhì)酶抑制劑已有多種，但是，由于其生產(chǎn)成本高、活性低、不易合成等原因，始終沒有應(yīng)用于工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。

本研究通過建立穩(wěn)定可靠的篩選模型，篩選得到一株具有高抑制幾丁質(zhì)酶活性的菌株，并對其所產(chǎn)活性物質(zhì)進(jìn)行初步的分離純化，同時(shí)研究了活性化合物的相關(guān)理化性質(zhì)，以期獲得有效、易得的幾丁質(zhì)酶抑制化合物，為開發(fā)新型綠色生物殺蟲劑、食品保鮮劑、抗真菌劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、菌種與試劑

家蠶購于安慶市潛山縣蠶農(nóng)。

放線菌A0101由本實(shí)驗(yàn)室在前期通過平板透明圈初篩和DNS比色復(fù)篩的篩選模型，以家蠶幾丁質(zhì)酶作為篩選靶標(biāo)篩選得到，將菌種保存于－24 ℃甘油管中。

透析袋（截留分子質(zhì)量為1 000 D） 生工生物工程（上海）股份有限公司；柱層析硅膠（分析級，100～200 目）；Sephadex G-15 美國Pharmacia公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Model201高效液相色譜儀 德國Rheodyne公司；HC-3018R高速冷凍離心機(jī) 科大創(chuàng)新有限責(zé)任公司；VFD2000真空冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；ZHWY-2102恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；LDZM立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；HH-1恒溫水浴鍋 江蘇金壇晶玻實(shí)驗(yàn)儀器廠；T6紫外分光光度計(jì) 新世紀(jì)北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；W-1調(diào)節(jié)萬用電爐 南通市長江光學(xué)儀器有限公司；CA-920-2超凈工作臺 上海凈化設(shè)備廠。

1.3 方法

1.3.1 膠體幾丁質(zhì)的配制

稱取2 g幾丁質(zhì)，加入20 mL質(zhì)量濃度85 g/100 mL的濃磷酸，常溫條件下放置48 h后，加蒸餾水稀釋，反復(fù)沖洗至pH 5.0以上。最后調(diào)整幾丁質(zhì)終質(zhì)量濃度為1 g/100 mL[9]。

1.3.2 粗酶液的提取

將蛹化后的蠶繭于25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)8～10 d后至蠶繭中的蛹將要化蛾前，收集蠶蛹于0.1 mol/L pH 6.0磷酸鹽緩沖液中均質(zhì)，冰水浴中超聲1 s，間歇2 s，150 W破碎16 min，4 ℃、10 000 r/min離心30 min收集上清液[12]。

1.3.3 幾丁質(zhì)酶活力測定

幾丁質(zhì)酶分解膠體幾丁質(zhì)生成N-乙酰-D-氨基葡萄糖，以N-乙酰-D-氨基葡萄糖的生成速率測定酶活性大小。50 ℃條件下，每小時(shí)產(chǎn)生1 μmol/L N-乙酰-D-氨基葡萄糖所需酶量為一個(gè)酶活力單位（U）[13]。

在裝有500 μL 1 g/100 mL膠體幾丁質(zhì)和500 μL 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.0）的試管中（提前預(yù)熱至45 ℃）加入500 μL酶液，于45 ℃溫育1 h，沸水浴10 min中止反應(yīng)，將沸水浴后的反應(yīng)體系冰水浴冷卻，冷卻后加入1 500 μL DNS試劑，沸水浴20 min，冷卻至室溫后用蒸餾水定容到25 mL，搖勻，離心后取上清液，以滅活的等量酶液做空白對照，在540 nm波長處測定吸光度[10]。

1.3.4 抑制率測定

在酶反應(yīng)體系中加入待測液，測定剩余酶活力，以滅活后的體系和原酶反應(yīng)體系作為對照，根據(jù)酶活力是否下降以及下降的程度來判定抑制活性。幾丁質(zhì)酶抑制劑的抑制活性用抑制率計(jì)算，以吸光度的變化值表示酶活力（U）[10]。

1.3.5 活性菌株的液體培養(yǎng)方法

將活化后的菌株接種于高氏一號液體培養(yǎng)基，30 ℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)5 d，發(fā)酵液6 000 r/min離心10 min，取上清液。

1.3.6 活性物質(zhì)的初步分離

將發(fā)酵液抽濾取上清，濃縮后加入3 倍體積無水乙醇醇沉處理，4 ℃冰箱過夜；醇沉液6 000 r/min離心20 min，收集上清液濃縮到適當(dāng)體積；用截留分子質(zhì)量1 000 D的透析袋過夜透析3 次，收集透析液并濃縮凍干；在磁力攪拌的條件下用甲醇反復(fù)浸提多次再次凍干即得活性物質(zhì)粗品。

活性物質(zhì)粗品依次經(jīng)硅膠柱層析、Sephadex G-15凝膠柱層析進(jìn)一步精制得到純品。采用DNS比色法及高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測確定活性組分區(qū)域。HPLC條件如下：Grace反相C18分離柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），Model 201型紫外檢測器；流動(dòng)相甲醇-水（10∶90，V/V），流速0.6 mL/min；柱溫30 ℃。

1.3.7 活性物質(zhì)的初步鑒定

面對海量的數(shù)據(jù)和信息，新媒體要不斷培養(yǎng)高素質(zhì)的采編人才，對信息的甄別和收集能力有較高的要求。新媒體培養(yǎng)復(fù)合型采編人才，一方面，善于組織語言，把握大數(shù)據(jù)時(shí)代受眾的心理變化；另一方面，善于借助大數(shù)據(jù)，從民眾的信息發(fā)布中獲取有效信息，核實(shí)并且深度挖掘后進(jìn)行報(bào)道，提高信息采編效率。復(fù)合型采編人才要善于經(jīng)營兩微一端的媒體公共關(guān)系，營造良好的組織形象，獲得民眾的心理認(rèn)同感，從根源樹立媒體的威信。

收集活性組分并凍干，呈白色粉末狀。將此純品送分析測試中心進(jìn)行紅外光譜檢測、核磁共振波譜氫譜（1H-nuclear magnetic resonance，1H-NMR）檢測、質(zhì)譜檢測。

紅外光譜掃描條件：KBr壓片，常溫（25 ℃）條件下測試。

核磁共振（1H-NMR）條件：樣品用適量氘代水溶解，50%的四甲基甲硅烷（trimethyl silane，TMS）溶液作為內(nèi)標(biāo)液，在傅里葉變換核磁共振儀中操作。

質(zhì)譜條件：EI離子源，離子源溫度230 ℃；電離能量70 eV；發(fā)射電流34.6 μA；溶劑延遲3 min；掃描質(zhì)量范圍：20～500 u，掃描間隔：0.2 s。

1.3.8 活性物質(zhì)的理化性質(zhì)

將活性物質(zhì)粉末分別用等量的蒸餾水、甲醇、乙醇、正丁醇、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、石油醚試劑溶解，考察其溶解性。

1.3.9 pH值對抑制活性的影響

取11 個(gè)均裝有5 mL待測液的離心管，依次調(diào)節(jié)pH值為2～12（醋酸-醋酸鈉緩沖液pH 2.0～6.0；磷酸鹽緩沖液pH 7.0～8.0；甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液pH 9.0～12.0）處理2 h，然后pH值均調(diào)至7，用DNS比色法測定其幾丁質(zhì)酶抑制活性。

1.3.10 溫度對抑制活性的影響

取6 個(gè)均裝有5 mL待測液的離心管，分別放置到40、50、60、70、80、90 ℃的水浴鍋中水浴2 h，恢復(fù)至常溫時(shí)用DNS比色法測定其幾丁質(zhì)酶抑制活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 活性物質(zhì)的分離純化結(jié)果

2.1.1 硅膠柱層析結(jié)果

活性物質(zhì)粗品硅膠柱層析結(jié)果如表1所示。經(jīng)過硅膠柱層析后，活性物質(zhì)主要存在氯仿-甲醇體積比分別為1∶1、3∶7兩個(gè)洗脫組分中，合并兩個(gè)組分濃縮后進(jìn)行凝膠柱層析。

表1 硅膠柱層析結(jié)果Table 1 Results of silica gel column chromatography

2.1.2 Sephadex G-15凝膠色譜層析結(jié)果

經(jīng)硅膠柱層析精制后，活性組分進(jìn)一步經(jīng)Sephadex G-15凝膠柱層析洗脫曲線如圖1所示。通過逐管檢測幾丁質(zhì)酶抑制活性，確定活性組分主要存在于12～18 管，濃縮、凍干后得到純品粉末。活性物質(zhì)純品HPLC檢測結(jié)果如圖2所示，圖譜顯示活性物質(zhì)的HPLC保留時(shí)間為4.1 min，經(jīng)DNS比色法驗(yàn)證其幾丁質(zhì)酶抑制率為80.2%。

圖1 Sephadex G-15凝膠柱層析洗脫曲線Fig.1 Elution curve of Sephadex G-15 gel column chromatography

圖2 活性物質(zhì)的HPLC圖Fig.2 HPLC profi le of the bioactive fraction

2.2 活性物質(zhì)初步鑒定結(jié)果

圖3 活性物質(zhì)的紅外光譜圖Fig.3 IR spectrum of the separated chitinase inhibitor

活性物質(zhì)的紅外光譜檢測結(jié)果如圖3所示，活性物質(zhì)在3 390、3 380、2 490、2 890、1 420、1 360、1 150、1 030、557 cm－1處有較強(qiáng)的吸收峰。其中，2 890 cm－1為C—H伸縮振動(dòng)峰；1 360、1 030 cm－1處為C—N伸縮振動(dòng)峰，可能含有胺、酰胺結(jié)構(gòu)；1 150 cm－1處為糖環(huán)上C—O吸收峰?；钚晕镔|(zhì)的1H-NMR結(jié)果見圖4，δ 5.4表明物質(zhì)結(jié)構(gòu)可能的連接方式是糖類的α-1,4糖苷鍵，δ 3.5推測活性物質(zhì)可能含有多個(gè)O—H峰。質(zhì)譜檢測結(jié)果如圖5所示，m/z有多組數(shù)據(jù)如1 605、1 443、1 281；1 205、1 043、881；863、701、539、377；703、541、379。以上數(shù)據(jù)都顯示相差一個(gè)脫水后的單糖分子質(zhì)量162 D。同時(shí)結(jié)合活性物質(zhì)水溶性較好的特點(diǎn)，初步推測該活性物質(zhì)是一個(gè)多羥基的糖類化合物。

圖4 活性物質(zhì)的1H-NMR譜圖Fig.4 1H-NMR spectrum of the separated chitinase inhibitor

圖5 活性物質(zhì)質(zhì)譜圖Fig.5 Mass spectrum of the separated chitinase inhibitor

2.3 活性物質(zhì)的理化性質(zhì)分析

溶解性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，活性物質(zhì)粉末在水和甲醇中溶解性較好；微溶于乙醇和丙酮；不溶于所選其他有機(jī)試劑。

2.4 pH值對活性物質(zhì)抑制率的影響

圖6 pH值對活性物質(zhì)的幾丁質(zhì)酶抑制率的影響Fig.6 Effect of pH on inhibitory rate of chitinase by the inhibitor

由圖6可知，在酸性、中性、弱堿性條件下，活性物質(zhì)的幾丁質(zhì)酶抑制率基本沒有什么變化；在pH值大于10之后，活性物質(zhì)的幾丁質(zhì)酶抑制率有少許下降，總體上活性物質(zhì)有著很好的酸堿耐受性。

2.5 溫度對活性物質(zhì)抑制率的影響

由圖7可知，在40～90 ℃之間，該活性物質(zhì)的熱穩(wěn)定性非常好，對幾丁質(zhì)酶的活性并沒有隨著溫度的升高出現(xiàn)明顯的升高或降低趨勢，這說明該活性物質(zhì)有良好的耐熱性。

圖7 溫度對活性物質(zhì)的幾丁質(zhì)酶抑制率的影響Fig.7 Effect of temperature on inhibitory rate of chitinase by the inhibitor

3 討 論

基于幾丁質(zhì)酶在含幾丁質(zhì)生物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，幾丁質(zhì)酶抑制化合物可以作為新型潛在的生物殺蟲劑、抗真菌劑，在農(nóng)業(yè)、食品、環(huán)保等行業(yè)具有重要的應(yīng)用前景。目前，已報(bào)道的幾丁質(zhì)酶抑制劑已有多種，從產(chǎn)生菌的篩選、抑制化合物的生物化學(xué)合成、抑制機(jī)理機(jī)制、新功能的發(fā)現(xiàn)等都做了很多有意義的研究[6,8,14]?，F(xiàn)階段關(guān)注的重點(diǎn)多是對已發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)酶抑制化合物本身結(jié)構(gòu)的分析及其同幾丁質(zhì)酶之間的相互作用機(jī)制的研究，以期用抑制劑作為支架前體物構(gòu)建更高效的化合物。同時(shí)，幾丁質(zhì)酶抑制劑還有一些潛在的功能和作用沒有被發(fā)現(xiàn)，還有很大的研究空間。應(yīng)該以此為契機(jī)開啟對幾丁質(zhì)酶抑制劑的深入研究，努力使其應(yīng)用到生活、生產(chǎn)中。

近年來已報(bào)道的幾丁質(zhì)酶抑制劑主要有：阿洛氨菌素及其衍生物、Styloguanidines[15]、CI-4[16]、精氨芬[17-18]和阿爾加定[19]、Psammaplin A[20]、FPS-1[21]、黃嘌呤衍生物[22-23]等。在已發(fā)現(xiàn)的幾丁質(zhì)酶抑制劑中，多糖類化合物已有學(xué)者報(bào)道。Nitoda等[21]從真菌發(fā)酵液中分離獲得多糖類幾丁質(zhì)酶抑制劑FPS-1。FPS-1是一種水溶性中性多糖，經(jīng)水解后產(chǎn)物質(zhì)譜分析為2∶1∶1的N-乙酰葡萄糖胺、葡萄糖和半乳糖。經(jīng)初步結(jié)構(gòu)鑒定，本研究獲得的幾丁質(zhì)酶抑制劑也是一種水溶性多糖類化合物，但分子質(zhì)量遠(yuǎn)沒有FPS-1（16 kD）大；通過對活性化合物的理化性質(zhì)研究表明，該活性化合物具有良好的耐熱性和酸堿穩(wěn)定性，而大分子多糖幾丁質(zhì)酶抑制劑FPS-1由于分子質(zhì)量較大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜等因素，不具有耐熱和耐酸堿性能，對其進(jìn)一步的實(shí)際應(yīng)用有一定的限制。

本研究以DNS比色法作為檢測幾丁質(zhì)酶抑制化合物的方法，該法方便、快捷。經(jīng)過透明圈初篩和DNS比色復(fù)篩從土壤中篩選得到高抑制活性菌株放線菌A0101。對其所產(chǎn)活性物質(zhì)進(jìn)行分離純化，同時(shí)研究了該活性化合物的相關(guān)理化性質(zhì)，結(jié)果表明：該活性物質(zhì)是一種水溶性物質(zhì)，易溶于甲醇，微溶于乙醇和丙酮，不溶于氯仿、乙酸乙酯、丙酮、石油醚等有機(jī)試劑；紅外光譜、1H-NMR和質(zhì)譜檢測顯示其是一種多羥基的糖類化合物，這和該物質(zhì)良好的水溶性相一致。關(guān)于該物質(zhì)的進(jìn)一步結(jié)構(gòu)分析確證及其相關(guān)理化性質(zhì)工作尚在進(jìn)行中。研究結(jié)果為獲得有效、易得的幾丁質(zhì)酶抑制化合物，開發(fā)新型高效低毒的生物殺蟲劑、食品保鮮劑、抗真菌劑等提供了參考。

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Purification and Characterization of Chitinase Inhibitor from the Fermentation Products of Actinomycete A0101

GU Donghua, ZHANG Hongbin*, LI Qiuping, LI Yao, HU Xueqin
(School of Medical Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

Bombyx mori chitinase was used as the target to screen an actinomycete strain able to inhibit chitinase by transparent ring plate screening and DNS colorimetric screening methods. The strain A0101 with high inhibitory specifi city was obtained. The activity-guided separation and purifi cation of the fermented products of strain A0101 were carried out by alcohol precipitation, dialysis, silica gel column chromatography and Sephadex G-15 gel column chromatography, and a pure bioactive material was obtained. This bioactive material exhibited a single HPLC peak with a retention time of 4.1 min. Its inhibitory rate on chitinase was evaluated by DNS colorimetric method to be 80.2%. Moreover, it proved to be a multiple hydroxyl carbohydrate according to the infrared (IR),1H-nuclear magnetic resonance (NMR) and mass spectrometry analyses.

chitinase; inhibitor; purifi cation; characteristics

TS201.3

A

1002-6630（2015）19-0194-05

10.7506/spkx1002-6630-201519035

2014-12-04

安徽省自主創(chuàng)新專項(xiàng)合肥工業(yè)大學(xué)2013秋實(shí)計(jì)劃項(xiàng)目（2013AKKG0391）

顧東華（1990-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)樯镏扑幣c酶工程。E-mail：gdh9009@126.com

*通信作者：張洪斌（1970-），男，教授，博士，研究方向?yàn)樯镏扑幣c酶工程。E-mail：zhb5678@163.com