楊 杰，張 筠，孟祥晨

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030）

重組蛋白LuxS誘導(dǎo)表達(dá)及純化條件的優(yōu)化

楊 杰，張 筠，孟祥晨*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030）

目的：優(yōu)化重組蛋白LuxS誘導(dǎo)表達(dá)及純化條件，提高具有生物活性的重組蛋白LuxS的表達(dá)量，為體外合成自誘導(dǎo)物2（autoinducer-2，AI-2）奠定基礎(chǔ)。方法：采用單因素試驗(yàn)，優(yōu)化誘導(dǎo)培養(yǎng)基、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)前菌體生物量、誘導(dǎo)時(shí)間以及異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）的濃度；采用Ni-NTA Purifi cation System對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化，比較Native Elution Buffer 的咪唑濃度和pH值對(duì)重組蛋白純化的影響，確定最佳的Native Elution Buffer；對(duì)比蛋白與樹(shù)脂結(jié)合時(shí)不同緩沖液的純化效果，選擇最優(yōu)的結(jié)合緩沖液。結(jié)果：重組蛋白的最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件為：以LB培養(yǎng)基為誘導(dǎo)培養(yǎng)基，菌液OD600 nm為0.6～0.8，IPTG濃度為0.1 mmol/L，誘導(dǎo)溫度為37 ℃，誘導(dǎo)時(shí)間為12 h。采用添加3 mol/L NaCl的磷酸鹽緩沖液作為蛋白與樹(shù)脂結(jié)合的緩沖液，含500 mmol/L咪唑的Native Elution Buffer（pH 6.5）作為蛋白洗脫液。使用分離獲得的LuxS蛋白合成的AI-2生物活性約為陽(yáng)性對(duì)照的6 倍。結(jié)論：本研究成功優(yōu)化了重組蛋白LuxS的誘導(dǎo)表達(dá)及純化條件，獲得了具有生物活性的重組蛋白，并成功合成了AI-2。

重組蛋白；LuxS；誘導(dǎo)表達(dá)；純化；自誘導(dǎo)物2

群體感應(yīng)是細(xì)菌間通過(guò)小分子信號(hào)分子進(jìn)行信息交流、感知菌體密度，進(jìn)而調(diào)控相應(yīng)基因表達(dá)的一種機(jī)制[1-2]。細(xì)菌在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中會(huì)向環(huán)境中分泌特定的信號(hào)分子，這種信號(hào)分子被稱為自誘導(dǎo)物（autoinducers，AI）[3]。許多細(xì)菌中存在幾種群體感應(yīng)系統(tǒng)，研究發(fā)現(xiàn)在哈氏弧菌中就存在兩種群體感應(yīng)系統(tǒng)。這兩種群體感應(yīng)系統(tǒng)分別利用?；呓z氨酸內(nèi)酯（acylhomoserine lactone）和AI-2作為信號(hào)分子[4]。以AI-2介導(dǎo)的群體感應(yīng)系統(tǒng)存在于革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌中，因此AI-2是一種種間通用的信號(hào)分子[5-7]。

目前發(fā)現(xiàn)，所有能夠產(chǎn)生AI-2的細(xì)菌中的AI-2合成途徑都是相同的，即都是S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）經(jīng)過(guò)3 步酶催化反應(yīng)生成的[8-10]。S-腺苷甲流氨酸作為甲基供體，脫去甲基后生成S-腺苷高半胱氨酸（S-adenosylhomocysteine，SAH），SAH經(jīng)Pfs催化生成S-核糖高半胱氨酸（S-ribosylhomocysteine，SRH）和腺嘌呤，LuxS催化S-核糖高半胱氨酸生成4,5-二羥基-2,3-戊二酮（4,5-dihydroxy-2,3-pentanedione，DPD）和高半胱氨酸（homocysteine，HCY）[11-13]。DPD在水溶液中不穩(wěn)定，自動(dòng)分子重排形成有活性的AI-2信號(hào)分子。通過(guò)AI-2的合成途徑知道，LuxS在AI-2的合成過(guò)程中起著關(guān)鍵酶的作用，是AI-2合成所必需的。本實(shí)驗(yàn)室前期人員成功構(gòu)建了重組原核表達(dá)載體pQE-30-luxS，并在大腸桿菌中成功表達(dá)了重組蛋白LuxS[14]，為得到大量LuxS蛋白奠定了基礎(chǔ)。本研究將對(duì)重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化條件進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)而提高重組蛋白產(chǎn)量，為體外合成AI-2奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌（Escherichia coli）M15菌株 上海顯益化學(xué)科技有限公司；哈氏弧菌（V. harveyi）BB170、哈氏弧菌（V. harveyi）BB120 美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)（American Type Culture Collection，ATCC）。

表達(dá)載體pQE-30由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)郭東華老師惠贈(zèng)。

1.1.2 試劑

Ni-NTA Purification System 美國(guó)Invitrogen公司；2,2’-聯(lián)喹啉-4,4-二甲酸二鈉（2,2’-biquinoline-4,4-dicarboxylic acid disodium salt，BCA）法蛋白定量試劑盒 北京百泰克生物技術(shù)有限公司；異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactopyranoside，IPTG） 薩默斯（Summus）公司；低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)Marker 寶生物工程（大連）有限公司；氨芐青霉素（ampicillin，Amp）、卡那霉素（kanamycin，Kana）、溶菌酶（酶活力＞20 000 U/mg）、苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fl uoride，PMSF）、咪唑（imidazole）美國(guó)Amresco公司；S-腺苷高半胱氨酸（SAH） 美國(guó)Sigma公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

迷你型垂直凝膠電泳儀、Model 680型酶標(biāo)儀 美國(guó)Bio-Rad公司；冷凍高速離心機(jī) 美國(guó)Sigma公司；UVP凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)UVP公司；ZHWY200B型全溫度恒溫培養(yǎng)搖床 上海智城分析儀器制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 誘導(dǎo)培養(yǎng)基的確定

將含有重組質(zhì)粒pQE-30-luxS的E. coli M15單菌落接種到5 mL含100 μg/mL Amp和25 μg/mL Kana的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)12 h；將培養(yǎng)12 h的菌液按1%接種量分別接種到M9、自誘導(dǎo)、TB、2YT、SOC和LB培養(yǎng)基[15]中（各種培養(yǎng)基均添加100 μg/mL Amp和25 μg/mL Kana），37 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)，其中M9、TB、2YT、SOC和LB培養(yǎng)基菌液OD600 nm=0.6～0.8時(shí)，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，自誘導(dǎo)培養(yǎng)基無(wú)需添加誘導(dǎo)劑IPTG，于37 ℃、150 r/min誘導(dǎo)20 h后，取1 mL誘導(dǎo)菌液進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）分析。

1.2.2 誘導(dǎo)溫度的確定

將培養(yǎng)12 h的含有重組質(zhì)粒pQE-30-luxS的E. coli M15菌液按1%接種量接種至LB培養(yǎng)基（添加100 μg/mL Amp 和25 μg/mL Kana）中，37 ℃、150 r/min培養(yǎng)至菌液OD600 nm=0.6～0.8，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG進(jìn)行重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)，分別于25、30、37 ℃，150 r/min誘導(dǎo)20 h后，取1 mL誘導(dǎo)菌液進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.3 誘導(dǎo)前菌體生物量的確定

將培養(yǎng)12 h的含有重組質(zhì)粒pQE-30-luxS的E. coli M15菌液按1%接種量接種至LB培養(yǎng)基（添加100 μg/mL Amp和25 μg/mL Kana）中，37 ℃、150 r/min培養(yǎng)至菌液OD600 nm分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2時(shí)，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG進(jìn)行重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)，于37 ℃、150 r/min誘導(dǎo)20 h后，取1 mL誘導(dǎo)菌液進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.4 誘導(dǎo)時(shí)間的確定

將培養(yǎng)12 h的含有重組質(zhì)粒pQE-30-luxS的E. coli M15菌液按1%接種量接種至LB培養(yǎng)基（添加100 μg/mL Amp 和25 μg/mL Kana）中，37 ℃、150 r/min培養(yǎng)至菌液OD600 nm=0.6～0.8，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG進(jìn)行重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)，分別于37 ℃、150 r/min誘導(dǎo)4、6、8、10、12、14、16、18、20 h后，取1 mL誘導(dǎo)菌液進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.5 誘導(dǎo)劑IPTG濃度的確定

將培養(yǎng)12 h的含有重組質(zhì)粒pQE-30-luxS的E. coli M15菌液按1%接種量接種至LB培養(yǎng)基（添加100 μg/mL Amp 和25 μg/mL Kana）中，37 ℃、150 r/min培養(yǎng)至菌液OD600 nm=0.6～0.8，加入不同濃度的IPTG（終濃度分別為0、0.1、0.25、0.5、0.75、1.0、1.25 mmol/L）進(jìn)行重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)，于37 ℃、150 r/min誘導(dǎo)12 h后，取1 mL誘導(dǎo)菌液進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.6 重組蛋白LuxS存在形式的檢測(cè)

將培養(yǎng)12 h的含有重組質(zhì)粒pQE-30-luxS的E. coli M15菌液按1%接種量接種至LB培養(yǎng)基（添加100 μg/mL Amp和25 μg/mL Kana）中，37 ℃、150 r/min培養(yǎng)至菌液OD600 nm=0.6～0.8，加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG進(jìn)行重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)，37 ℃、150 r/min誘導(dǎo)12 h后，6 000 r/min離心10 min收集菌體，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）漂洗菌體2 次，將菌體重懸于1/10原體積的PBS中，加入溶菌酶（終質(zhì)量濃度為1 mg/mL）、PMSF（終質(zhì)量濃度為100 μg/mL），于37 ℃、150 r/min振蕩孵育1 h，然后液氮反復(fù)凍融3 次裂解菌體（每次在液氮中冷凍3 min后，置于37 ℃水浴融化）；14 000 r/min、4 ℃離心10 min，分別收集上清和沉淀，沉淀用PBS漂洗2 次后重懸于原體積的PBS中，將上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.7 純化條件的優(yōu)化

按1.2.6節(jié)所述方法收集重組蛋白溶液，參照Ni-NTA Purification System說(shuō)明書(shū)分別對(duì)重組蛋白LuxS純化過(guò)程中Native Elution Buffer的咪唑濃度及pH值進(jìn)行優(yōu)化，首先進(jìn)行咪唑濃度優(yōu)化，Native Elution Buffer咪唑濃度分別為250、375、500、625 mmol/L（pH 8.0），在得到的最優(yōu)咪唑濃度水平上對(duì)Native Elution Buffer的pH值進(jìn)行優(yōu)化，pH值分別為8.0、7.5、7.0、6.5，分別用4 mL和2 mL的Native Elution Buffer先后進(jìn)行2 次蛋白洗脫，通過(guò)SDS-PAGE分析純化效果。

按1.2.6節(jié)所述方法收集誘導(dǎo)后菌體，分別進(jìn)行3 組實(shí)驗(yàn)，樣品分別編號(hào)1、2、3號(hào)。第1組：將菌體重懸于1/10原體積的PBS中，然后按照1.2.6節(jié)所述方法進(jìn)行菌體裂解，收集上清。參照Ni-NTA Purification System說(shuō)明書(shū)對(duì)重組蛋白LuxS進(jìn)行純化，用4 mL優(yōu)化后的Native Elution Buffer對(duì)重組蛋白LuxS進(jìn)行洗脫。第2組：按照第1組方法收集裂解上清后，在上清中加入終濃度為3 mol/L的NaCl溶液后，對(duì)重組蛋白LuxS進(jìn)行純化，其他同第1組操作相同。第3組：將菌體重懸于1/10原體積的Native Binding Buffer中，然后按照1.2.6節(jié)所述方法進(jìn)行菌體裂解，收集上清后對(duì)重組蛋白LuxS進(jìn)行純化，其他同第1組操作相同。3 組實(shí)驗(yàn)的純化效果通過(guò)SDS-PAGE進(jìn)行分析。

1.2.8 在優(yōu)化條件下重組蛋白LuxS的合成

按1.2.6節(jié)所述方法收集重組蛋白溶液，在重組蛋白溶液中加入終濃度為3 mol/L的NaCl，參照Ni-NTA Purification System說(shuō)明書(shū)對(duì)重組蛋白LuxS進(jìn)行純化，用4 mL含500 mmol/L咪唑的Native Elution Buffer（pH 6.5）洗脫LuxS蛋白。將洗脫液密封于透析袋（截留分子質(zhì)量3 500 u）中，置于10 mmol/L磷酸鈉緩沖液（pH 7.5）中透析過(guò)夜，期間更換幾次透析液。將透析過(guò)的蛋白溶液用超濾管（截留分子質(zhì)量3 000 u）進(jìn)行濃縮5～10 倍，采用BCA法蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。在10 mmol/L的磷酸鈉緩沖液（pH 7.5）中添加1 mmol/L的SAH、1 mg/mL 的Pfs蛋白和1 mg/mL的LuxS蛋白[16]，37 ℃水浴1 h，用超濾管（截留分子質(zhì)量3 000 u）濾除蛋白，收集濾液，用哈氏弧菌BB170報(bào)告菌株檢測(cè)AI-2生物活性[17]，以哈氏弧菌BB120無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)上清作為陽(yáng)性對(duì)照，10 mmol/L磷酸鈉緩沖液（pH 7.5）作為陰性對(duì)照，將陽(yáng)性對(duì)照中AI-2生物活性定義為100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

本課題組前期通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）克隆出植物乳桿菌KLDS1.0391中的luxS基因，成功將其插入表達(dá)載體pQE-30中，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pQE-30-luxS，并將重組質(zhì)粒導(dǎo)入E. coli M15中，成功表達(dá)出重組蛋白LuxS[14]。為了提高重組蛋白的表達(dá)量，本研究從誘導(dǎo)培養(yǎng)基、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)前菌體生物量、誘導(dǎo)時(shí)間以及誘導(dǎo)劑IPTG濃度5 個(gè)方面進(jìn)行優(yōu)化[18-20]。

2.1.1 誘導(dǎo)培養(yǎng)基的確定

圖1 誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)重組蛋白LuxS表達(dá)的影響Fig.1 Effect of different induction media on the expression of recombinant protein LuxS

將含有重組質(zhì)粒pQE-30-luxS的E. coli M15在不同培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，其中LB、2TY、SOC、TB和M9培養(yǎng)基以IPTG作為誘導(dǎo)劑，自誘導(dǎo)培養(yǎng)基以乳糖作為誘導(dǎo)劑。SDS-PAGE分析結(jié)果顯示如圖1所示，LB、2YT、TB 和M9培養(yǎng)基均可誘導(dǎo)重組蛋白LuxS的表達(dá)，其中LB、2YT和TB培養(yǎng)基誘導(dǎo)效果較好，由于2YT、TB培養(yǎng)基比LB培養(yǎng)基成本高，且LB培養(yǎng)基完全滿足菌體生長(zhǎng)與蛋白表達(dá)的需要，綜合考慮選擇LB培養(yǎng)基作為誘導(dǎo)培養(yǎng)基。結(jié)果表明，LB、2YT和TB培養(yǎng)基作為誘導(dǎo)培養(yǎng)基時(shí)，重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)量較高，LB、2YT和TB培養(yǎng)基均營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，尤其是氮源和碳源豐富，由此說(shuō)明，培養(yǎng)基成分對(duì)重組蛋白的表達(dá)有很大的影響。同時(shí)，自誘導(dǎo)培養(yǎng)基以乳糖作為誘導(dǎo)劑，沒(méi)有誘導(dǎo)重組蛋白LuxS的表達(dá)，并且乳糖在培養(yǎng)基中既可作為誘導(dǎo)劑，又能夠作為一種碳源被菌體代謝，所以在誘導(dǎo)過(guò)程中也會(huì)很不穩(wěn)定，需要的乳糖劑量也比IPTG高出很多[21]。

圖2 誘導(dǎo)溫度對(duì)重組蛋白LuxS表達(dá)的影響Fig.2 Effect of induction temperature on the expression of recombinant protein LuxS

2.1.2 誘導(dǎo)溫度的確定

由圖2可知，重組蛋白LuxS在37 ℃條件下誘導(dǎo)表達(dá)量最高（泳道1），選擇37 ℃作為重組蛋白LuxS的誘導(dǎo)溫度。誘導(dǎo)溫度不僅影響菌體的生長(zhǎng)，同樣影響著重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及蛋白的可溶性[22]。一些種類的蛋白在誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)容易出現(xiàn)錯(cuò)誤性折疊，從而形成包涵體沉淀，而低溫誘導(dǎo)可以有助于蛋白的可溶性表達(dá)[23]。本研究中的LuxS蛋白可溶性較好、不易形成包涵體，主要以可溶性蛋白形式存在。37 ℃是大腸桿菌最適的生長(zhǎng)溫度，并且從圖2中看出，誘導(dǎo)溫度為37 ℃時(shí)LuxS蛋白表達(dá)量最高，所以本研究選取37 ℃作為L(zhǎng)uxS蛋白的誘導(dǎo)溫度。

2.1.3 誘導(dǎo)前菌體生物量的確定

圖3 誘導(dǎo)前菌體生物量對(duì)重組蛋白LuxS表達(dá)的影響Fig.3 Effect of bacterial biomass before induction on the expression of recombinant protein LuxS

由圖3可知，誘導(dǎo)前菌體生物量對(duì)重組蛋白LuxS誘導(dǎo)表達(dá)無(wú)明顯影響，所以選擇OD600nm= 0.6～0.8的代謝相對(duì)旺盛的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌體進(jìn)行重組蛋白LuxS的誘導(dǎo)表達(dá)。此時(shí)的菌體生長(zhǎng)迅速，代謝旺盛，有利于重組蛋白的表達(dá)。

2.1.4 誘導(dǎo)時(shí)間的確定

圖4 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)重組蛋白LuxS表達(dá)的影響Fig.4 Effect of induction time on the expression of recombinant protein LuxS

由圖4可知，重組蛋白LuxS誘導(dǎo)表達(dá)量在誘導(dǎo)12 h后達(dá)到最高，12 h后產(chǎn)量無(wú)明顯變化，所以選擇12 h作為重組蛋白LuxS的誘導(dǎo)時(shí)間。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，重組蛋白產(chǎn)量增加，同時(shí)菌體內(nèi)的蛋白酶對(duì)重組蛋白的降解也會(huì)增加，所以過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的誘導(dǎo)對(duì)重組蛋白的表達(dá)同樣不利。

2.1.5 誘導(dǎo)劑IPTG濃度的確定

圖5 IPTG濃度對(duì)重組蛋白LuxS表達(dá)的影響Fig.5 Effect of IPTG concentration on the expression of recombinant protein LuxS

由圖5可知，IPTG濃度對(duì)重組蛋白LuxS誘導(dǎo)表達(dá)無(wú)明顯影響，由于高濃度的IPTG對(duì)菌株有一定的毒害作用，所以選擇終濃度為0.1 mmol/L的IPTG作為重組蛋白LuxS的誘導(dǎo)劑。IPTG作為一種強(qiáng)誘導(dǎo)劑，在菌體中不能夠被代謝，可以持續(xù)地發(fā)揮作用，所以少量的IPTG就可以起到很好的誘導(dǎo)效果。采用較低濃度的IPTG可以適當(dāng)?shù)慕档娃D(zhuǎn)錄速率，有利于蛋白的可溶性表達(dá)[24]。

2.2 重組蛋白LuxS的存在形式

由圖6可知，重組蛋白LuxS以可溶性蛋白形式存在（泳道4），沉淀中（泳道3）只有少量蛋白殘留。

圖6 重組蛋白LuxS的存在形式Fig.6 Detection of the form of recombinant protein LuxS

2.3 純化條件的優(yōu)化

圖7 不同Native Elution Buffer對(duì)重組蛋白LuxS純化的影響Fig.7 Effect of different types of native elution buffer on the purifi cation effi ciency of recombinant protein LuxS

由圖7A可知，隨咪唑濃度提高，Native Elution Buffer對(duì)LuxS蛋白的洗脫效果逐漸提高，咪唑濃度達(dá)到500 mmol/L后繼續(xù)提高咪唑濃度洗脫效果無(wú)明顯差異。所以選定500 mmol/L作為Native Elution Buffer的咪唑濃度。在500 mmol/L咪唑濃度的基礎(chǔ)上繼續(xù)優(yōu)化Native Elution Buffer的pH值，SDS-PAGE分析結(jié)果（圖7B）顯示，隨pH值降低Native Elution Buffer對(duì)LuxS蛋白的洗脫效果逐漸提高，pH值降至6.5時(shí)Native Elution Buffer洗脫效果最好，經(jīng)4 mL的Native Elution Buffer洗脫后殘留蛋白最少（圖7B的泳道9）。

本研究對(duì)重組蛋白的純化條件進(jìn)行優(yōu)化。采用Ni-NTA Purification System對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化，鎳離子親和樹(shù)脂與帶有組氨酸標(biāo)記的重組蛋白結(jié)合，通過(guò)漂洗去除雜蛋白后，對(duì)目的蛋白進(jìn)行洗脫回收。重組蛋白的洗脫采用含有咪唑的溶液，咪唑作為一種競(jìng)爭(zhēng)性取代劑，與重組蛋白競(jìng)爭(zhēng)樹(shù)脂上的結(jié)合位點(diǎn)，使重組蛋白得以洗脫[21]。本研究中先采用提高咪唑濃度的方法改善洗脫效果，發(fā)現(xiàn)效果并不太理想，進(jìn)而又采用了降低洗脫液pH值的方法進(jìn)行優(yōu)化。較低的pH值可以減弱重組蛋白與樹(shù)脂結(jié)合位點(diǎn)的作用，從而使重組蛋白更容易被競(jìng)爭(zhēng)性洗脫[25]。不過(guò)過(guò)低的pH值對(duì)蛋白活性有影響，所以最終確定洗脫液的pH值為6.5。

圖8 不同結(jié)合緩沖液對(duì)重組蛋白LuxS純化的影響Fig.8 Effect of different types of binding buffer on the purifi cation effi ciency of recombinant protein LuxS

在對(duì)洗脫液進(jìn)行優(yōu)化的同時(shí)，本研究也優(yōu)化了蛋白與樹(shù)脂結(jié)合的緩沖液，由圖8可知，在用PBS重懸菌體得到的裂解上清中添加3 mol/L的NaCl后，進(jìn)行重組蛋白LuxS的純化，獲得的純化效果最好（圖8泳道5）。NaCl可以減弱重組蛋白與樹(shù)脂結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合，從而使重組蛋白在洗脫時(shí)更易被洗脫。

2.4 在優(yōu)化條件下重組蛋白LuxS的合成

圖9 在優(yōu)化條件下重組蛋白LuxS的誘導(dǎo)表達(dá)與純化結(jié)果Fig.9 Expression and purifi cation of recombinant protein LuxS

由圖9可知，在優(yōu)化條件下誘導(dǎo)表達(dá)并純化得到重組蛋白LuxS，經(jīng)透析、濃縮后對(duì)LuxS蛋白質(zhì)量濃度進(jìn)行測(cè)定，獲得的重組蛋白質(zhì)量濃度為5.23 mg/mL。以SAH為底物，經(jīng)Pfs和LuxS蛋白催化，合成了具有生物活性的AI-2（圖10），體外合成的AI-2活力約為陽(yáng)性對(duì)照的6 倍，說(shuō)明純化得到的重組蛋白LuxS具有生物活性。

圖10 AI-2的生物活性Fig.10 Determination of AI-2 activity

通過(guò)對(duì)重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)、純化條件的優(yōu)化，提高了重組蛋白的產(chǎn)量，獲得了大量的重組蛋白LuxS。以SAH為底物，通過(guò)Pfs和LuxS蛋白的催化，成功合成了具有生物活性的AI-2，為后續(xù)研究AI-2信號(hào)分子的作用奠定基礎(chǔ)。

3 結(jié) 論

本研究成功優(yōu)化了重組蛋白LuxS的誘導(dǎo)表達(dá)條件及純化條件，最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件為：以LB培養(yǎng)基為誘導(dǎo)培養(yǎng)基，菌液OD600 nm為0.6～0.8，IPTG濃度為0.1 mmol/L，誘導(dǎo)溫度為37 ℃，誘導(dǎo)時(shí)間為12 h。最佳純化條件為：采用添加3 mol/L NaCl的PBS溶液作為蛋白與樹(shù)脂結(jié)合的緩沖液，含500 mmol/L咪唑的Native Elution Buffer（pH 6.5）作為蛋白洗脫液對(duì)蛋白進(jìn)行純化。在優(yōu)化條件下對(duì)重組蛋白LuxS進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)及純化，獲得5.23 mg/mL的重組蛋白LuxS。

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Optimization of Expression and Purifi cation Conditions of Recombinant Protein LuxS

YANG Jie, ZHANG Yun, MENG Xiangchen*
(Key Laboratory of Dairy Science, Ministry of Education, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

Objective: To optimize the expression and purifi cation conditions of recombinant protein LuxS. Methods: The induction conditions, including medium components, induction temperature, bacterial biomass before induction, induction time and IPTG concentration were optimized by single-factor design. Recombinant protein was purified using Ni-NTA purifi cation system under native conditions. The optimum native elution buffer was determined by comparing the effects of imidazole concentration and native elution buffer pH on purifi cation effi ciency. The optimum binding buffer for protein and resin was determined by comparing the effects of different types of binding buffer on purifi cation effi ciency. Results: The optimum conditions for expression of recombinant protein were determined as follows: when the OD600 nmreached 0.6-0.8, using LB medium as the induction medium, the induction was initiated with 0.1 mmol/L IPTG at 37 ℃ for 12 h. PBS buffer containing 3 mol/L NaCl was used for the binding of protein and resin. The recombinant protein was eluted with native elution buffer (pH 6.5) containing 500 mmol/L imidazole. The biological activity of the synthesized AI-2 in vitro, which was produced catalytically by Pfs and recombinant protein LuxS obtained in this study, was approximately 6-fold higher than that from the positive control. Conclusion: The expression and purifi cation conditions of recombinant protein LuxS were optimized, and the recombinant protein LuxS with bioactivity was obtained. Finally, AI-2 was synthesized successfully in vitro.

recombi nant protein; LuxS; induced expression; purifi cation; autoinducer-2 (AI-2)

TS201.3

A

1002-6630（2015）19-0170-06

10.7506/spkx1002-6630-201519030

2014-10-21

教育部博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金項(xiàng)目（20122325110017）；黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究（重點(diǎn)）計(jì)劃項(xiàng)目（12521Z002）

楊杰（1990-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称肺⑸锱c生物技術(shù)。E-mail：yangjingjie1990902@163.com

*通信作者：孟祥晨（1970-），女，教授，博士研究生，研究方向?yàn)槭称肺⑸锱c生物技術(shù)。E-mail：xchmeng@163.com