趙忠勝，朱德強(qiáng)，王永遠(yuǎn)，鄭志永，詹曉北

(糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無(wú)錫，214122)

熱凝膠是一種水不溶性β-(1，3)葡聚糖線性分子［1］，由土壤桿菌(Agrobacterium sp.舊名 Alcaligenes faecalis)、根瘤菌等微生物在氮源限制條件下分泌產(chǎn)生［2］。熱凝膠分子在中性或酸性條件下會(huì)形成右手三螺旋結(jié)構(gòu)［3］，具有熱成膠性、抗凍融性及抗脫水性等特點(diǎn)，在食品工業(yè)具有廣泛應(yīng)用。

國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)熱凝膠的生產(chǎn)工藝做了比較深入的研究，Lee等用蔗糖或糖蜜為碳源進(jìn)行熱凝膠發(fā)酵研究，采用兩步補(bǔ)料發(fā)酵工藝，第一步用來(lái)培養(yǎng)菌體，第二步用氮源限制來(lái)進(jìn)行熱凝膠的合成［4］。國(guó)內(nèi)采用培養(yǎng)基的優(yōu)化［5］、碳源氮源的連續(xù)流加［6］及添加高能磷酸鍵前體物質(zhì)［7］等多種發(fā)酵策略用于提高熱凝膠的產(chǎn)量。提高菌體濃度能明顯提高熱凝膠產(chǎn)量。增加氮源，能提高菌體濃度，進(jìn)而提高熱凝膠的產(chǎn)量［6］。然而過(guò)多的增加菌體濃度，會(huì)使菌體消耗較多的碳源，降低了單位碳源的熱凝膠轉(zhuǎn)化率［8］。熱凝膠合成及調(diào)控機(jī)理目前尚不十分明確，通過(guò)分子生物學(xué)手段強(qiáng)化熱凝膠合成的研究少有報(bào)道。已經(jīng)完成 Agrobacterium sp.ATCC 31749 全基因組測(cè)序［9］，通過(guò)其基因組的對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，土壤桿菌中exoR基因與根瘤菌的exoR高度同源。在根瘤菌中，exoR是一類產(chǎn)胞外多糖的負(fù)調(diào)節(jié)因子，其在細(xì)胞周質(zhì)中與exoS相互作用，抑制exoS/chvI雙組分信號(hào)。exoS以二聚體的形式附著在于內(nèi)膜上，其位于周質(zhì)空間的傳感器結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)識(shí)別環(huán)境信號(hào)分子。信號(hào)被識(shí)別后，磷酸化的exoS激酶激活該系統(tǒng)中的chvI響應(yīng)調(diào)節(jié)器。chvI能抑制 exoY，exoP，exoQ，exoA，exoF 基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制受調(diào)控胞外多糖的產(chǎn)生［10-11］。

Agrobacterium sp.中熱凝膠合成代謝組分exoR的功能及其在熱凝膠合成方面的調(diào)節(jié)機(jī)理并不清楚。exoR作為一類產(chǎn)胞外多糖負(fù)調(diào)節(jié)因子，極有可能參與Agrobacterium sp.合成熱凝膠的代謝調(diào)控。基于上述考慮，本文嘗試通過(guò)三親結(jié)合法［12］敲除Agrobacterium sp.ATCC 31749基因組中的exoR基因，通過(guò)搖瓶發(fā)酵研究ΔexoR突變株的生長(zhǎng)特性及exoR在合成熱凝膠的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

實(shí)驗(yàn)采用的菌株，質(zhì)粒和引物見(jiàn)表1。

1.1.2 主要試劑和儀器

1.1.2.1 主要試劑

限制性內(nèi)切酶購(gòu)自Fermentas公司;Taq DNA聚合酶、氨芐青霉素(Amp)、硫酸鏈霉素(Str)、慶大霉素(Gm)、卡那霉素(Kan)、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒等，購(gòu)自上海生物工程公司;PrimeSTAR酶、Solution I連接液、dNTPs、pMD-19 Simple T vector等，購(gòu)自中國(guó) TaKaRa公司。

1.1.2.2 主要儀器

TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)，湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司;Bioer Little Genius PCR儀，杭州博日科技有限公司;JY300型電泳儀，君意東方電泳設(shè)備有限公司;上清液用高效液相色譜儀，日本島津。

表1 實(shí)驗(yàn)所使用的菌株，質(zhì)粒和引物Table 1 Strains，plasmids andprimers used in this work

1.1.3 培養(yǎng)基

大腸桿菌菌株均采用LB培養(yǎng)基，在37℃，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min培養(yǎng)。Agrobacterium sp.系列菌株培養(yǎng)條件為30℃，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，培養(yǎng)基組成如下:

斜面培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖40，酵母粉5.0，瓊脂粉 2.0，CaCO35.0，pH 7.0～7.2。

種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20，酵母粉10，KH2PO41.74，MgSO40.5，pH 7.0～7.2。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖50，酵母粉1.0，KH2PO42.7，K2HPO4·3H2O 2.23，NH4Cl 2.0，MgSO40.5，CaCO35.0，10 mL 無(wú)機(jī)鹽濃縮液，pH 7.0～7.2。

無(wú)機(jī)鹽濃縮液(g/L):FeCl3·6H2O 1.0，NaCl 1.0，CaCl21.0，MnCl21.0。

1.2 方法

1.2.1 種子培養(yǎng)

從斜面上挑取1環(huán)菌，接入裝有50 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，于30℃、200 r/min搖床培養(yǎng)18 h。

1.2.2 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

將2.5 mL種子液接入裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶，于30℃、200 r/min搖床培養(yǎng)72 h。

1.2.3 熱凝膠含量測(cè)定

干重法。取20 mL發(fā)酵液于8 000 r/min離心20 min，向離心得到的沉淀中添加1 mol/L的NaOH溶液20 mL并振蕩3 h，使熱凝膠充分溶解，然后離心(8 000 r/min，20 min)取上清液，用 4 mol/L HCl調(diào)pH至中性，得到半透明的凝膠，再離心(8 000 r/min，20 min)，向沉淀中加蒸餾水洗滌離心4次，在80℃烘干至恒重，稱重計(jì)算產(chǎn)量。

1.2.4 生物量測(cè)定

菌體生長(zhǎng)期的生物量用OD600表示。

1.2.5 殘?zhí)菧y(cè)定

高效液相色譜法。取1 mL樣品，在8 000 r/min條件下離心10 min，上清液用高效液相色譜檢測(cè)(LC-2010A，日本島津)。色譜柱:Bio-Rad Aminex HPX-87H column，300 mm ×7.8 cm;柱溫:35 ℃;流動(dòng)相:5 mmol/L H2SO4;流速:0.6 mL/min;檢測(cè)器:示差折光檢測(cè)器;進(jìn)樣量:2 μL。

1.2.6 殘余氯化銨含量測(cè)定

水楊酸鈉-次氯酸鈉比色法［13］。

1.2.7 exoR基因片段的克隆及序列分析

根據(jù)NCBI中 Agrobacterium sp.ATCC 31749(以下簡(jiǎn)稱ATCC 31749)exoR基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物exoR-F/R，實(shí)驗(yàn)所涉及引物都如表1所示;以ATCC 31749基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒純化回收后用于下一步試驗(yàn)。

1.2.8 自殺重組質(zhì)粒pJQ-exoR-kan的構(gòu)建

利用自殺質(zhì)粒pJQ200KS進(jìn)行exoR基因插入突變［14］。將回收純化的exoR基因片段連接到pMD-19 Simple T載體上，陽(yáng)性克隆質(zhì)粒命名為pMD-exoR，提取質(zhì)粒進(jìn)行exoR測(cè)序分析。以pKD4質(zhì)粒上卡那霉素抗性基因(kan)序列為參照和模板，設(shè)計(jì)引物并擴(kuò)增kan片段，引物兩端設(shè)計(jì)有酶切位點(diǎn)Hind III和Kpn I。將回收純化的kan基因片段連接到pMD-19 Simple T載體上，陽(yáng)性克隆質(zhì)粒命名為pMD-kan，提取質(zhì)粒進(jìn)行kan測(cè)序分析。因?yàn)閑xoR基因中間沒(méi)有合適的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，根據(jù)質(zhì)粒pMD-exoR基因序列設(shè)計(jì)引物pMD-exoR-F/R，定點(diǎn)突變出Kpn I的酶切位點(diǎn)。陽(yáng)性克隆質(zhì)粒命名為突變pMD-exoR，提取質(zhì)粒進(jìn)行 exoR測(cè)序分析。將pMD-kan和突變pMD-exoR同時(shí)進(jìn)行Hind III和Kpn I雙酶切連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109宿主菌，采用Amp和Kan雙抗性及PCR篩選陽(yáng)性克隆，質(zhì)粒命名為pMD-exoR-kan，此時(shí)exoR基因結(jié)構(gòu)被kan片段插入而成功破壞。將質(zhì)粒pMD-exoR-kan和自殺質(zhì)粒pJQ200KS同時(shí)用Sal I和Sac I進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物exoR-kan片段和線性pJQ200KS經(jīng)連接后，轉(zhuǎn)化 DH5α λpir宿主菌，用含有50 mg/L Kan，50 mg/L Gm的LB平板進(jìn)行篩選，所得單菌落為連接有exoR-kan片段的陽(yáng)性克隆。挑取單菌落、培養(yǎng)、提質(zhì)粒進(jìn)行PCR和測(cè)序驗(yàn)證，得到本研究所需的自殺重組質(zhì)粒，命名為pJQ-exoR-kan。

1.2.9 Agrobacterium sp.ATCC 31749 exoR基因缺陷株的構(gòu)建

采用三親本接合的方法將含有自殺重組質(zhì)粒的DH5α λpir細(xì)胞分別和含有輔助質(zhì)粒 PRK2013的DH5α細(xì)胞以及 ATCC 31749細(xì)胞，按1∶1∶2的比例混合，進(jìn)行接合反應(yīng)。在含50 mg/L Str，50 mg/L Kan和50 mg/L Gm的ATCC 31749種子培養(yǎng)基上篩選發(fā)生重組交換的exoR基因突變株。將交換成功的轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)基稀釋涂布于含5%蔗糖，50 mg/L Str和50 mg/L Kan ATCC 31749平板種子培養(yǎng)基上。挑單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證，exoR-F/R為引物，將只出現(xiàn)2 000 bp大小條帶的菌確定為同源雙交換成功的菌。再經(jīng)測(cè)序最終確定結(jié)構(gòu)被破壞的exoR-kan片段經(jīng)過(guò)同源雙交換整合到ATCC 31749的染色體基因組上，突變株命名為ΔexoR，并進(jìn)行多代轉(zhuǎn)接保存用于后續(xù)研究。

2 結(jié)果與分析

本研究通過(guò)構(gòu)建產(chǎn)胞外多糖負(fù)調(diào)節(jié)子exoR的基因缺陷株，以期強(qiáng)化土壤桿菌合成熱凝膠的過(guò)程。

2.1 exoR基因的擴(kuò)增及序列分析

從土壤桿菌ATCC 31749中PCR擴(kuò)增得到的exoR基因片段，連接克隆載體pMD-19 Simple T后進(jìn)行測(cè)序分析，exoR基因片段大小為1 245bp。將測(cè)序結(jié)果在NCBI中比對(duì)其DNA序列與Agrobacterium sp.ATCC 31749染色體基因組上exoR基因序列有100%的一致性。確認(rèn)了所克隆的基因片段的正確性。

2.2 exoR突變菌株的構(gòu)建

通過(guò)三親接合的方法將自殺性質(zhì)粒pJQ-exoR-kan整合到野生型菌株染色體上，獲得exoR基因的突變菌株，隨后通過(guò)菌體抗生素抗性和PCR擴(kuò)增驗(yàn)證了該突變株中exoR基因突變的正確性。抗性篩選結(jié)果表明突變株能在50 mg/L Kan平板上生長(zhǎng)，而野生株則不能。結(jié)果表明，從exoR突變株中擴(kuò)增到了預(yù)期大小的exoR-kan片段，而從野生菌株中只能擴(kuò)增到exoR片段(如圖1所示)。最后將擴(kuò)增得到的exoR-kan進(jìn)行測(cè)序分析，以上三方面結(jié)果均證明自殺性質(zhì)粒整合到了基因組DNA上，exoR基因結(jié)構(gòu)被成功敲除。

圖1 PCR產(chǎn)物的凝膠電泳Fig.1 Gel electrophoresis of the PCR products

2.3 土壤桿菌ATCC 31749野生型和ΔexoR突變株的生長(zhǎng)特性比較

通過(guò)搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，分析比較了突變株相對(duì)于野生菌株在菌體生長(zhǎng)期生物量、氯化銨含量之間的差別，結(jié)果如圖2所示。

圖2 野生菌株與ΔexoR突變株生長(zhǎng)特性的比較Fig.2 Comparison of growth characteristics between wild type strain and ΔexoR mutant

氮源主要用于構(gòu)建菌體細(xì)胞物質(zhì)和含氮代謝物，熱凝膠合成過(guò)程是典型的非生長(zhǎng)耦聯(lián)型過(guò)程，氯化銨耗盡意味著培養(yǎng)體系中氮源處于嚴(yán)格限制狀態(tài)，菌體停止生長(zhǎng)繁殖，這一條件是熱凝膠開(kāi)始合成的先決條件。本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中發(fā)現(xiàn)不同初始氮源濃度將影響菌體生物量的積累，進(jìn)而影響熱凝膠的合成速率［8］。ΔexoR突變株消耗氯化銨的速度低于野生菌株，但是在發(fā)酵16 h時(shí)，氯化銨都耗盡了，菌株進(jìn)入產(chǎn)膠期。突變株的生物量積累量始終低于野生菌株。突變株積累的生物量比野生菌株低了10.11%。盡管消耗相同量的氯化銨，但是突變株的生物量對(duì)氯化銨的得率降低了。

2.4 ΔexoR突變株對(duì)細(xì)菌微莢膜的影響

莢膜是細(xì)胞外包圍的一層黏液性物質(zhì)，由多糖和糖蛋白的多聚體組成，在細(xì)胞表面，保護(hù)細(xì)胞使其免受外部環(huán)境的傷害。厚度小于0.2 μm的稱為微莢膜。在暗色背景下莢膜呈透明狀環(huán)繞菌體［15］。在熱凝膠發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中，Agrobacterium sp.ATCC 31749在菌體生長(zhǎng)期沒(méi)有熱凝膠合成，這是因?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)條件限制是誘發(fā)熱凝膠合成的必要條件，而通常氮源是菌體生長(zhǎng)和熱凝膠合成解耦聯(lián)的關(guān)鍵因素。當(dāng)?shù)闯渥悖w只進(jìn)行生物量的積累;而在氮源耗盡時(shí)，菌體停止生長(zhǎng)并開(kāi)始合成熱凝膠。我們對(duì)處于生長(zhǎng)期的細(xì)菌做了透射電子顯微鏡觀察，如圖3，ΔexoR突變株細(xì)胞外圍的亮色條帶明顯比野生菌株暗。說(shuō)明exoR基因的缺失引起細(xì)胞非熱凝膠胞外多糖合成的減少，進(jìn)而節(jié)省碳源用于其它物質(zhì)的合成。

2.5 野生型和ΔexoR突變株的葡萄糖消耗和熱凝膠產(chǎn)量特性的比較

圖3 在細(xì)胞生長(zhǎng)期時(shí)野生菌株與ΔexoR突變株微莢膜的比較Fig.3 Comparison of microcapsule between wild type strain and ΔexoR mutant during cell growth phase

土壤桿菌31749合成熱凝膠過(guò)程中需要消耗大量能量物質(zhì)。熱凝膠合成的前體物質(zhì)UDP-葡萄糖(UDPG)由一分子UTP脫去一分子的磷元素后和一分子葡萄糖共價(jià)結(jié)合形成。在熱凝膠合成過(guò)程中，UDPG連續(xù)的將葡萄糖單元轉(zhuǎn)移到糖鏈上，最終聚合形成熱凝膠。這個(gè)過(guò)程需要不斷的消耗葡萄糖［16］。由圖4可知，在發(fā)酵31 h后ΔexoR突變株利用葡萄糖的速率相對(duì)野生菌株開(kāi)始加快。一定時(shí)間內(nèi)菌體消耗用于維持自身代謝的葡萄糖的量是一定的，葡萄糖攝取速率的增加，熱凝膠多糖的底物轉(zhuǎn)化率也會(huì)增加，說(shuō)明突變株可能會(huì)產(chǎn)生更多的熱凝膠。

圖4 野生菌株與ΔexoR突變株葡萄糖消耗和熱凝膠產(chǎn)量的比較Fig.4 Comparison of residual glucose and curdlan production between wild type strain and ΔexoR mutant

2.6 野生型和ΔexoR突變株的產(chǎn)膠特性的比較

表2對(duì)土壤桿菌ATCC 31749發(fā)酵產(chǎn)熱凝膠結(jié)果進(jìn)行了分析。

表2 野生型和ΔexoR突變株的產(chǎn)膠特性的比較Table 2 Comparison of curdlanproduction characteristics between wild type strain and ΔexoR mutant

發(fā)酵結(jié)束時(shí)(72 h)，盡管葡萄糖消耗量相近，但ΔexoR缺失株熱凝膠產(chǎn)量比野生菌株的熱凝膠產(chǎn)量提高了16.8%，產(chǎn)物對(duì)碳源轉(zhuǎn)化率由0.51上升到0.61，提高了 19.6%，熱凝膠生產(chǎn)強(qiáng)度提高了16.7%。在土壤桿菌合成熱凝膠過(guò)程中，菌體消耗碳源主要用于菌體生長(zhǎng)、熱凝膠合成、釋放有機(jī)酸和CO2等副產(chǎn)物，以及代謝維持所需的能量耗散。從2.3節(jié)和2.4節(jié)中可以看出，ΔexoR缺失株和野生株碳源消耗量非常接近，ΔexoR缺失株的生物量有所減少，但熱凝膠的碳源轉(zhuǎn)化效率明顯提高。已知exoR是一類產(chǎn)胞外多糖的負(fù)調(diào)節(jié)因子［10］，ΔexoR缺失導(dǎo)致胞內(nèi)熱凝膠合成代謝的負(fù)調(diào)節(jié)因子得到解除，因此使熱凝膠的合成效率得到了提高，而用于合成代謝副產(chǎn)物和能量耗散的碳源消耗減少，碳元素代謝向熱凝膠合成的途徑遷移。實(shí)驗(yàn)室前期研究表明熱凝膠的理論得率系數(shù)是0.74［17］，相比野生菌，ΔexoR缺失株發(fā)酵得到熱凝膠的得率系數(shù)有明顯提高，更接近于理論得率系數(shù)。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，ΔexoR缺失株和野生菌株的培養(yǎng)條件相同，僅僅是exoR基因發(fā)生了缺失，因此有理由推斷是該基因參與了調(diào)控?zé)崮z的合成。

3 結(jié)論

土壤桿菌ATCC 31749是胞外多糖——熱凝膠的生產(chǎn)菌株，與許多胞外聚合物的生物合成過(guò)程類似，氮源限制也是開(kāi)啟土壤桿菌合成熱凝膠的關(guān)鍵控制因素。胞外多糖熱凝膠的合成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，需要一系列基因參與，近年來(lái)，越來(lái)越多的土壤桿菌中胞外多糖合成相關(guān)基因被鑒定［18］。本研究構(gòu)建了exoR基因缺失株，發(fā)現(xiàn)該基因缺失株的熱凝膠合成量和底物轉(zhuǎn)化率增加，參與調(diào)控?zé)崮z的合成。說(shuō)明exoR基因的缺失能強(qiáng)化土壤桿菌ATCC 31749合成熱凝膠的過(guò)程。但本文僅對(duì)exoR基因功能做了初步探究，進(jìn)一步的研究在本實(shí)驗(yàn)室仍在繼續(xù)開(kāi)展。

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