雷頌,竇建洲,梅志方,楊品紅,王伯華
(湖南文理學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,水產(chǎn)高效健康生產(chǎn)湖南省協(xié)同創(chuàng)新中心,環(huán)洞庭湖水產(chǎn)健康養(yǎng)殖及加工湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南常德,415000)
我國(guó)淡水魚產(chǎn)量穩(wěn)居世界高位,并保持每年5%的增長(zhǎng)勢(shì)頭。但目前我國(guó)淡水魚資源浪費(fèi)嚴(yán)重,產(chǎn)品開發(fā)利用與加工水平不高,淡水魚的加工利用只占到總魚量5%左右,而且其中絕大多數(shù)為冷凍冷藏及冰鮮品,深加工產(chǎn)品僅占很小的一部分[1]。鰱魚,四大家魚之一,又名白鰱,屬于鯉形目,鯉科。白鰱新鮮食用因其具有土腥味、骨刺多,銷路受到局限,經(jīng)濟(jì)效益低其附加值還沒有真正完全發(fā)掘出來(lái)。
鹽溶蛋白(salt soluble proteins,SSP)又稱肌原纖維蛋白[2],是肌肉中最重要的蛋白質(zhì),是決定肉制品品質(zhì)的最主要的蛋白,約占總蛋白含量的50% ~60%。研究表明鹽溶性蛋白性質(zhì)對(duì)魚肉的保水性、膠凝性等加工特性影響甚大[3]。鹽溶性蛋白質(zhì)中的幾種重要蛋白質(zhì)如肌球蛋白、機(jī)動(dòng)蛋白及機(jī)動(dòng)球蛋白的凝膠機(jī)理已研究的較為清楚。目前,對(duì)豬肉、牛肉、雞肉以及海水魚的鹽溶性蛋白做了較為詳細(xì)的研究,而針對(duì)淡水魚鹽溶性蛋白熱誘導(dǎo)凝膠保水性及其乳化性等加工特性的研究相對(duì)較少。深入研究白鰱鹽溶蛋白的功能性質(zhì)能促進(jìn)白鰱的深加工和新產(chǎn)品開發(fā),創(chuàng)造營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、安全天然的食品,提高白鰱的附加值、改善鮮銷壓力大的狀況具有重要的意義。
本試驗(yàn)以鮮活鰱魚為研究對(duì)象,優(yōu)化其鹽溶蛋白提取條件,并對(duì)鹽溶蛋白熱誘導(dǎo)凝膠保水性以及鹽溶蛋白乳化性等加工特性進(jìn)行研究,并探討其用作高檔天然肉糜制品品質(zhì)改良劑的可行性。
鮮活白鰱,購(gòu)自生鮮市場(chǎng)(質(zhì)量在1~1.25 kg/條);一級(jí)大豆油,購(gòu)自嘉里糧油(深圳)有限公司。
NaOH、NaCl、KI、CuSO4·5H2O、四水合酒石酸鉀鈉、HCl、Na2HPO4、NaH2PO4、三聚磷酸鈉,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司,均為分析純;標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白,北京馳明瑞生物科技有限公司;十二烷基磺酸鈉(SDS),生興生物技術(shù)(南京)有限公司,分析純。
LD4-2A低速離心機(jī),北京醫(yī)用離心機(jī)廠;JJ-2組織搗碎勻漿機(jī),富華儀器有限公司;DELTA320 pH計(jì),梅特勒-托麗多儀器(上海)有限公司;AL204電子分析天平,梅特勒-托麗多儀器有限公司;C12型絞肉機(jī),廣東省韶關(guān)市新通力食品機(jī)械有限公司;BCD-257SL冰箱,青島海爾股份有限公司;721N可見光分光光度計(jì),上海儀電分析儀器有限公司;ULTRA-TURRAX T25型高速分散儀,IKA儀科有限公司。
鹽溶蛋白的提取:取鰱魚背肉,剔出紅色肉,用絞肉機(jī)絞碎,稱取每份25 g,真空包裝后在-18℃下凍結(jié),備用。提取鹽溶蛋白時(shí),先將冷凍樣品在4℃下解凍,加入4倍質(zhì)量0~4℃的蒸餾水,用高速組織搗碎機(jī)勻漿(6 000 r/min,5 min)。再轉(zhuǎn)入離心管中,離心(3 000 r/min,10 min),去除上清液,重復(fù)1次,向沉淀中加入不同提取條件的 NaCl溶液,勻漿液在4℃靜置25 h后,紗布初濾,濾液經(jīng)(4 000 r/min,30 min)后得到上層溶液即為鹽溶蛋白質(zhì)溶液。
單因素試驗(yàn):在固液比為1∶4(g∶mL)、提取液pH值為6.5、浸提時(shí)間為25 h的條件下,設(shè)置鹽濃度(mol/L)0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 七個(gè)梯度進(jìn)行試驗(yàn),測(cè)定鹽濃度對(duì)鹽溶蛋白得率的影響;在NaCl濃度為0.6 mol/L、提取液 pH值為6.5、浸提時(shí)間為25 h的條件下,設(shè)置固液比(魚肉與添加溶液的比例,g∶mL)1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6 五個(gè)梯度進(jìn)行試驗(yàn),測(cè)定固液比對(duì)鹽溶蛋白得率的影響;在NaCl濃度為 0.6 mol/L、固液比1∶4、提取液 pH為6.5的條件下,設(shè)置浸提時(shí)間為5、10、15、20、25、30六個(gè)梯度進(jìn)行試驗(yàn),測(cè)定浸提時(shí)間對(duì)鹽溶蛋白得率的影響;在NaCl濃度為0.6 mol/L、固液比1∶4、浸提時(shí)間為 25 h,設(shè)置浸提 pH 值為 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0五個(gè)梯度進(jìn)行試驗(yàn),測(cè)定浸提 pH對(duì)鹽溶蛋白得率的影響。
提取工藝的優(yōu)化:采用正交試驗(yàn)法,通過(guò)以上單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)出正交試驗(yàn)如表1所示。
表1 正交因素實(shí)驗(yàn)水平Table1 Factors and levels for the orthogonal test
蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用雙縮脲法,以BSA(牛血清白蛋白)作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。
鹽溶蛋白熱誘導(dǎo)凝膠的制備及保水性的測(cè)定采用于?。?]等的方法略作修改:先稱離心管質(zhì)量(m),取鹽溶蛋白提取液10 mL置于干凈離心管中制備凝膠,在4℃下保存24 h,稱離心管和凝膠質(zhì)量m1,然后將凝膠在3 000 r/min、4℃下離心5 min,稱傾去水分后的離心管和凝膠的質(zhì)量m2,則:
鹽溶蛋白乳化性的測(cè)定參考郭玲[4]的方法略作修改:取一定量的鹽溶蛋白提取液調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)濃度為1%,將鹽溶蛋白提取液與大豆油按體積比3∶1的比例混合,在10 000 r/min的轉(zhuǎn)速下乳化1 min后立即倒入小燒杯中,在杯底取50 μL的乳化液加入到5 mL的0.1%SDS(十二烷基磺酸鈉)中,充分搖勻后在波長(zhǎng)500 nm處測(cè)定吸光度,重復(fù)4次。乳化活力指數(shù)(EAI)和乳化穩(wěn)定指數(shù)(ESI)用如下公式計(jì)算:
式中:A0,后迅速被稀釋的乳化液的吸光度;Φ,油相體積分?jǐn)?shù)(V/V,φ=0.25);c,蛋白質(zhì)量濃度,g/mL;A10,乳化液在靜置10 min后的吸光度。
由圖1可知,雙縮脲法測(cè)定鹽溶蛋白含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.039x+0.008 1,其R2=0.999,具有較好的擬合度,可用于鹽溶蛋白乳化性測(cè)定中蛋白濃度的調(diào)整。
圖1 蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Protein content standard curve
由圖2可知,其他因素固定不變條件下,提取液的鹽溶蛋白得率隨著鹽濃度的提高而增加,說(shuō)明鹽濃度在0.2~0.7 mol/L內(nèi),較高的鹽濃度能提高鹽溶蛋白的浸出率;鹽濃度在0.7 mol/L以上,提取液的蛋白濃度變化不大,尤其在0.5和0.6 mol/L濃度時(shí),提取液蛋白得率基本不變,0.8 mol/L提取濃度時(shí)得率稍有下降,表明在鹽濃度在0.7 mol/L時(shí),基本上將可溶的鹽溶蛋白提出。因此,鹽濃度0.7 mol/L是最優(yōu)的選擇,后續(xù)試驗(yàn)采取鹽濃度0.7 mol/L。
圖2 鹽濃度對(duì)鹽溶蛋白得率的影響Fig.2 Effects of salt concentration on salt soluble proteinyield
由圖3可知,提取液的鹽溶蛋白得率隨著固液比的增加而增加,從1∶3到1∶4之間增幅顯著,而后增幅緩慢。在要求提取液的鹽溶蛋白濃度和得率盡可能高的情況下,固液比1∶4為最優(yōu),后續(xù)試驗(yàn)采用鹽濃度 0.7 mol/L,固液比1∶4。
圖3 固液比對(duì)鹽溶蛋白得率的影響Fig.3 Effects of solid-liquid ratio on salt soluble protein yield
從圖4可以看出,提取液中蛋白含量隨著浸提時(shí)間的增加而增加,在25 h以前,隨時(shí)間的延長(zhǎng)蛋白含量增長(zhǎng)幅度較大;25 h以后,隨浸提時(shí)間的延長(zhǎng)蛋白質(zhì)含量增長(zhǎng)幅度很小。這表明,浸提25 h左右,鹽溶蛋白基本上都已溶出,如果時(shí)間過(guò)長(zhǎng),蛋白性質(zhì)會(huì)發(fā)生變化,不利于后期試驗(yàn),綜合考慮25 h是最佳的浸提時(shí)間,后續(xù)試驗(yàn)采取鹽濃度0.7 mol/L、固液比1∶4、提取時(shí)間為25 h。
圖4 時(shí)間與鹽溶蛋白得率的關(guān)系Fig.4 Effects of extraction time on salt soluble protein yield
從圖5可以看出,隨著pH值的改變,鹽溶蛋白得率的變化幅度非常大,表明pH值的變化對(duì)鹽溶蛋白的提取的影響很大。pH值從5.0到6.5,鹽溶蛋白得率迅速升高,pH為6.5時(shí)鹽溶蛋白得率最高,達(dá)到12%;pH 6.5以后,得率開始下降。這與 Westphalen[5]和 Lesiow[6]的研究結(jié)果類似。
圖5 pH與鹽溶蛋白得率的關(guān)系Fig.5 Effects of pH on salt soluble protein yield
由表2和表3可以看出,最后確定鹽溶蛋白提取的最佳工藝條件為:A1B3C3D3,即提取液中NaCl濃度為0.8 mol/L、固液比為1∶5、提取液 pH 為6.0、浸提時(shí)間為30 h。在這4個(gè)因素中,影響大小順序是B>C>D>A,即鹽濃度影響最大,其次是固液比和提取時(shí)間,pH值影響最小;浸提時(shí)間和pH值影響相對(duì)較小。最佳工藝參數(shù)組合A1B3C3D3出現(xiàn)在正交表中即實(shí)驗(yàn)3,在此最佳條件下鰱魚背肉鹽溶蛋白得率為12.66%,提取效果最好。優(yōu)于劉安軍[7]研究中鱈魚鹽溶蛋白的最佳提取率。因此,后續(xù)實(shí)驗(yàn)提取條件為NaCl濃度為0.8 mol/L、固液比 1∶5、提取液pH值為6.0、浸提時(shí)間為30 h。
表2 正交試驗(yàn)表Table 2 Results of the orthogonal test
表3 正交試驗(yàn)方差分析表Table 3 Variety analysis of the results
從圖6可以看出,隨著處理溫度的升高,保水性升高,在 80℃ 時(shí)保水性達(dá)到最大值,最大值為98.24%,90℃ 時(shí)保水性逐漸下降。這可能是由于:一是溫度升高后,水分子的運(yùn)動(dòng)加劇,加快了蛋白質(zhì)的吸水速度;二是在熱作用下,某些處于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的極性側(cè)鏈轉(zhuǎn)而朝向蛋白質(zhì)表面,進(jìn)而提高了蛋白質(zhì)的親水性[8]。從結(jié)果可知,以保水性為依據(jù),80℃為白鰱鹽溶蛋白最佳凝膠溫度,即后續(xù)試驗(yàn)采用鹽溶蛋白熱凝膠溫度為80℃。
圖6 溫度對(duì)鹽溶蛋白凝膠保水性的影響Fig.6 Effects of temperature on salt soluble protein’s WHC
由圖7可知,空白對(duì)照組的鹽溶蛋白熱凝膠保水性最低,添加磷酸鹽對(duì)鹽溶蛋白熱誘導(dǎo)凝膠的保水性均有提升作用,其中濃度0.1 mol/L的磷酸緩沖液[9]保水性最高,最高為96.61%,濃度為0.01 mol/L的三聚磷酸鈉溶液[10]效果次之。這是由于肌肉蛋白在pH值約5.4的等電點(diǎn)時(shí)保水性最差,添加磷酸鹽可將肉制品的pH值提高到6.0~6.4。磷酸鹽改變蛋白質(zhì)電荷電勢(shì)使蛋白質(zhì)之間互相排斥,從而產(chǎn)生更大的空間容納更多水分,提高肉的保水性[2,11]。而磷酸緩沖液對(duì)凝膠保水性的提升效果優(yōu)于三聚磷酸鈉,可能是由于磷酸緩沖液的離子強(qiáng)度較高,更利于鹽溶蛋白的溶解,因而凝膠保水性得以增強(qiáng)[12]。
圖7 不同提取助劑對(duì)鹽溶蛋白凝膠保水性的影響Fig.7 Effects of extraction agent on salt soluble protein’s WHC
由表4可知,白鰱鹽溶蛋白的 EAI為19.47 m2/g,ESI為 89.50%,優(yōu)于董哲[13]文章中相同離子條件下草魚鹽溶蛋白的EAI和ESI。白鰱鹽溶蛋白的EAI、ESI的標(biāo)準(zhǔn)差均較小,具有較好穩(wěn)定性,偏差較小。由此可見,白鰱鹽溶蛋白具有較好乳化能力,能夠較好改善肉糜制品加工質(zhì)量。
表4 鹽溶蛋白的乳化活性及乳化穩(wěn)定性Table 4 EAI and ESI of salt soluble protein
由圖8可知,空白對(duì)照組白鰱鹽溶蛋白 EAI 最低,添加磷酸緩沖液及三聚磷酸鈉對(duì)白鰱鹽溶蛋白EAI均有較大提高,其中以三聚磷酸鈉提升作用最大,最大為19.52 m2/g,磷酸緩沖液次之。這可能是由于磷酸鹽提高了魚肉蛋白質(zhì)的離子強(qiáng)度,改變了魚肉的pH值,影響了蛋白質(zhì)分子疏水基團(tuán)的分布情況,使得乳化活性提高。這與楊玉玲等[14]報(bào)道的 pH和離子強(qiáng)度是影響鹽溶蛋白的極顯著因素相符。
圖8 不同提取助劑對(duì)鹽溶蛋白的乳化活性(EAI)的影響Fig.8 Effects of extraction agent on salt soluble protein’s EAI
由圖9可知,添加磷酸緩沖液對(duì)白鰱鹽溶蛋白ESI有所改善,其穩(wěn)定性最高,最高為97%,而三聚磷酸鈉則使白鰱鹽溶蛋白ESI降低。這可能是由于磷酸鹽緩沖液對(duì)鹽溶蛋白乳濁液體系的pH具有較高的穩(wěn)定性,進(jìn)而提高了乳化穩(wěn)定性。綜合比較磷酸緩沖液、三聚磷酸鈉對(duì)白鰱鹽溶蛋白EAI和ESI的影響,添加磷酸鹽緩沖液能較好提升白鰱鹽溶蛋白乳化能力。
圖9 不同提取助劑對(duì)鹽溶蛋白的乳化穩(wěn)定性(ESI)的影響Fig.9 Effects of extraction agent on salt soluble protein’s ESI
本研究?jī)?yōu)化了白鰱魚肉鹽溶蛋白的提取工藝參數(shù),結(jié)果表明 NaCl濃度為0.8 mol/L、pH值為6.0、浸提時(shí)間為30 h、固液比為1∶5時(shí),鰱魚魚背肉鹽溶蛋白最大提取濃度為2.602 4 g/100 g。通過(guò)對(duì)白鰱鹽溶蛋白的加工特性研究,發(fā)現(xiàn)其保水性可達(dá)98.24%,乳化活性最大為19.47 m2/g,乳化穩(wěn)定性最大為89.45%,具有較好的凝膠保水性及乳化能力,可有效改善肉糜制品加工品質(zhì)。
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