王 丹 魏潤(rùn)生 高海濤 孟 賀 白宇宏 彭 偉

1（華北理工大學(xué) 口腔醫(yī)學(xué)院，唐山063000）

2（唐山市工人醫(yī)院，唐山063000）

復(fù)發(fā)性阿弗他潰瘍又稱復(fù)發(fā)性口腔潰瘍，是最常見的口腔黏膜潰瘍類疾病，病因不明，可能與免疫、遺傳、系統(tǒng)性疾病、感染、環(huán)境等因素有關(guān)［1］。臨床上，除積極尋找可能的相關(guān)誘因外，藥物治療多見于局部采用糖皮質(zhì)激素，但長(zhǎng)期應(yīng)用副作用顯著。中草藥是祖國(guó)醫(yī)學(xué)的瑰寶，治療各種慢性疾病越來越受到重視。葛根芩連湯是經(jīng)典古方之一，來源于東漢末年張仲景所著《傷寒論》，有外疏內(nèi)清、表里同治之效。因其藥味較少，作用明確，是中醫(yī)藥的經(jīng)典方劑，一直是研究的熱點(diǎn)。其劑型多為飲劑。為了增加其生物利用度及臨床需要，筆者嘗試了將葛根芩連湯提取液作用于體外培養(yǎng)的口腔黏膜上皮細(xì)胞，觀察其對(duì)體外培養(yǎng)的口腔黏膜上皮細(xì)胞增殖活性的影響，為將其制成膜劑等局部給藥劑型治療復(fù)發(fā)性阿弗他潰瘍等口腔黏膜疾病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 組織來源

口腔黏膜來自河北聯(lián)合大學(xué)博創(chuàng)口腔醫(yī)院口腔頜面外科拔除的低位阻生的阻生齒上覆蓋的正常牙齦黏膜。

1．2 主要試劑及儀器設(shè)備

角化細(xì)胞無血清培養(yǎng)液（keratinocyte-serum free medium，K-SFM）（Gibco，美國(guó)）；分離酶 DispaseⅡ（Gibco，美國(guó)）；胰蛋白酶（天津血研所）；四甲基偶氮唑鹽（MTT）、磷酸鹽緩沖鹽（PBS）、二甲基亞砜（DMSO）均購自美國(guó)Sigma公司；Triton X-00（華美生物工程有限公司）；標(biāo)準(zhǔn)型96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（美國(guó)Corning公司）；葛根芩連湯合劑：由葛根（批號(hào)：1110035）、黃 芩 （批 號(hào)：1202152）、黃 連 （批 號(hào)：1111019）、炙甘草（批號(hào)：1112083）中藥配方顆粒（廣州一方制藥有限公司）組成。

1．3 口腔黏膜上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)

取材：手術(shù)鋪巾、嚴(yán)格消毒下所取的低位阻生的阻生齒上覆蓋的正常牙齦黏膜組織立即用無菌生理鹽水沖凈，放于新鮮配制的PBS緩沖液中，半小時(shí)內(nèi)移入超凈工作臺(tái)。在超凈工作臺(tái)內(nèi)將組織標(biāo)本用PBS蕩洗干凈，用含有雙抗溶液（青霉素、鏈霉素濃度均為100U／ml）的PBS（2g／L）浸泡10min。取出標(biāo)本用眼科剪剪去部分黏膜下組織，并修剪組織塊。

分離上皮：將黏膜組織放入0．25%的DispaseⅡ（中性蛋白酶）中，置于4℃冰箱中消化18h，取出后用眼科鑷將上皮從黏膜下組織上分離下來。

原代培養(yǎng)：將口腔黏膜上皮用PBS沖洗2遍，加入到0．125%胰蛋白酶與0．02%EDTA等體積混合消化液中37℃下消化5min，輕輕吹打，用含10%胎牛血清的PBS終止消化，制成細(xì)胞懸液，加入PBS洗滌，離心500r／min×10min，重復(fù)三次，盡可能消除胰蛋白酶對(duì)細(xì)胞的影響。再次離心后棄上清，在K-SFM中重懸，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。細(xì)胞懸液以2×105個(gè)／cm2的密度接種于培養(yǎng)板中，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。第2d首次換液，以后隔天換液1次。

傳代培養(yǎng)：當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%～90%匯合時(shí)，吸去培養(yǎng)液，0．125%胰蛋白酶與0．02%EDTA等體積混合消化液消化細(xì)胞。鏡下觀察細(xì)胞突起回縮變圓時(shí)終止消化，吸管反復(fù)吹打，離心500／min×10min，無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，細(xì)胞懸液以1∶2的比例接種于培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)，以后隔天換液1次。倒置相差顯微鏡下觀察原代及傳代后細(xì)胞形態(tài)變化及生長(zhǎng)增殖情況。

1．4 MTT法檢測(cè)體外培養(yǎng)的口腔黏膜上皮細(xì)胞的增殖活性

取生長(zhǎng)良好的第2代培養(yǎng)細(xì)胞，以1×105的細(xì)胞濃度接種于96孔板，孵育3d，隨機(jī)分為5個(gè)實(shí)驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組，每組選5個(gè)孔。實(shí)驗(yàn)組分別加入經(jīng)無血清培基稀釋的5個(gè)濃度梯度的葛根芩連湯液（2%、10%、15%、20%、50%）各100μl，對(duì)照組只加無血清培基，培養(yǎng)5d后，每孔加 MTT 100μl繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄孔內(nèi)液體及MTT，加入二甲基亞砜100 μl，振蕩10min，在分光光度儀上于492nm波長(zhǎng)下測(cè)OD值，取每組5孔平均值，比較5種濃度的葛根芩連湯提取液對(duì)黏膜上皮細(xì)胞增殖活性的影響。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17．0統(tǒng)計(jì)軟件，檢測(cè)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，應(yīng)用單因素方差分析方法對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2．1 觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況

倒置相差觀察顯微鏡下，接種2d的口腔黏膜上皮細(xì)胞已貼附于瓶底，呈多角形或扁平橢圓形，胞核清晰位于細(xì)胞中央。培養(yǎng)5d時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)明顯加快，可見核分裂相。培養(yǎng)10d時(shí)，細(xì)胞已逐漸融合成片，如鋪路石狀鑲嵌。細(xì)胞生長(zhǎng)鋪滿瓶底80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代，傳代細(xì)胞貼壁比原代細(xì)胞快，無復(fù)層生長(zhǎng)，仍呈多角形 （見圖1）。

2．2 葛根芩連湯對(duì)體外培養(yǎng)的口腔黏膜上皮細(xì)胞增殖活性的影響

經(jīng)酶標(biāo)儀在492nm處的讀數(shù)，對(duì)照組的OD值為0．033；實(shí)驗(yàn)組2%、10%、15%、20%、50%OD 值分 別 為 0．047，0．063，0．121，0．041，0．035 。 在15%濃度下增殖活性吸光度（OD）值明顯高于其他濃度和對(duì)照組（P＜0．05）。而在2%、10%、20%、50%濃度下增殖活性吸光度（OD）值雖高于對(duì)照組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）（見表1）。

圖1 第二代培養(yǎng)的人口腔黏膜上皮細(xì)胞（倒置相差顯微鏡，×100）Figure 1 Human oral mucosal epithelial cells in second passage（inverted phase-contrast microscopy，×100）

表1 不同濃度葛根芩連湯對(duì)上皮細(xì)胞增殖的影響Table 1 Effects of Gegen Qinlian decoction on the proliferation in cultured human epithelial cells

3 討論

復(fù)發(fā)性阿弗他潰瘍（Recurrent Aphthous Ulcer，RAU）根據(jù)其臨床特點(diǎn)，可分為輕型、重型、皰疹型三種，其中輕型占80%左右。RAU具有周期性、復(fù)發(fā)性、自限性特征，潰瘍灼痛明顯［1］。目前病因及致病機(jī)制尚不明確，所以目前無根治的方法，局部用藥主要以促進(jìn)潰瘍愈合、消炎止痛、防治繼發(fā)感染為原則，中醫(yī)及中西醫(yī)結(jié)合治療RAU是我國(guó)目前黏膜病治療的重要內(nèi)容。本次研究主要觀察使用葛根芩連湯是否能促進(jìn)口腔黏膜上皮細(xì)胞的增殖，也就是能否促進(jìn)上皮層的愈合，為中藥治療復(fù)發(fā)性阿弗他潰瘍提供新思路。

葛根芩連湯為醫(yī)圣張仲景的名方之一，由葛根、黃芩、黃連與炙甘草4味中藥組成。分別為：葛根半斤，甘草二兩（炙），黃芩三兩，黃連三兩。葛根芩連湯廣泛用于治療菌痢、腸傷寒等內(nèi)、兒、外、婦、五官科疾患，取得了明顯療效。近年來國(guó)內(nèi)外醫(yī)學(xué)家通過實(shí)驗(yàn)研究證明葛根芩連湯具有解熱、抗菌、抗病毒、解痙、抑制胃腸運(yùn)動(dòng)、抗缺氧、抗心律失常、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等藥理作用［2］，但其對(duì)細(xì)胞增殖的作用研究較少。

本研究成功建立上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)體系，為研究葛根芩連湯對(duì)細(xì)胞增殖所起的藥理作用奠定了基礎(chǔ)。微生物的污染、人類黏膜組織來源的限制、上皮細(xì)胞不能貼壁以及所需營(yíng)養(yǎng)成分復(fù)雜等是上皮細(xì)胞培養(yǎng)成功的主要影響因素［3］。在實(shí)驗(yàn)過程中，我們采用了DispaseⅡ酶和胰酶結(jié)合的方法獲得了單一的上皮細(xì)胞，并用添加了一定濃度的牛垂體提取物和EGF的無血清培養(yǎng)基成功地進(jìn)行了口腔上皮細(xì)胞的培養(yǎng)。在實(shí)驗(yàn)過程中，臨床取得組織后迅速置于PBS液中，移入超凈工作臺(tái)。所有操作盡量快速，上皮組織要盡量避免在空氣中暴露時(shí)間過長(zhǎng)。在把組織放入0．25%的DispaseⅡ酶前，要用PBS盡量沖洗掉殘余的消毒液，避免抗生素對(duì)組織的影響。DispaseⅡ酶作用溫和，在0．25%的DispaseⅡ酶濃度下消化組織塊18～20h可完整分離上皮和其下的結(jié)締組織，避免了成纖維細(xì)胞的污染并且保留了增殖旺盛的基底細(xì)胞層。組織來源的不足是本次研究數(shù)次失敗的主要原因，盡管培基中添加有生長(zhǎng)因子，但只有達(dá)到一定密度細(xì)胞才能自我維持［4］，細(xì)胞自身分泌的生長(zhǎng)因子才能促使周圍細(xì)胞不斷分裂增殖，我們?cè)谳^高密度接種細(xì)胞時(shí)取得了成功。貼壁前幾天要盡量減少觀察次數(shù)，可以減少培養(yǎng)液對(duì)細(xì)胞的沖刷作用，保證細(xì)胞順利貼壁。細(xì)胞不能貼壁還可能是由于胰酶消化了細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)，使細(xì)胞的通透性增高造成的，在實(shí)驗(yàn)中采用了低濃度0．125%胰蛋白酶與EDTA的混合液消化，500r／min的低速離心，并用PBS重復(fù)蕩洗兩次，盡量消除胰酶和離心對(duì)細(xì)胞的傷害。為避免抗生素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和形態(tài)的影響，未在培基中添加抗生素，結(jié)果表明，標(biāo)本的消毒處理和實(shí)驗(yàn)過程中的無菌操作是可以避免污染的。直接將中藥提取液加入到體外細(xì)胞培養(yǎng)體系中，易受到各種因素的影響。因此，在中藥提取液的制備過程中，嚴(yán)格把關(guān)中藥的煎煮、過濾、濃縮、醇沉、活性炭脫色、微孔濾膜除菌、調(diào)節(jié)PH值等程序。

葛根芩連湯目前主要?jiǎng)┬陀衅瑒?、膠囊劑、微丸、口服液、顆粒劑五種，湯劑為原始劑型。膜劑是60年代開始發(fā)展起來的新劑型，并很快應(yīng)用于口腔潰瘍?？谇粷兡つ茉谒蟪蔀槿苣z，粘附在粘膜表面，膜內(nèi)藥物釋放持久，保持局部藥物較高濃度，同時(shí)能使病損部位得到機(jī)械性保護(hù)，從而有效減輕患者痛苦、提高療效。純中藥的口腔潰瘍膜較少，多為加入了抗生素或皮質(zhì)激素。本次研究在細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)上證實(shí)了葛根芩連湯對(duì)口腔黏膜上皮細(xì)胞有促增殖的效果，希望在不久的將來制成葛根芩連湯膜劑，進(jìn)一步應(yīng)用于復(fù)發(fā)性阿弗他動(dòng)物潰瘍模型，為研究人類RAU的發(fā)病機(jī)制及治療提供理論基礎(chǔ)。

［1］ 陳謙明，主編．口腔黏膜病學(xué)［M］．人民衛(wèi)生出版社．

［2］ 陳麗紅，唐于平，王強(qiáng)．葛根芩連湯的現(xiàn)代研究進(jìn)展［J］．中草藥，2010，41（4）：附8-附11

［3］ 胡秀蓮，王興，林野，邱立新．人口腔黏膜角化上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)及生物學(xué)特性研究［J］．中國(guó)口腔頜面外科雜志，2004，，2（3）：173-176．

［4］ Reid CB，Cloos J，Snow GB，et al．A simple and reliable technique for culturing of human oral keratinocytes and fibroblasts．Acta Otolaryngol，1997，117（4）：628-633．

［5］ 路又璐，秦健中．17味中藥對(duì)培養(yǎng)的表皮細(xì)胞增殖的影響［J］．臨床皮膚科雜志1996，25（4）：202-204．