朱 旭 張 博 張思萌 夏曉萌 吳登斌*

2017年中國惡性腫瘤流行病學分析，每年至少49.9萬例新發(fā)盆腔惡性腫瘤[1]，其中20%～60%需要放射治療[2]。由于小腸上皮細胞對放療高度敏感，放射性腸炎是放射治療過程中的主要并發(fā)癥，是小腸和大腸在接受放射治療過程中出現(xiàn)的放射性損傷炎癥反應[3]。其表現(xiàn)為急性或慢性腹瀉、便血和里急后重，嚴重影響腫瘤患者的生命質(zhì)量。放射性腸炎成為直腸癌等腹部腫瘤放射劑量增加的限制性因素。漢代名醫(yī)張仲景在《傷寒雜病論》中對葛根芩連湯進行了詳細描述，方劑由葛根、黃芩、黃連及甘草4味中藥組成，主治太陽表證、協(xié)熱下利，是治療濕熱所致腹瀉和痢疾的經(jīng)典方。近年來發(fā)現(xiàn)其治療放射性腸炎腸道濕熱證療效較好[4-7]。本研究運用網(wǎng)絡藥理學方法就葛根芩連湯治療放射性腸炎的作用機制進行分析?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 收集葛根芩連湯活性成分、作用靶點等信息

以“葛根、黃芩、黃連、甘草”為關鍵詞，在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP）進行檢索，以每味中草藥的化學成分、類藥性（DL）≥0.18、口服生物利用度（OB）≥30%為篩選依據(jù)，對藥物的有效成分進行篩選。然后在數(shù)據(jù)庫內(nèi)以有效成分為依據(jù)進行檢索，對其作用靶點進行確定。然后在Uniprot數(shù)據(jù)庫內(nèi)導入作用靶點，進行基因標準化處理。

1.2 方法

1.2.1 葛根芩連湯共同作用靶點的篩選 將葛根芩連湯通過基因標準化處理得到的基因名稱全部導入Excel表格中，取交集函數(shù)，篩出葛根芩連湯共同作用靶點，并對“葛根芩連湯潛在作用靶點”用imageGP工具繪制韋恩圖。

1.2.2 收集放射性腸炎靶點信息 以放射性腸炎相關的靶點、"radiation enteritis" "radiation enteropathy"為關鍵詞在GeneCards數(shù)據(jù)庫內(nèi)進行檢索，然后合并兩個數(shù)據(jù)庫檢索出的靶點，再在Uniprot數(shù)據(jù)庫內(nèi)導入作用靶點，進行基因標準化處理。

1.2.3 收集葛根芩連湯治療放射性腸炎靶點及分析 在Excel表格中導入放射性腸炎背景網(wǎng)絡及葛根芩連湯的作用靶點，取交集，得到葛根芩連湯治療放射性腸炎的共同潛在基因靶點。再將共同作用的靶點、靶點所對應的葛根芩連湯活性成分、葛根芩連湯分別導入Cytoscape3.7.2軟件中，構建“葛根芩連湯-治療成分-靶點-放射性腸炎網(wǎng)絡圖”，對網(wǎng)絡節(jié)點的重要性通過Cytoscape3.7.2中“NetworkAnalyzer”功能對自由度（Degree）等網(wǎng)絡拓撲參數(shù)進行分析。

1.2.4 構建靶蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡及擴充靶蛋白

在String數(shù)據(jù)庫內(nèi)輸入獲得的放射性腸炎治療的作用靶點，物種選擇“Home sapiens”，模式選擇“multiple proteins”，在默認設置下，得到PPI網(wǎng)絡，通過Cytoscape 3.7.2中“NetworkAnalyzer”功能對所獲取數(shù)據(jù)進行Degree等網(wǎng)絡拓撲參數(shù)分析。

1.2.5 GO富集分析和KEGG通路富集分析

在DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫內(nèi)輸入擴充靶點及葛根芩連湯治療放射性腸炎的共同作用靶點，分別進行GO富集分析、KEGG通路富集分析，將所獲得的結果導入Excel表格，篩選設定P≤0.05，根據(jù)P值將GO生物過程和KEGG 通路由小到大排序，選取前10位的GO生物過程和KEGG通路，利用imageGP工具繪制葛根芩連湯治療放射性腸炎主要GO生物過程氣泡圖和葛根芩連湯治療放射性腸炎的KEGG通路氣泡圖。

2 結果

2.1 葛根芩連湯作用靶點信息收集

共篩選出128個有效活性成分，其中葛根、黃芩、黃連、甘草分別為3個、31個、9個、88個，葛根芩連湯的主要活性成分見表1。在TCMSP數(shù)據(jù)庫內(nèi)輸入128個有效成分，得到潛在作用靶點2 191個。通過Excel刪除重復值，得到261個基因靶點是葛根芩連湯共同的潛在作用靶點。

表1 葛根芩連湯主要活性成分

2.2 葛根芩連湯治療放射性腸炎靶點的收集及網(wǎng)絡構建和分析

獲得人類放射性腸炎相關靶點共41個。取交集后得到相關靶點基因8個，分別為TGFB1，NOS2，EGF，IL-6，MMP1，THBD，SERPINE1，MPO（圖1）。

圖1 葛根芩連湯與人類放射性腸炎共作用靶點

2.3 靶PPI網(wǎng)絡的構建

PPI網(wǎng)絡包含78個節(jié)點，1 196條邊(節(jié)點間的相互作用關系)，平均Degree值為30.7。此網(wǎng)絡中Degree 值大于等于30的從高到低排序依次為IL-6，VEGFA，EGF，TNF，IGF1，CXCL8，SRC，EGFR，MMP9，SERPINE1，TGFB1，TIMP1，STAT3，IL-10，ERBB2，IL-4，PLG，CCL2，HRAS（圖2）。

圖2 葛根芩連湯關鍵靶點PPI網(wǎng)絡

2.4 GO和KEGG通路分析結果

得到20個生物過程（GO）前10位的分別為細胞遷移的正向調(diào)控，MAPK信號通路，細胞黏附，上皮細胞的增殖，白細胞遷移，蛋白轉運的正向調(diào)節(jié)，信號受體活動的正向調(diào)節(jié)，miRNA基因沉默機制中的產(chǎn)物，調(diào)節(jié)上皮細胞的凋亡，細胞外基質(zhì)組織（圖3）。得到16條KEGG通路，前5位的分別為細胞分化的負向調(diào)控，凋亡信號通路，RNA聚合酶Ⅱ正向調(diào)控pri-miRNA轉錄，多細胞生物的體內(nèi)平衡，上皮細胞遷移的調(diào)節(jié)（圖4）。

圖3 GO生物過程

圖4 KEGG通路氣泡圖

通過GO富集分析顯示黏附斑激酶（FAK）及其信號通路，人巨細胞病毒感染，感染性腸道疾病，Th17細胞分化，胃癌，Rap1信號通路，relaxin信號通路，細胞因子-細胞因子受體相互作用，MAPK信號通路，胰腺癌，PI3K-Akt信號通路，foxo信號通路，乙型肝炎病毒，HIF-1信號通路，膀胱癌，AGE-RAGE信號通路在糖尿病并發(fā)癥中，腫瘤蛋白多糖，EGFR酪氨酸激酶抑制劑等，是葛根芩連湯治療放射性腸炎的作用機制（圖5）。

圖5 GO富集分析

3 討論

近年的研究認為放射性腸炎的發(fā)生與腸上皮細胞的直接損傷，腸道微生物黏膜屏障破壞，輻射誘發(fā)細胞因子介導的腸道炎癥等機制有關[8]。多年的臨床實踐發(fā)現(xiàn)葛根芩連湯對于預防和治療腸道炎癥能夠起到一定的作用[9-10]?，F(xiàn)代藥理研究表明葛根芩連湯能降低血清IL-6、TNF-α的表達，減輕腸道炎癥反應[11]，調(diào)控MMP-9/P38MARK途徑減輕腸道黏膜損傷，修復腸道黏膜上皮屏障等[12]。

本研究從網(wǎng)絡藥理學角度對葛根芩連湯治療放射性腸炎的作用機制進行探討，網(wǎng)絡分析顯示葛根芩連湯共有活性成分128種，GO富集分析以及KEGG通路富集分析結果顯示，葛根芩連湯對放射性腸炎損傷修復可能的機制最主要的首先包括FAK及其信號通路，F(xiàn)AK是一種酪氨酸激酶，可以通過刺激胞內(nèi)PI3K-Akt信號通路影響下游foxo信號通路，調(diào)節(jié)HIF-1信號通路以及影響Ras/MAPK等信號通路，調(diào)控細胞的生長。其次是MAPK信號通路，通過促進上皮細胞的增殖，調(diào)節(jié)上皮細胞的凋亡、遷移，結合惡性腫瘤的臨床分析推測，葛根芩連湯治療放射性腸炎的機制首先與FAK及其信號通路、MAPK通路相關的促進上皮細胞的損傷修復有關。再次，葛根芩連湯對炎癥反應的影響，通過調(diào)控Th17細胞分化實現(xiàn)，Th17細胞與Th1/Th2細胞同屬免疫調(diào)節(jié)性T細胞，參與腸道炎癥反應，具有促炎癥、致炎作用?；谀壳暗木W(wǎng)絡藥理學分析認為葛根芩連湯可能通過促進上皮細胞的修復，調(diào)節(jié)免疫細胞分化，治療放射性腸炎。近年來研究表明，腸道微環(huán)境中，腸上皮細胞、免疫細胞與腸道菌群是3個相互影響、密切相關的群體[13]，腸道微生物群維持上皮屏障的完整性并構建黏膜免疫系統(tǒng)，上皮細胞通過構建化學和物理屏障將腸道微生物與腸壁分離，從而構建宿主共生關系，腸道免疫細胞參與維持健康的微生物群和加強上皮屏障功能，因此推斷，葛根芩連湯在影響了上皮細胞的修復和免疫細胞的分化同時，會對腸道菌群產(chǎn)生影響。作為一種治療腹瀉的經(jīng)典方劑，研究表明葛根芩連湯可以通過改變腸道內(nèi)有益菌數(shù)量發(fā)揮治療疾病的作用[14]。但對于治療放射性腸炎是否有影響，還知之甚少，也是未來可以研究的方向。