于海蛟 申玉芹 劉引 高涵 周岳 胡天琦 林崇韜

吉林大學(xué)口腔醫(yī)院牙周病科，長春 130021

牙周炎是牙周組織的一種慢性感染性疾病，菌斑微生物是其始動因子[1]。牙齦卟啉單胞菌是目前公認(rèn)的牙周致病菌，其毒力因子可直接參與牙周支持組織的破壞以及間接引起宿主的免疫炎癥反應(yīng)[2]，抑制成骨細(xì)胞分化及骨形成，從而導(dǎo)致牙槽骨吸收，造成牙齒喪失[3]。

特定序列寡核苷酸MT01是一類根據(jù)人線粒體DNA序列設(shè)計不含CG基序的單鏈寡脫氧核苷酸（oligodeoxynucleotides，ODN），為抑制性O(shè)DN，能夠抑制由Toll樣受體9（Toll-like receptors 9，TLR9）激活引起的機體固有免疫應(yīng)答反應(yīng)，維持機體的免疫平衡狀態(tài)，防止組織細(xì)胞受損[4]。本課題組前期研究[5-6]表明，MT01具有促成骨細(xì)胞分化的功能，能夠抑制實驗性大鼠牙周炎導(dǎo)致的牙槽骨吸收。由此推測，MT01作為一種免疫抑制劑，可能會對牙周炎炎癥免疫應(yīng)答具有干預(yù)和調(diào)控作用。本實驗采用牙齦卟啉單胞菌感染人成骨細(xì)胞MG63，研究MT01對感染狀態(tài)下MG63細(xì)胞增殖、周期及凋亡等生物學(xué)特性的影響，旨在為進(jìn)一步探討MT01對牙周炎的調(diào)控作用奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

MT01及CpG ODN（吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)教研室設(shè)計，大連TaKaLa公司合成），甲硝唑氯化鈉注射液（遼寧民康制藥有限公司），硫酸慶大霉素注射液（濟(jì)南利民制藥有限責(zé)任公司）；牙齦卟啉單胞菌W83菌株（首都醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)研究所惠贈）；人成骨細(xì)胞MG63（吉林大學(xué)口腔醫(yī)院口腔生物醫(yī)學(xué)工程重點實驗室提供）。HG-DMEM培養(yǎng)基（Hyclone公司，美國），胎牛血清（PAA公司，奧地利），胰酶（Hyclone公司，美國），腦心浸液瓊脂（brain heart infusion，BHI）培養(yǎng)基（Gibco公司，美國）；4,5-二甲基噻唑-2（4,5-dimethylthiazol-2-yl，MTT）試劑（Sigma公司，美國）。細(xì)胞周期檢測試劑盒和Annexin-Ⅴ-FITC細(xì)胞凋亡試劑盒（上海七海復(fù)泰生物科技有限公司）。

1.2 牙齦卟啉單胞菌的培養(yǎng)

選擇牙齦卟啉單胞菌W83作為實驗菌株，將其接種于新鮮配制的BHI固態(tài)培養(yǎng)基（含5%無菌脫纖維羊血，5 μg·mL-1氯化血紅素，1 μg·mL-1維生素K1），在37 ℃厭氧（80%N2，10%CO2，10%H2）條件下培養(yǎng)5～7 d，挑單克隆菌落接種于BHI液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，在波長600 nm的紫外分光光度計下測定細(xì)菌密度，調(diào)制備用。

1.3 培養(yǎng)人成骨細(xì)胞MG63

選擇MG63細(xì)胞作為實驗細(xì)胞，復(fù)蘇細(xì)胞于高糖DMEM培養(yǎng)基中（含10%胎牛血清），在CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃條件下培養(yǎng)。隔日換液，觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，待細(xì)胞鋪滿底面積約80%時，按1∶3的比例傳代培養(yǎng)。

1.4 合成特定序列MT01及CpG ODN

由大連TaKaLa公司合成特定序列的MT01以及CpG ODN，PBS溶解后-20 ℃保存?zhèn)溆?。MT01序列：5'-ACCCCCTCTACCCCCTCTACCCCCTCT-3'，CpG ODN序列：5'-TCGGGGACGATCGTCGGGGGG-3'。

1.5 MTT法檢測細(xì)胞增殖

取對數(shù)生長期MG63細(xì)胞，胰酶消化，以每孔5×104個細(xì)胞的密度接種至96孔板，PBS邊緣封閉。待細(xì)胞完全貼壁以后換無血清DMEM饑餓24 h，棄培養(yǎng)液，分別加入MT01（1 μg·mL-1）、CpG ODN（1 μg·mL-1）、甲硝唑（0.1 g·L-1）、慶大霉素（0.5 g·L-1），共孵育3 h后，各孔內(nèi)以感染復(fù)數(shù)（multiplicity ofinfction，MOI）為100∶1的比例加入牙齦卟啉單胞菌，設(shè)立PBS作為空白對照，共分為6個組：空白對照組（PBS）、陰性對照組（僅加牙齦卟啉單胞菌）、實驗組（MT01+牙齦卟啉單胞菌）、陽性對照A組（CpG ODN+牙齦卟啉單胞菌）、陽性對照B組（甲硝唑+牙齦卟啉單胞菌）、陽性對照C組（慶大霉素+牙齦卟啉單胞菌），每組4復(fù)孔。MTT法測定培養(yǎng)24 h和48 h細(xì)胞OD492值。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期

取對數(shù)生長期MG63細(xì)胞，胰酶消化，以每孔1×105個細(xì)胞的密度接種至6孔板。待細(xì)胞完全貼壁后換無血清DMEM饑餓24 h，分組及加藥方法同上。孵育24、48 h后，吸棄原培養(yǎng)液，收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌1次，預(yù)冷70%乙醇4 ℃固定2 h，每孔加0.5 mL碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色液染色，37 ℃避光溫浴30 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。實驗重復(fù)3次。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率

取對數(shù)生長期MG63細(xì)胞，胰酶消化，以每孔1×105個細(xì)胞的密度接種至6孔板。待細(xì)胞完全貼壁后換無血清DMEM饑餓24 h，分組及加藥方法同上。孵育24、48 h后，收集原孔板培養(yǎng)液終止消化細(xì)胞，PBS洗滌1次，Buffer洗滌2次，每孔5 μlAnnexin-Ⅴ-FITC避光室溫孵育15 min，每孔10 μlPI染液避光冰浴5 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。實驗重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，組間配對行t檢驗，檢驗水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 MT01對感染狀態(tài)下MG63增殖的影響

MT01對感染狀態(tài)下MG63增殖的影響見圖1。與空白對照組比較，陰性對照組、實驗組以及陽性對照A組的細(xì)胞增殖明顯升高（P<0.05），其中陰性對照組和實驗組在48 h增殖顯著升高（P<0.01），而陽性對照B組和C組在24 h和48 h增殖活性均低于空白對照組（P<0.05）。

圖1 牙齦卟啉單胞菌感染MG63細(xì)胞24 h及48 h后各組MTT增殖結(jié)果Fig 1 MTT results of MG63 cells proliferation after cocultured with Porphyromonas gingivalis for 24 h and 48 h in various groups

2.2 MT01對感染狀態(tài)下MG63細(xì)胞周期的影響

與空白對照組比較，各組培養(yǎng)24 h的G1期細(xì)胞百分比均增加（P<0.05）；但與陰性對照組比較，實驗組和陽性對照A組的G1期細(xì)胞百分比明顯降低，S期細(xì)胞百分比明顯升高（P<0.05）（圖2）。培養(yǎng)48 h時，陰性對照組S期細(xì)胞百分比明顯低于空白對照組，而其他各組G1期細(xì)胞百分比均低于陰性對照組，而S期細(xì)胞百分比均增高（P<0.05）（圖3）。

2.3 MT01對感染狀態(tài)下MG63細(xì)胞凋亡的影響

各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h和48 h的凋亡檢測結(jié)果和凋亡率見圖4、5和表1。

圖2 牙齦卟啉單胞菌感染MG63細(xì)胞24 h后各組細(xì)胞的細(xì)胞周期Fig 2 The results of MG63 cell cycles after cocultured with Porphyromonas gingivalis for 24 h in various groups

圖3 牙齦卟啉單胞菌感染MG63細(xì)胞48 h后各組細(xì)胞的細(xì)胞周期Fig 3 The results of MG63 cell cycles after cocultured with Porphyromonas gingivalis for 48 h in various groups

圖4 牙齦卟啉單胞菌感染MG63細(xì)胞24 h后各組細(xì)胞凋亡的檢測結(jié)果Fig 4 The results of MG63 cells apoptosis after cocultured with Porphyromonas gingivalis for 24 h in various groups

圖5 牙齦卟啉單胞菌感染MG63細(xì)胞48 h后各組細(xì)胞凋亡的檢測結(jié)果Fig 5 The results of MG63 cells apoptosis after cocultured with Porphyromonas gingivalis for 48 h in various groups

表1 牙齦卟啉單胞菌感染MG63細(xì)胞24 h及48 h后各組細(xì)胞的凋亡率Tab 1 Apoptotic rates of MG63 cells after cocultured with Porphyromonas gingivalis for 24 h and 48 h in various groups %,±s

表1 牙齦卟啉單胞菌感染MG63細(xì)胞24 h及48 h后各組細(xì)胞的凋亡率Tab 1 Apoptotic rates of MG63 cells after cocultured with Porphyromonas gingivalis for 24 h and 48 h in various groups %,±s

注：b與空白對照組比較，P<0.01；c與陰性對照組比較，P<0.05；d與陰性對照組比較，P<0.01。

組別 早期細(xì)胞凋亡率 晚期細(xì)胞凋亡率24 h 48 h 24 h 48 h空白對照 2.38±0.21 2.07±0.30 6.84±1.17 2.71±0.68陰性對照 4.32±0.10b 3.82±0.14b 9.44±1.99 3.80±1.32實驗 2.66±0.05d 2.28±0.43d 8.35±1.40 3.62±0.51陽性對照A 2.41±0.31d 2.64±0.44c 8.31±1.58 4.02±0.98陽性對照B 2.78±1.27 3.07±0.41c 9.33±1.20 3.13±0.41陽性對照C 3.28±1.30 2.76±0.86 7.91±1.21 3.52±0.55

細(xì)胞培養(yǎng)24 h，陰性對照組細(xì)胞的早期凋亡率明顯升高，高于空白對照組（P<0.01），而實驗組、陽性對照A組細(xì)胞早期凋亡率明顯低于陰性對照組（P<0.05）。培養(yǎng)48 h，陰性對照組的細(xì)胞早期凋亡率仍然較高，高于空白對照組（P<0.01），除陽性對照C組，其余各組細(xì)胞的早期凋亡率均低于陰性對照組（P<0.05）。

3 討論

研究表明，在慢性牙周炎局部牙周組織中，牙齦卟啉單胞菌可入侵牙槽骨內(nèi)成骨細(xì)胞，通過調(diào)控成骨細(xì)胞內(nèi)核激活因子κB受體配體（receptor activator of nuclear kappa B ligand，RANKL）、骨保護(hù)素（osteoprotegerin，OPG）、核心結(jié)合因子-1 （core binding factor-1，Cbfa-1）和成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子osterix表達(dá)水平，抑制成骨細(xì)胞的成熟及礦化，影響牙槽骨形成，導(dǎo)致牙槽骨吸收[7-10]。本課題組前期工作證實，MT01經(jīng)由上調(diào)成骨細(xì)胞MG63細(xì)胞內(nèi)OPG與RANKL比值來促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化[11]，具有抑制實驗性大鼠牙周炎牙槽骨吸收的作用[6]。目前，MT01對牙齦卟啉單胞菌感染狀態(tài)下的成骨細(xì)胞是否具有影響作用尚不清晰，因此本研究分別選取刺激性O(shè)DN（一種富含未甲基化CG基序的ODN，稱為CpG ODN）[12]以及臨床用于治療慢性牙周炎的硝基咪唑類藥物（甲硝唑）和用于治療細(xì)菌感染的氨基糖苷類抗生素（慶大霉素）作為抑制性O(shè)DN MT01的陽性對照[13]，選取單純牙齦卟啉單胞菌感染作為陰性對照，評價MT01對感染狀態(tài)的成骨細(xì)胞增殖、周期及凋亡等生物學(xué)特性的影響，進(jìn)一步探討MT01用于治療牙周炎的可行性。

本實驗發(fā)現(xiàn)，MT01可以促進(jìn)牙齦卟啉單胞菌感染的MG63增殖，降低感染的MG63于Gl期阻滯的現(xiàn)象，并促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入S期，其作用與CpG ODN相近，遠(yuǎn)優(yōu)于甲硝唑及慶大霉素。已有研究[14-15]證實，MT01能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞活化，促使成骨細(xì)胞進(jìn)入S期，提高其細(xì)胞增殖活性。本研究結(jié)果進(jìn)一步提示，在正常或感染狀態(tài)下，MT01對成骨細(xì)胞具有較穩(wěn)定的促增殖作用，此作用可能與其細(xì)胞進(jìn)入S期和DNA復(fù)制合成相關(guān)。成骨細(xì)胞的凋亡可導(dǎo)致骨動態(tài)平衡中骨形成不足，造成骨吸收[16]，而成骨細(xì)胞凋亡的改變在不同程度上參與了牙周炎的發(fā)生、發(fā)展過程[17]。本實驗結(jié)果表明，MT01可抑制牙齦卟啉單胞菌感染的MG63早期凋亡，證實MT01對于感染狀態(tài)下的成骨細(xì)胞凋亡有一定的抑制作用。

分析MT01對MG63增殖、周期及凋亡影響的檢測結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，MT01對感染及非感染狀態(tài)的成骨細(xì)胞生物學(xué)性能均具有調(diào)控作用，可能與已證實的MT01促進(jìn)成骨細(xì)胞分化相關(guān)聯(lián)。今后將繼續(xù)進(jìn)行相關(guān)研究，進(jìn)一步驗證MT01對牙周致病菌導(dǎo)致的牙槽骨吸收的影響和調(diào)控。

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