申道南 成偉 賈岳 趙蕾 吳亞菲

口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 華西口腔醫(yī)院牙周病科（四川大學(xué)），成都 610041

牙齦卟啉單胞菌是慢性牙周炎的主要致病菌，脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是其最重要的毒力因子之一[1]。牙齦卟啉單胞菌及其毒性產(chǎn)物能黏附并侵入到血管內(nèi)壁中，參與心血管疾病的形成和發(fā)展[2-3]。氧化應(yīng)激（oxidative stress，OS）是由于機(jī)體組織或細(xì)胞內(nèi)氧自由基生成增加或清除能力降低導(dǎo)致體內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）自由基產(chǎn)生過多，氧化和抗氧化系統(tǒng)失衡，引起組織損傷[4]。

在OS引起的損傷中，蛋白質(zhì)損傷可產(chǎn)生谷胱甘肽化蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，是引起細(xì)胞凋亡損傷及衰老的啟動(dòng)因子。谷氧還蛋白（glutaredoxin，Grx）是細(xì)胞抗氧化防御體系的重要蛋白，編碼基因?yàn)間rx1。Grx可以通過特異性催化還原谷胱甘肽化蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以保護(hù)細(xì)胞免受OS的損害[5]。Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其活性表達(dá)為磷酸化Akt（phosphorylated-Akt，p-Akt），與OS密切相關(guān)。在OS誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷過程中，Akt作為一種細(xì)胞存活信號(hào)被激活[6]，增加一氧化氮生成，維持內(nèi)皮細(xì)胞功能[7]。Akt也是磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidyl inositol 3-kinase，PI3K）下游的效應(yīng)分子，位于PI3K/Akt通路的中心位置，可以磷酸化多種細(xì)胞因子如核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）等以抑制凋亡基因的表達(dá)。許多外部刺激因素都能夠激活PI3K從而促進(jìn)p-Akt的表達(dá)[8]。

基于以上研究，筆者推測(cè)Grx/Akt通路可能在調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷過程中具有重要作用。本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（realtime reverse transcription polymerase chain reaction，real-time RT-PCR）及Western blot方法，研究牙齦卟啉單胞菌LPS誘導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮EA-hy926細(xì)胞氧化損傷時(shí)grx1基因和Grx、Akt、p-Akt（308）蛋白表達(dá)的變化，探討Grx在OS引發(fā)的細(xì)胞凋亡中的作用。

1 材料和方法

1.1 儀器設(shè)備和主要試劑

高通量聚合酶鏈反應(yīng)儀（Eppendorf公司，德國），ABI7300型熒光定量分析儀（Bio-Rad公司，美國）。EA-hy926細(xì)胞由上海斯信生物科技有限公司提供。LPS采用美國InvivoGen公司的LPS-PG Ultrapure，Akt、p-Akt、Grx蛋白抗體為上海Proteintech公司產(chǎn)品，Grx特異性抑制劑氯化亞硝脲（carmustine，BCNU）為上海邁坤化工有限公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組

將EA-hy926細(xì)胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在5%CO2、37 ℃條件下常規(guī)培養(yǎng)，傳至5～7代時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。

將細(xì)胞分為L(zhǎng)PS組和對(duì)照組，LPS組用牙齦卟啉單胞菌LPS（1 000 ng·mL-1）刺激細(xì)胞4、12、18、24 h，對(duì)照組不添加任何刺激，采用real-time RTPCR檢測(cè)grx1基因的表達(dá)變化。選擇grx1基因表達(dá)變化最明顯的時(shí)間點(diǎn)，將EA-hy926細(xì)胞分為3組（對(duì)照組、LPS組和BCNU組），采用Western blot檢測(cè)Akt、p-Akt和Grx蛋白的表達(dá)變化；其中對(duì)照組不添加任何刺激，LPS組采用LPS（1 000 ng·mL-1）刺激細(xì)胞，BCNU組先采用BCNU（25 μmol·mL-1）預(yù)處理細(xì)胞30 min后，再加入LPS（1 000 ng·mL-1）刺激細(xì)胞。

1.3 real-time RT-PCR反應(yīng)

收集細(xì)胞并勻漿后加入1 mL TRIzol試劑，室溫靜置5 min；4 ℃下10 000 r·min-1離心15 min；吸取上層水相，加入異丙醇，混勻；4 ℃下10 000 r·min-1離心15 min；加入1 mL 75%乙醇洗滌沉淀，4 ℃下7 500 r·min-1離心5 min；加入無RNase水RNA溶解沉淀，-80 ℃保存。將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20 ℃保存。PCR反應(yīng)體系：反應(yīng)混合液Premix Ex Tap[天根生化科技（北京）有限公司]10 μL，上下游引物各0.8 μL，cDNA 2 μL，DEPC水6 μL，總體積19.6 μL。PCR引物由Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)，由日本TaKaRa公司合成，其序列見表1。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequence

1.4 Western blot檢測(cè)

細(xì)胞培養(yǎng)后，加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的裂解液，靜止25 min，-20 ℃保存。采用垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳提取蛋白質(zhì)，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度。實(shí)驗(yàn)步驟：制膠，電泳，轉(zhuǎn)膜；加入一抗Akt、p-Akt和Grx蛋白抗體（稀釋度1∶1 000），室溫下?lián)u床孵育1 h，使用洗膜緩沖液（Tris buffered saline Tween，TBST）在搖床上漂洗3次，每次10 min；加入二抗，37 ℃下孵育1.5 h，用TBST在室溫下?lián)u床上漂洗3次，每次5 min；然后化學(xué)發(fā)光、顯影、定影，使用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶的相對(duì)分子質(zhì)量和凈光密度值。

1.5 質(zhì)量控制和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次，每次實(shí)驗(yàn)設(shè)3組復(fù)孔，所有操作均由同一人完成。采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，多個(gè)樣本的比較采用單因素方差分析，兩個(gè)樣本之間的比較采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 LPS對(duì)EA-hy926細(xì)胞grx1基因表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，LPS刺激4、12、18、24 h后，LPS組grx1基因的相對(duì)表達(dá)量均有明顯增加（P＜0.05），12 h增加最為明顯，18、24 h時(shí)表達(dá)量低于12 h（P＜0.05）（圖1）；由此推斷，在LPS刺激下，grx1基因的表達(dá)量隨時(shí)間的增加而增加，12 h達(dá)到最高。

圖1 grx1基因的相對(duì)表達(dá)量Fig 1 Relative expression of grx1 gene

2.2 LPS對(duì)EA-hy926細(xì)胞Grx、Akt、p-Akt（308）蛋白表達(dá)的影響

在LPS刺激下，grx1基因在12 h時(shí)相對(duì)表達(dá)量最高，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究EA-hy926細(xì)胞表達(dá)Grx蛋白和Akt的變化。LPS刺激12 h，Grx蛋白的表達(dá)量明顯升高，而BCNU組的表達(dá)明顯降低（P＜0.05）（圖2），提示LPS可提高Grx蛋白的表達(dá)，而Grx抑制劑BCNU可有效抑制Grx蛋白的表達(dá)。Akt表達(dá)量在3組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而p-Akt（308）在LPS刺激組明顯增高，BCNU組明顯降低（P＜0.05）（圖2），可見BCNU也可抑制p-Akt（308）的表達(dá)。

圖2 Grx、Akt、p-Akt（308）蛋白的電泳圖譜Fig 2 Protein electrophoresis of Grx, Akt and p-Akt (308)

3 討論

牙周炎與冠心病的發(fā)病機(jī)制有很大的相似性[9]。在動(dòng)脈粥樣硬化區(qū)和心肌梗死區(qū)都能檢測(cè)到牙齦卟啉單胞菌的沉積[10]。Gibson等[11]發(fā)現(xiàn)，人體血清中的抗牙齦卟啉單胞菌抗體水平與冠心病存在一定的相關(guān)性。牙齦卟啉單胞菌的毒力因子LPS可產(chǎn)生炎癥因子如ROS等，從而引發(fā)機(jī)體內(nèi)毒素血癥。Cavrini等[12]通過一系列流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，內(nèi)毒素感染可能是心血管疾病發(fā)生的一個(gè)危險(xiǎn)因素。

Grx是一類小型的氧化還原酶，通過谷胱甘肽發(fā)揮生物學(xué)效用。Grx體系是抵御OS損傷的重要體系。在正常環(huán)境中，細(xì)胞體內(nèi)Grx表達(dá)量恒定，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)氧化物和抗氧化物比例失衡，產(chǎn)生超氧化自由基，機(jī)體抗OS系統(tǒng)Grx和硫氧還蛋白（thioredoxin，Trx）啟動(dòng)，Grx消耗量增加。Aesif等[13]發(fā)現(xiàn)，LPS可以通過LPS-IκB激酶（IκB kinase-β，IKKβ）-NF-κB-Grx途徑刺激小鼠肺上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞grx1基因的表達(dá)，提高其表達(dá)量。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS刺激EA-hy926細(xì)胞后，grx1基因表達(dá)量在刺激初期隨時(shí)間的增加而增加，12 h達(dá)到最高值。Murata等[14]發(fā)現(xiàn)，在OS條件下，grx1基因的初期表達(dá)量呈升高趨勢(shì)，與本研究結(jié)果相同。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示：Akt蛋白水平的表達(dá)無明顯變化，而Grx和p-Akt（308）的變化趨勢(shì)基本相同。由此推測(cè)，在OS初始階段，細(xì)胞內(nèi)ROS含量增加，機(jī)體發(fā)生代償反應(yīng)，Grx增加，調(diào)節(jié)p-Akt（308）水平上升；加入BCNU預(yù)處理后，Grx表達(dá)被抑制，p-Akt（308）水平隨之降低，提示p-Akt（308）可能受Grx調(diào)節(jié)。Wiedermann等[15]報(bào)道，通過下調(diào)Grx mRNA的表達(dá)，減少Grx含量，可以降低Akt的磷酸化水平。由此推測(cè)，人體細(xì)胞中Grx的高表達(dá)在組織早期抗OS過程中有十分重要的作用。在LPS刺激下，Grx通過調(diào)控Grx/Akt通路改變Grx表達(dá)水平，影響細(xì)胞的氧化敏感性，進(jìn)而調(diào)控局部組織免受OS損害。

PI3K/Akt是一條經(jīng)典的存活信號(hào)通路，在細(xì)胞凋亡和腫瘤發(fā)生中發(fā)揮著重要作用。 PI3K是Akt上游信號(hào)通路的主要效應(yīng)物，可使其下游分子Akt磷酸化，上調(diào)Akt磷酸化水平，從而抑制細(xì)胞凋亡。Kim等[16]發(fā)現(xiàn)，LPS刺激肺上皮細(xì)胞能增加ROS表達(dá)，當(dāng)抑制PI3K活性之后，ROS生成量升高，Akt磷酸化水平降低。另有研究[17]證實(shí)，Grx可以上調(diào)Akt的活性受體如PI3K等，也可能是調(diào)節(jié)Akt磷酸化水平的蛋白之一。此外，Reynaert等[18]發(fā)現(xiàn)，Grx在雙氧水刺激下可以調(diào)節(jié)NF-κB的活性。NF-κB是重要的免疫信號(hào)傳遞因子，可以調(diào)控細(xì)胞增殖、分化以及存活，與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切[19]。活化的Akt既可以通過磷酸化NF-κB的抑制性輔助因子激酶α調(diào)節(jié)其活性，也可以通過絲裂原活化蛋白3激酶影響IKKβ和NF-κB的活性[20]。細(xì)胞內(nèi)的信息傳遞都是相互作用的，共同協(xié)調(diào)生命活動(dòng)。由此推測(cè)，在OS條件下，Grx可以影響NF-κB活性，而NF-kB則負(fù)反饋調(diào)節(jié)Grx的表達(dá)。

本研究利用牙齦卟啉單胞菌的LPS誘導(dǎo)EA-hy926細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS能在基因水平影響血管內(nèi)皮細(xì)胞grx1基因的表達(dá)，Grx蛋白可能通過Grx/Akt這一通路調(diào)節(jié)p-Akt（308）的表達(dá)。Grx既是機(jī)體內(nèi)調(diào)節(jié)OS反應(yīng)的重要蛋白，也可能是細(xì)胞通過Akt途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡這一通路的關(guān)鍵蛋白。該結(jié)果在一定程度上揭示了LPS在OS導(dǎo)致的心血管疾病中的作用機(jī)制；并提示通過改變Grx表達(dá)水平可以改變細(xì)胞的氧化敏感性，這為牙周病和心血管疾病等由OS損傷導(dǎo)致的疾病治療提供新的思路。

[1]Beck JD, Eke P, Lin D, et al. Associations between IgG antibody to oral organisms and carotid intima-medial thickness in community-dwelling adults[J]. Atherosclerosis, 2005,183(2):342-348.

[2]Urata Y, Ihara Y, Murata H, et al.17Beta-estradiol protects against oxidative stress-induced cell death through the glutathione/glutaredoxin-dependent redox regulation of Akt in myocardiac H9c2cells[J]. J Biol Chem, 2006, 281(19):13092-13102.

[3]Song JJ, Lee YJ. Differential role of glutaredoxin and thioredoxin in metabolic oxidative stress-induced activation of apoptosis signal-regulating kinase 1[J]. Biochem J, 2003,373(Pt 3):845-853.

[4]Bahekar AA, Singh S, Saha S, et al. The prevalence and incidence of coronary heart disease is significantly increased in periodontitis: a meta-analysis[J]. Am Heart J, 2007, 154(5):830-837.

[5]Lou MF. Thiol regulation in the lens[J]. J Ocul Pharmacol Ther, 2000, 16(2):137-148.

[6]Niwa K, Inanami O, Yamamori T, et al. Redox regulation of PI3K/Akt and p53 in bovine aortic endothelial cells exposed to hydrogen peroxide[J]. Antioxid Redox Signal, 2003, 5(6):713-722.

[7]Mukai Y, Rikitake Y, Shiojima I, et al. Decreased vascular lesion formation in mice with inducible endothelial-specific expression of protein kinase Akt[J]. J Clin Invest, 2006, 116(2):334-343.

[8]Buchanan BB, Balmer Y. Redox regulation: a broadening horizon[J]. Annu Rev Plant Biol, 2005, 56:187-220.

[9]Beck JD, Offenbacher S, Williams R, et al. Periodontitis: a risk factor for coronary heart disease[J]. Ann Periodontol,1998, 3(1):127-141.

[10]Puddu P, Puddu GM, Cravero E, et al. The molecular sources of reactive oxygen species in hypertension[J]. Blood Press,2008, 17(2):70-77.

[11]Gibson FC 3rd, Hong C, Chou HH, et al. Innate immune recognition ofinvasive bacteria accelerates atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice[J]. Circulation, 2004,109(22):2801-2806.

[12]Cavrini F, Sambri V, Moter A, et al. Molecular detection ofTreponema denticolaandPorphyromonas gingivalisin carotid and aortic atheromatous plaques by FISH: report of two cases[J]. J Med Microbiol, 2005, 54(Pt 1):93-96.

[13]Aesif SW, Kuipers I, van der Velden J, et al. Activation of the glutaredoxin-1 gene by nuclear factor κB enhances signaling[J]. Free Radic Biol Med, 2011, 51(6):1249-1257.

[14]Murata H, Ihara Y, Nakamura H, et al. Glutaredoxin exerts an antiapoptotic effect by regulating the redox state of Akt[J]. J Biol Chem, 2003, 278(50):50226-50233.

[15]Wiedermann CJ, Kiechl S, Dunzendorfer S, et al. Association of endotoxemia with carotid atherosclerosis and cardiovascular disease: prospective results from the Bruneck Study[J]. J Am Coll Cardiol, 1999, 34(7):1975-1981.

[16]Kim HJ, Jeong JS, Kim SR, et al. Inhibition of endoplasmic reticulum stress alleviates lipopolysaccharide-induced lung inflammation through modulation of NF-κB/HIF-1α signaling pathway[J]. Sci Rep, 2013, 3:1142.

[17]楊潔, 易靜, 湯雪明. 氧化修飾在調(diào)控細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用[J]. 細(xì)胞生物學(xué)雜志, 2005, 27(2):121-126.

[18]Reynaert NL, van der Vliet A, Guala AS, et al. Dynamic redox control of NF-kappaB through glutaredoxin-regulated S-glutathionylation ofinhibitory kappaB kinase beta[J].Proc Natl Acad Sci USA, 2006, 103(35):13086-13091.

[19]Qin Y, Auh S, Blokh L, et al. TNF-alpha induces transient resistance to Fas-induced apoptosis in eosinophilic acute myeloid leukemia cells[J]. Cell Mol Immunol, 2007, 4(1):43-52.

[20]Meng F, D'Mello SR. NF-kappaB stimulates Akt phosphorylation and gene expression by distinct signaling mechanisms[J]. Biochim Biophys Acta, 2003, 1630(1):35-40.