劉向敏， 齊景偉*， 安曉萍， 劉 娜， 羅旭光， 陳大勇

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古斯隆生物技術(shù)有限責(zé)任公司，內(nèi)蒙古呼和浩特011517；3.內(nèi)蒙古賽諾草原羊業(yè)有限公司，內(nèi)蒙古呼和浩特 010011）

近年來，微生物發(fā)酵技術(shù)被廣泛應(yīng)用在飼料工業(yè)中，飼料經(jīng)發(fā)酵后，不僅適口性增強(qiáng)，難于消化的營養(yǎng)物質(zhì)、抗?fàn)I養(yǎng)因子和毒素含量降低，而且還可以提高蛋白質(zhì)含量，為動物提供有益微生物及其代謝產(chǎn)物，以調(diào)節(jié)動物胃腸道的微生態(tài)平衡和提高動物機(jī)體的免疫力（陶蕾等，2015；洪峰等，2014）。 用于發(fā)酵飼料的菌種主要有乳酸菌、酵母菌、枯草芽孢桿菌和霉菌（李龍，2010；李永凱等，2009）。

本試驗(yàn)采用枯草芽孢桿菌與酵母菌混合發(fā)酵，以真蛋白質(zhì)為評價指標(biāo)，從菌種的接種比例、腐植酸鈉添加量、麩皮含量、接種量、含水量等方面對奶牛精飼料發(fā)酵進(jìn)行了研究，為奶牛精飼料的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 枯草芽孢桿菌與酵母菌由內(nèi)蒙古斯隆生物技術(shù)有限責(zé)任公司保存與提供。

1.1.2 原料 奶牛精飼料、麩皮和腐植酸鈉均從市場購買。

1.1.3 培養(yǎng)基 營養(yǎng)肉湯（1 L）：蛋白胨 10 g，牛肉膏粉 3 g，氯化鈉 5 g。麥芽汁培養(yǎng)基（1 L）：麥牙膏粉130 g，氯霉素0.1 g。以上兩種培養(yǎng)基均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。配制固體培養(yǎng)基時，需加入2%的瓊脂粉。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基為奶牛精飼料、麩皮。奶牛精飼料組成如下：玉米蛋白28.65%，豆粕5%，菜籽粕 5%，棉籽粕 7%，DDGS14.5%，鹽 0.8%，蘇打1%，石粉1.7%，尿素0.6%，預(yù)混料0.2%，氧化鎂0.15%，氫鈣0.4%，玉米35%。

1.1.4 儀器 可見光分光光度計、離心機(jī)、水浴鍋、恒溫培養(yǎng)箱等。

1.1.5 主要試劑 福林-酚試劑甲液：由A、B兩種溶液組成。A液：4%碳酸鈉溶液與0.2 mol/L氫氧化鈉溶液等體積混合。B液：1%硫酸銅溶液與2%酒石酸鉀鈉溶液等體積混合。使用前將A與B按50∶1的比例混合即成，當(dāng)天配制使用。福林-酚試劑乙液，購買于杭州迪測生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化及種子液的制備 枯草芽孢桿菌：將冷凍保存的菌種劃線在滅菌的營養(yǎng)瓊脂平皿中，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。待長出菌落后，挑取3～4個菌落于滅菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)24 h，即得種子液。

酵母菌：將冷凍保存的菌種劃線在滅菌的麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基平皿中，28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。待長出菌落后，挑取3～4個菌落于滅菌的麥芽汁培養(yǎng)基中，28℃搖床培養(yǎng)24 h，即得種子液。

1.2.2 檢測指標(biāo) 待測液的制備：稱取0.3 g經(jīng)65℃烘干并粉碎的飼料樣品，加入8 mL蒸餾水，混勻加入2 mol/L的氫氧化鈉溶液，搖勻，50℃恒溫水浴鍋水浴1 h，4000 r/min離心5 min，取上清液，即為待測液。

真蛋白質(zhì)測定方法同趙書景（2008）的測定方法。

1.3 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2007初步整理后，用 SPSS 17.0中的單因子方差分析 （One-Way ANOVY），以P＜0.05作為差異顯著水平判斷標(biāo)準(zhǔn)，差異顯著時采用Duncan’s方法對各組間平均數(shù)進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌與酵母菌的接種比例對飼料真蛋白質(zhì)含量的影響 枯草芽孢桿菌與酵母菌以不同比例混合發(fā)酵奶牛精飼料，飼料中真蛋白質(zhì)含量見圖1。

由圖1可以看出，枯草芽孢桿菌與酵母菌以任何比例接種都可增加飼料中真蛋白質(zhì)的含量，當(dāng)枯草芽孢桿菌與酵母菌比例為3∶7時，真蛋白質(zhì)含量為18.66%，與原精料相比提高了3.35%（P＜0.05），故確定枯草芽孢桿菌與酵母菌接種比例為3∶7。枯草芽孢桿菌與酵母菌是微生物發(fā)酵技術(shù)常用的發(fā)酵菌種 （甄玉國，2005；Antonio 等，2004）。酵母菌菌體蛋白含量高，約占菌體干物質(zhì)的32%～75%，其細(xì)胞壁含有多種生物活性物質(zhì)，能促進(jìn)免疫反應(yīng)，具有益生菌和益生元的特點(diǎn)和作用（朱平軍，2011）?？莶菅挎邨U菌產(chǎn)生的蛋白酶可將大分子蛋白分解為小分子蛋白、肽類和游離氨基酸。兩菌種在飼料發(fā)酵過程中發(fā)揮不同的作用，不同配比將直接影響飼料的品質(zhì)，而適當(dāng)?shù)木N比例會充分體現(xiàn)兩種菌的優(yōu)勢，并促進(jìn)其共同生長（揣玉多等，2008）。

圖1 枯草芽孢桿菌與酵母菌的接種比例對飼料真蛋白質(zhì)含量的影響

2.2 種子液中不同腐植酸鈉添加量對飼料真蛋白質(zhì)含量的影響 種子液中不同腐植酸鈉添加量對飼料中真蛋白質(zhì)含量的影響見圖2。

圖2 種子液中不同腐殖酸鈉添加量對飼料真蛋白質(zhì)含量的影響

由圖2可以看出，種子液中腐植酸鈉添加量為0.5%～2%時，真蛋白質(zhì)含量隨著腐植酸鈉的增加而增多；腐植酸鈉添加量為2%～8%時，真蛋白質(zhì)含量隨著腐植酸鈉的增加而降低，當(dāng)腐植酸鈉添加量為2%時，真蛋白質(zhì)含量為18.46%，未添加腐植酸鈉組真蛋白質(zhì)含量為17.25%，兩者相比，種子液中添加2%的腐植酸鈉顯著提高1.21個百分點(diǎn)。

2.3 發(fā)酵底物中不同腐植酸鈉添加量對飼料真蛋白含量的影響 發(fā)酵底物中不同腐植酸鈉添加量對飼料中真蛋白質(zhì)的影響見圖3。由圖3可以看出，發(fā)酵底物中添加不同含量的腐植酸鈉均可明顯提高真蛋白質(zhì)含量 （P＜0.05），當(dāng)腐殖酸鈉添加量為0.5% ～2%時，真蛋白質(zhì)含量隨著腐植酸鈉的增加而增加；腐植酸鈉添加量為2%～8%時，真蛋白質(zhì)含量隨著腐植酸鈉的增加而降低，當(dāng)發(fā)酵底物中腐植酸鈉添加量為2%時，真蛋白質(zhì)含量可達(dá)20.13%，未添加腐植酸鈉組真蛋白質(zhì)含量為18.17%，兩者相比，真蛋白質(zhì)含量顯著提高1.96個百分點(diǎn)（P＜0.05）。

圖3 發(fā)酵底物中不同腐植酸鈉添加量對飼料真蛋白質(zhì)含量的影響

2.4 發(fā)酵底物中麩皮添加量對飼料真蛋白質(zhì)含量的影響 不同的麩皮添加量對飼料中真蛋白質(zhì)含量的影響見圖4。

圖4 發(fā)酵底物中麩皮含量對飼料真蛋白質(zhì)含量的影響

由圖4可以看出，麩皮添加量為5%～15%時，真蛋白質(zhì)含量隨著麩皮的增加而增加，與未添加麩皮組相比，差異顯著；當(dāng)麩皮添加量為15%～20%，隨著麩皮含量的增加，真蛋白質(zhì)含量逐漸降低。因?yàn)?%、10%和15%組真蛋白質(zhì)含量分別為20.16%、20.21%、20.26%（P＞ 0.05）， 故麩皮最適添加量為5%。麩皮作為一種輔料加入到底物中，不僅可保持發(fā)酵基質(zhì)的疏松性，而且可維持合適的碳氮比，并為菌體提供生長所需的微量元素（汪倫記等，2012）。

2.5 接種量對飼料真蛋白質(zhì)含量的影響 合適的接種量可有效促進(jìn)菌體的生長并分泌代謝物，減少發(fā)酵成本。不同接種量對飼料中真蛋白質(zhì)含量的影響見圖5。

圖5 接種量對飼料真蛋白質(zhì)含量的影響

由圖5可以看出，在總接菌量較小的情況下，菌種需要較長時間才能大量生長，對固態(tài)物料利用率低。接種量為2.5%～7.5%，真蛋白質(zhì)含量隨著接種量的增加而增加；接種量為7.5%～10%，真蛋白質(zhì)含量隨著接種量的增加而降低。可能是由于接菌量過大，飼料中的水分、營養(yǎng)成分滿足不了菌體的正常代謝，抑制了菌體生長；菌體生長旺盛，固態(tài)發(fā)酵飼料溫度過高，從而影響菌體生長。又因?yàn)?.5%、5%和7.5%組真蛋白質(zhì)含量分別為20.25%、20.35%、20.45%（P＞ 0.05）， 故確定最佳接種量為2.5%。

2.6 含水量對飼料真蛋白質(zhì)含量的影響 含水量低，使菌體生長受到抑制；含水量過高，發(fā)酵料就會過濕過黏，對發(fā)酵料散熱不利，在好氧發(fā)酵時影響發(fā)酵原料的透氣性和氧氣濃度。不同的含水量對飼料中真蛋白質(zhì)含量的影響見圖6。

圖6 含水量對飼料真蛋白質(zhì)含量的影響

由圖6可以看出，含水量為40%～50%時，真蛋白質(zhì)含量隨著水分的增多而增多，含水量為50%時，真蛋白質(zhì)含量可達(dá)20.26%，顯著高于前三組（P＜0.05）；含水量為50% ～60%時，真蛋白質(zhì)含量隨著水分的增加而降低，原因可能是過多的游離水分影響了氧氣在物料中的傳遞，使菌體缺氧，影響生長。由此可以得出，最適含水量為50%。

2.7 發(fā)酵時間對飼料真蛋白質(zhì)含量的影響 發(fā)酵時間對飼料真蛋白質(zhì)含量的影響見圖7。

圖7 發(fā)酵時間對飼料真蛋白質(zhì)含量的影響

由圖7可以看出，隨著發(fā)酵時間的增加，真蛋白質(zhì)含量也相應(yīng)增加。發(fā)酵早期，菌體對新的生長環(huán)境適應(yīng)較差，生長緩慢，代謝能力差，因此真蛋白質(zhì)含量較低，當(dāng)發(fā)酵時間為 12、24、36、72 h，真蛋白質(zhì)含量差異不顯著（P＞0.05）。隨著發(fā)酵時間的延長，菌體數(shù)量增多，代謝增強(qiáng)，真蛋白質(zhì)含量逐漸增高，在48 h時達(dá)到最大，為20.16%。與發(fā)酵時間為60 h時差異不顯著（P>0.05），與其他組相比，差異顯著（P＜0.05）。而后，隨著發(fā)酵時間的延長，真蛋白質(zhì)含量雖有增加，但增幅很小。故確定最佳發(fā)酵時間為48 h。

2.8 發(fā)酵溫度對飼料真蛋白質(zhì)含量的影響 發(fā)酵溫度也是影響微生物發(fā)酵的一個重要因素，過高或過低都不利于菌體的生長。不同的發(fā)酵溫度對飼料中真蛋白質(zhì)含量的影響見圖8。

圖8 發(fā)酵溫度對飼料真蛋白質(zhì)含量的影響

由圖8可以看出，隨著溫度升高，真蛋白質(zhì)含量逐漸增加。當(dāng)溫度為34℃和36℃，真蛋白質(zhì)含量分別為20.11%和20.6%，差異不顯著，故確定最佳發(fā)酵溫度為34℃。當(dāng)發(fā)酵溫度為34℃和36℃時，兩菌種可較好地共生，菌體生長旺盛，對飼料的利用率更高，菌體蛋白大量產(chǎn)生，較大提高飼料中真蛋白質(zhì)含量。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)條件下得到的奶牛精飼料最佳發(fā)酵條件為：枯草芽孢桿菌與酵母菌接種比例為3∶7，種子液中腐植酸鈉最適添加量為2%，發(fā)酵底物中腐植酸鈉最適添加量為2%，麩皮含量5%，含水量50%，接種量2.5%，發(fā)酵時間48 h，發(fā)酵溫度34℃。在此條件下，真蛋白質(zhì)含量可達(dá)19.94%，與未發(fā)酵組相比顯著提高了4.63個百分點(diǎn)。

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