·綜述·

雙級靶向納米載體在腦腫瘤診斷和治療方面的應(yīng)用

高洪元1a，吳建勇1b，倪曙民2(1.復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院靜安分院，a.腫瘤科;b.臨床藥理科，上海 200040；2.寧波大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科，浙江 寧波 315020)

[摘要]血腦屏障的存在嚴(yán)重阻礙了腦腫瘤化療藥物向腦內(nèi)遞送。納米粒、脂質(zhì)體、膠束等納米載體可顯著增加藥物的穿過血腦屏障轉(zhuǎn)運的能力，采用單一或雙功能基制備的雙級靶向納米載體還可進一步增加藥物的腦內(nèi)遞送及在腦腫瘤病變部位的濃集，從而顯著提高腦腫瘤的診斷和治療效果。筆者主要介紹雙級靶向納米載體的設(shè)計思路、靶向功能基的最新研究進展，為相關(guān)研究提供參考。

[關(guān)鍵詞]雙級靶向；納米載體；腦腫瘤；診斷；治療

[作者簡介]高洪元，本科，主治醫(yī)師.研究方向：腫瘤治療.Tel：13916249373；E-mail：gaogaogen@163.com

[中圖分類號]R979.1[文獻標(biāo)志碼]A

DOI[]10.3969/j.issn.1006-0111.2015.01.003

[收稿日期]2013-11-12[修回日期]2014-04-21

Application of dual-targeting nano-carriers in diagnosis and therapy of brain tumors

GAO Hongyuan1a,WU Jianyong1b,NI Shumin2(1.Huashan Hospital Affiliated to Fudan University Jing′an Branch,a.Department of Oncology;b.Department of Clinical Pharmacology,Shanghai 200041,China;2.Department of Oncology,Affiliated Hospital of Ningbo University,Ningbo 315020,China)

Abstract[]The delivery of therapeutical agents for brain tumors′ treatment is enormously prevented by the presence of blood-brain barrier.Nano-carriers such as nano-particles，liposomes and micelles can significantly increase the transport of drugs across the blood-brain barrier.The dual-targeting nano-carriers modified by one or two functional groups can further increase the brain delivery of drugs as well as their accumulation in brain tumors，resulting in significant improvement in the diagnosis and therapy of brain tumors.This article mainly focused on the recent development of strategies and functional groups of dual-targeting nano-carriers，providing a reference for relevant investigations.

[Key words]dual-targeting;nano-carrier;brain tumor;diagnosis;therapy

腦腫瘤的診斷和治療是目前醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一項巨大挑戰(zhàn)，其主要原因是血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)的存在嚴(yán)重阻礙了藥物的腦內(nèi)遞送，絕大部分經(jīng)血管給予的診斷試劑或治療藥物難以在腦組織中達(dá)到目標(biāo)濃度[1]。具有腦靶向特性的納米載藥系統(tǒng)可以增加藥物的腦內(nèi)遞送，這些系統(tǒng)的主要特點是納米載體，如脂質(zhì)體、納米粒、膠束等與可特異性結(jié)合于BBB的功能基結(jié)合在一起，以受體介導(dǎo)、吸附介導(dǎo)、轉(zhuǎn)運體介導(dǎo)等方式促進納米載體穿過BBB進入腦組織，比如轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)、乳鐵蛋白(Lf)等的修飾可顯著增加脂質(zhì)體的腦內(nèi)轉(zhuǎn)運，增強藥物的治療效果[2，3]。但是，納米載體在通過BBB后廣泛分布于整個腦內(nèi)，減弱了藥物在病變部位的治療作用，同時增加了藥物、尤其是抗腫瘤藥物對正常腦組織的損傷，有可能引起嚴(yán)重的毒副作用。理想的給藥方式是藥物跨過BBB后還能更多地濃集于病變區(qū)，如腦腫瘤部位，因此，近年來“雙級靶向”的概念逐漸興起并受到重視，其主要思路是首先利用靶向于BBB的功能基將藥物遞送入腦，然后利用靶向于病變部位的功能基使藥物濃集于目標(biāo)區(qū)域，從而在提高藥物療效的同時降低其毒副作用。筆者就雙級靶向納米藥物載體在腦腫瘤診斷和治療方面的應(yīng)用現(xiàn)狀做一介紹，為其進一步研究提供參考。

1單一功能基介導(dǎo)的雙級靶向納米載體

某些功能基既可以特異性結(jié)合于BBB，也能高效結(jié)合于腫瘤組織或細(xì)胞，因此，僅以一種功能基修飾納米載體就可實現(xiàn)雙級靶向的目的，具有這種性質(zhì)的靶向功能基主要有angiopep-2、膽堿衍生物、peptide 22肽、MT1-AF7p肽等，下面分別對其進行介紹。

1.1　angiopep-2

angiopep-2 (TFFYGGSRGK-RNNFKTEEY)是目前研究最多的雙級靶向功能基，它是Kunitz型結(jié)構(gòu)域的衍生肽，可特異性結(jié)合于在BBB及膠質(zhì)瘤細(xì)胞均過表達(dá)的低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1(LRP1)，其胞吞轉(zhuǎn)運能力及腦實質(zhì)內(nèi)的蓄積作用顯著高于Tf、Lf及抗生物素蛋白，而且它不是外排泵P-糖蛋白的底物，這有利于減少藥物載體在腦內(nèi)皮細(xì)胞上的外排[4]。

Xin等[5，6]設(shè)計了angiopep-2共價結(jié)合的聚乙二醇-聚己內(nèi)酯納米粒(ANG-NP)，用于腦膠質(zhì)瘤的治療。與未修飾的納米粒(NP)相比，ANG-NP在人惡性膠質(zhì)瘤U87 MG細(xì)胞上的內(nèi)吞作用顯著增加?？乖鲋澈图?xì)胞凋亡實驗表明，載紫杉醇的ANG-NP具有明顯的抑制U87 MG細(xì)胞的作用。以BBB單層膜模型，如腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(brain capillary endothelial cells，BCECs)考察納米粒的體外跨BBB特性，結(jié)果顯示，angiopep-2修飾后納米粒的轉(zhuǎn)運率顯著增加，而且單層膜下層的U87 MG細(xì)胞的活性明顯降低。ANG-NP在體外3D腫瘤球和體內(nèi)膠質(zhì)瘤上的滲透、分布和蓄積均明顯高于NP。與泰素和NP相比，載紫杉醇的ANG-NP的抗膠質(zhì)瘤作用顯著增強。初步安全性實驗表明，連續(xù)7 d靜脈給予小鼠空白ANG-NP 100 mg/(kg·d)，未見血液系統(tǒng)、肝、腎及腦組織產(chǎn)生急性毒性。同時，Xin等[7]還以異硫氰酸若丹明B為熒光探針考察了ANG-NP的腦靶向轉(zhuǎn)運機制：ANG-NP主要是通過穴樣凹陷介導(dǎo)和網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的胞吞作用進入BCECs，其細(xì)胞攝取呈時間、濃度及能量依賴性；angiopep-2修飾后納米粒在皮質(zhì)層、側(cè)腦室、第三腦室及海馬處的蓄積量明顯增加；采用游離的低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LRP)的配體(如angiopep-2或載脂蛋白)作為特異性受體抑制劑可顯著抑制ANG-NP的BCECs攝取、體外BBB模型轉(zhuǎn)運的穿透性及體內(nèi)腦組織的滲透性，說明ANG-NP的腦靶向作用可能是通過LRP受體介導(dǎo)的。

Huang等[8]將angiopep-2以雙功能基PEG連接在高分子聚合物PAMAM上，然后與DNA復(fù)合，形成PAMAM-PEG-angiopep/DNA納米粒。細(xì)胞攝取機制表明，該納米?？赏ㄟ^內(nèi)涵體/溶酶體通路進入細(xì)胞核。與未經(jīng)angiopep-2修飾的納米粒及未PEG化的納米粒相比，靶向納米粒在腦組織尤其在腫瘤部位的分布明顯增加。與其他各組及市售替莫唑胺相比，靶向納米?？烧T導(dǎo)更廣泛的腫瘤細(xì)胞凋亡。在體內(nèi)抑制腦腫瘤實驗中，靶向納米粒與替莫唑胺組的荷瘤小鼠的中位生存期分別為61 d和49 d，顯著高于其他各組。

Ren等[9]制備了angipep-2修飾的PEG化的氧化多壁碳納米管的雙級靶向遞藥系統(tǒng)(O-MWNTs-PEG -ANG)，用于增強阿霉素對腦膠質(zhì)瘤的治療效果。體外細(xì)胞實驗表明，angipep-2的修飾可顯著增加BCECs及腦膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞對碳納米管的攝取，且大部分碳納米管進入細(xì)胞溶酶體內(nèi)。體內(nèi)熒光成像實驗證實，O-MWNTs-PEG-ANG不僅可較多地進入腦組織內(nèi)，更能蓄積于腦腫瘤部位。載阿霉素的O-MWNTs-PEG-ANG的C6細(xì)胞毒性高于阿霉素、對荷膠質(zhì)瘤小鼠的中位生存期的延長作用也優(yōu)于阿霉素。另外，以BCECs和C6細(xì)胞毒性、血液學(xué)分析及CD68免疫組化分析評價O-MWNTs-PEG-ANG的生物安全性，結(jié)果顯示其毒性低、生物相容性良好。以組織病理學(xué)分析評價載阿霉素O-MWNTs-PEG-ANG的生物安全性，結(jié)果顯示其心臟毒性低于阿霉素。這些結(jié)果顯示O-MWNTs-PEG-ANG是一種理想的雙級靶向遞藥系統(tǒng)，有助于提高腦膠質(zhì)瘤的治療效果，但碳納米管本身的毒性仍然存在爭議，較大劑量入腦的安全性可能需要進一步實驗的證實。

1.2　膽堿衍生物

膽堿衍生物首先由Li等[10]設(shè)計合成，并證實其腦靶向特性。腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞上分布著大量的特異性轉(zhuǎn)運體，用于腦組織的營養(yǎng)供給，這些轉(zhuǎn)運體可高效轉(zhuǎn)運特定的營養(yǎng)物質(zhì)進入腦內(nèi)。膽堿轉(zhuǎn)運體就是其中的典型代表，它在BBB上廣泛分布，并可轉(zhuǎn)運大量膽堿穿過BBB，因而可作為腦靶向遞藥的靶點。同時，腦膠質(zhì)瘤的惡性程度高，需要攝入大量的膽堿來合成膜磷脂，因而在膠質(zhì)瘤細(xì)胞上，包括膽堿轉(zhuǎn)運體樣蛋白(CTL1)在內(nèi)的膽堿轉(zhuǎn)運體是過表達(dá)的[11]。因此，可與膽堿轉(zhuǎn)運體高效結(jié)合的膽堿衍生物是腦腫瘤潛在的雙級靶向功能基。

Li等[12]將阿霉素插入到Trail質(zhì)粒中形成穩(wěn)定的復(fù)合物，并以樹狀聚左旋賴氨酸(DGL)壓縮該復(fù)合物形成納米共給藥系統(tǒng)，然后以膽堿衍生物修飾該共給藥系統(tǒng)。U87 MG細(xì)胞攝取實驗中，膽堿衍生物的修飾顯著增加了共給藥系統(tǒng)的攝取率和細(xì)胞殺傷作用。與單用一種藥物及未修飾的系統(tǒng)相比，膽堿衍生物的修飾增加了共給藥體系誘導(dǎo)的體內(nèi)外細(xì)胞凋亡。熒光成像結(jié)果顯示，膽堿衍生物的修飾明顯增加了共給藥系統(tǒng)在小鼠腦腫瘤部位的蓄積，同時減少了其在肝、脾的分布。體內(nèi)抑制U87 MG移植瘤實驗中，膽堿衍生物修飾的共給藥系統(tǒng)組的荷瘤小鼠的中位生存期(47 d)顯著優(yōu)于未修飾的共給藥系統(tǒng)組(37 d)和游離阿霉素組(32 d)，證實了該靶向共給藥系統(tǒng)的優(yōu)勢。另外，以膽堿衍生物修飾的DGL包封釓造影劑也可明顯增強其對腦膠質(zhì)瘤的磁共振(MRI)診斷效果[13]。

1.3　peptide 22肽

peptide 22肽(Ac-[cMPRLRGC]c-NH2)是經(jīng)噬菌體展示技術(shù)篩選出的多肽，對BBB和腦膠質(zhì)瘤過表達(dá)的低密度脂蛋白受體(LDLR)具有高親和力，而且它不會與內(nèi)源性的低密度脂蛋白發(fā)生競爭性抑制，有利于納米載體的有效遞送[14]。Zhang等[15]采用ELISA實驗驗證了LDLR在大鼠膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞及BCECs上高表達(dá)，并證實其在大鼠心肌H9c2(2-1)細(xì)胞上低表達(dá)。細(xì)胞攝取實驗表明，peptide-22肽的修飾顯著增加了C6細(xì)胞、BCECs對PEG-PLA納米粒的攝取，但是H9c2(2-1) 細(xì)胞的攝取量未增加，同時，游離的peptide-22肽可顯著抑制C6細(xì)胞、BCECs對修飾后納米粒的攝取。細(xì)胞攝取機制實驗表明，C6細(xì)胞、BCECs對納米粒的攝取具有能量依賴性，并通過穴樣凹陷介導(dǎo)及網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進入細(xì)胞。在體外BBB模型上，peptide-22肽的修飾顯著增加了納米粒穿過BBB轉(zhuǎn)運的能力以及BBB下層C6細(xì)胞的凋亡，而且這些作用可被游離的peptide-22所抑制。體外及體內(nèi)熒光成像顯示，peptide-22肽修飾的納米粒可穿過BBB并顯著增加納米粒在腦膠質(zhì)瘤部位的蓄積。同時，peptide-22肽修飾的納米粒可明顯增加體內(nèi)腫瘤細(xì)胞凋亡，并顯著延長荷腦膠質(zhì)瘤小鼠的中位生存期。這些結(jié)果表明，peptide-22肽是一種高效的雙級靶向功能基，可介導(dǎo)納米載體向腦膠質(zhì)瘤的轉(zhuǎn)運。

1.4　MT1-AF7p肽

雖然在膠質(zhì)瘤發(fā)生的同時一般會伴隨著BBB通透性的增加，但是血-腫瘤屏障(brain-tumor barrier，BTB)仍然存在，其低通透性是限制抗腫瘤藥物遞送的主要障礙；同時，到達(dá)腫瘤部位的藥物難以向膠質(zhì)瘤內(nèi)部滲透也是治療效果較差的原因之一。

膜型基質(zhì)金屬蛋白酶1 (MT1-MMP)表達(dá)于多數(shù)的新生血管和膠質(zhì)瘤細(xì)胞，與膠質(zhì)瘤的發(fā)生密切相關(guān)，是膠質(zhì)瘤靶向治療的潛在靶點。經(jīng)噬菌體展示技術(shù)篩選獲得的MT1-AF7p肽(HWKHLHNTKTFL)就是對MT1-MMP具有高親和性的多肽[16]。Gu等[17]制備了MT1-AF7p肽修飾的PEG-PLA納米粒(MT1-NP)，并考察其體內(nèi)外靶向性效果。C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞攝取實驗顯示，MT1-NP的細(xì)胞內(nèi)蓄積量顯著高于未修飾納米粒，主要攝取方式是能量依賴性的巨胞飲和脂筏介導(dǎo)的內(nèi)吞。體內(nèi)熒光成像及膠質(zhì)瘤分布實驗表明，MT1-AF7p肽的修飾顯著增加了納米粒穿過BTB轉(zhuǎn)運的能力及在膠質(zhì)瘤實質(zhì)內(nèi)的蓄積。體外C6腫瘤球?qū)嶒灡砻?，MT1-NP可高效地進入腫瘤球內(nèi)并顯著增加紫杉醇對腫瘤球的抑制作用。體內(nèi)抑制C6膠質(zhì)瘤實驗中，與未修飾的納米粒相比，MT1-NP顯著延長了荷瘤小鼠的中位生存期(48 d與32 d之比)，證實了MT1-AF7p的靶向效果。

這些具有雙級靶向特性的功能基多為人工合成的多肽類化合物，結(jié)構(gòu)簡單，性質(zhì)較為穩(wěn)定，適合工業(yè)化生產(chǎn)，尤其是被廣泛證實靶向效果的angiopep-2，有望在近年應(yīng)用于臨床研究中。

2雙功能基介導(dǎo)的雙級靶向納米載體

由于某些特異性受體僅高表達(dá)于BBB或腦腫瘤細(xì)胞，或者功能基在經(jīng)過第一級屏障時不能繼續(xù)發(fā)揮作用，這就需要多個功能基的配合使用以提高靶向效率，如靶向于BBB的Tf、TGN肽等與靶向于腦腫瘤的葉酸、RGD肽等配合使用。

2.1　TGN肽與AS1411適體的配合使用

TGN肽(TGNYKALHPHNG)是經(jīng)噬菌體展示技術(shù)獲得的、可特異性結(jié)合于BBB的多肽，以其修飾納米粒后可顯著增加納米粒的腦內(nèi)遞送[18]。AS1411適體是一種富含鳥嘌呤的寡核苷酸，可結(jié)合于在C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞漿膜高表達(dá)的核仁蛋白，從而增強與其相連的納米粒的抗腫瘤作用[19]。

Gao等[20]采用TGN肽和AS1411適體修飾PEG-PCL納米粒，構(gòu)建了腦膠質(zhì)瘤級聯(lián)遞藥系統(tǒng)。體外細(xì)胞攝取和3D腫瘤球滲透實驗證實，該系統(tǒng)不僅可以結(jié)合于bEnd.3內(nèi)皮細(xì)胞和C6腫瘤細(xì)胞，還可以穿透內(nèi)皮細(xì)胞單層和腫瘤細(xì)胞到達(dá)腫瘤球的內(nèi)部，這在膠質(zhì)瘤治療中極為重要。體內(nèi)熒光成像實驗進一步證實，雙級靶向納米粒的腦內(nèi)分布特性(膠質(zhì)瘤內(nèi)熒光強度、膠質(zhì)瘤/正常腦組織熒光強度比)顯著優(yōu)于單修飾及未修飾的納米粒。體內(nèi)抑瘤實驗中，載多西紫杉醇的雙級靶向納米粒顯示了最好的抗膠質(zhì)瘤作用，明顯延長了荷膠質(zhì)瘤小鼠的中位生存期。

2.2　Tf與葉酸的配合使用

Tf可與BBB上高表達(dá)的Ⅱ型跨膜糖蛋白-轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR)特異性結(jié)合，以受體介導(dǎo)的方式穿過BBB，也是目前研究最多的BBB靶向功能基。葉酸受體在許多腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)，并隨著腫瘤惡性程度的提高而增多，因而可作為腫瘤靶向功能基。Gao等[21]將Tf和葉酸修飾在脂質(zhì)體上，制備了載多柔比星的雙級靶向脂質(zhì)體。在體外bEnd.3 BBB模型中，雙級靶向脂質(zhì)體組的細(xì)胞中藥物蓄積、P糖蛋白表達(dá)及藥物穿過BBB轉(zhuǎn)運的能力均顯著優(yōu)于未修飾及單修飾的脂質(zhì)體。體內(nèi)分布實驗表明，雙級靶向脂質(zhì)體可透過BBB，并主要分布于腦腫瘤部位。體內(nèi)抑瘤實驗中，雙級靶向脂質(zhì)體可減小腫瘤的體積并延長荷C6腦膠質(zhì)瘤大鼠的生存期。雙級靶向脂質(zhì)體增加了腦腫瘤的治療效率，并減小了多柔比星的毒性，顯示了良好的腦靶向作用。

2.3　Tf與RGD肽的配合使用

RGD肽是經(jīng)噬菌體展示技術(shù)篩選得到的三肽，可特異性結(jié)合于腫瘤細(xì)胞過表達(dá)的整合素受體，將其制成五元環(huán)化結(jié)構(gòu)[如c(RGDfK)、c(RGDfC)、c(RGDyK)、c(RGDyC)等]時其穩(wěn)定性和結(jié)合特性還會有所提高[22]。Zhang等[23]構(gòu)建了Tf修飾的包載c(RGDfK)-紫杉醇結(jié)合物的膠束(TRPM)，并評價了其靶向效率、抗膠質(zhì)瘤活性及體內(nèi)外毒性。與未修飾膠束相比，Tf的修飾使BCECs對膠束的攝取增加了2.4倍，提高了靜脈注射后藥物在腦內(nèi)的蓄積。隨后，c(RGDfK)-紫杉醇結(jié)合物從膠束中釋放出來，并靶向結(jié)合于整合素過表達(dá)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞，從而顯著延長了其在膠質(zhì)瘤及腫瘤旁組織的滯留。更重要的是，TRPM具有更強的體內(nèi)抗膠質(zhì)瘤活性，該組荷顱內(nèi)U87 MG膠質(zhì)瘤小鼠的中位生存期(42.8 d)顯著長于Tf修飾的紫杉醇膠束組(39.5 d)、未修飾的紫杉醇膠束組(34.8 d)、泰素組(33.6 d)及生理鹽水組(34.5 d)。另外，TRPM沒有引起小鼠體重的下降，而且其毒性低于Tf修飾的紫杉醇膠束。

2.4　Tf與他莫昔芬的配合使用

他莫昔芬是一種選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑，可逆轉(zhuǎn)多藥耐藥蛋白對藥物的外排，有可能會抑制BBB和腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的藥物外排轉(zhuǎn)運體，從而增加藥物穿過BBB的轉(zhuǎn)運能力及腫瘤細(xì)胞的攝取能力[24]。Tian等[25]以他莫昔芬和Tf修飾了包載表柔比星的脂質(zhì)體，并以C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞、C6腫瘤球、體外BBB模型及荷C6腦膠質(zhì)瘤大鼠來評價該脂質(zhì)體的體內(nèi)外特性。體外實驗中，雙修飾脂質(zhì)體顯示出最強的抑制C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞或腫瘤球的作用，還可顯著增強穿過BBB的轉(zhuǎn)運能力及靶向于腦腫瘤細(xì)胞的作用。體內(nèi)抑制膠質(zhì)瘤實驗中，雙修飾脂質(zhì)體組的荷瘤大鼠的中位生存期顯著長于單修飾及未修飾的脂質(zhì)體，說明兩種靶向功能基發(fā)揮了協(xié)同作用。

類似的雙功能基系統(tǒng)還有Tf與麥胚凝集素(WGA)的配合使用[26]、他莫昔芬與WGA的配合使用[27]等，這里不再贅述。

使用兩種不同作用的功能基來實現(xiàn)雙級靶向作用時，可根據(jù)需要靈活調(diào)整兩種功能基的比例，以達(dá)到腦腫瘤治療的最佳效果，這使其明顯優(yōu)于單功能基修飾的雙級靶向系統(tǒng)。但是，在納米載體上修飾兩種功能基、尤其是修飾Tf等大分子時工藝繁雜，結(jié)果的重現(xiàn)性也較差，實驗思路的設(shè)計和實施仍需進一步改進。

3小結(jié)

如何使藥物高效地穿過BBB并靶向濃集于腦腫瘤部位一直是醫(yī)藥領(lǐng)域研究的熱點和難點，“雙級靶向”概念的提出給相關(guān)研究帶來了新的希望，同時這種思路也逐漸擴展到其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的靶向治療中。在過去幾年中，雙級靶向納米載體的研究取得了許多有價值的成果，使其成為前景廣闊的腦腫瘤治療策略。但是現(xiàn)有的雙級靶向策略主要是對原有的單一靶向策略的延伸，靶向效果有待進一步的提高，而且靶向系統(tǒng)的制備也較為復(fù)雜，其臨床應(yīng)用的價值尚不可知，因此，雙級靶向納米載體尚需更深入地研究來補充、完善和驗證。

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[本文編輯]陳靜