向曉波 周艷萌 馮琳穎 董 華

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院口腔外科，貴州遵義563000;2.遵義醫(yī)學(xué)院微生物與免疫學(xué)實驗室，貴州遵義563000;3.遵義醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)與科技學(xué)院2011級，貴州遵義563000;4.遵義醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)與科技學(xué)院2012級，貴州遵義563000)

齲病(dental caries)俗稱蟲牙、蛀牙，是多種因素作用下由口腔常駐菌引起的內(nèi)源性感染性疾病，其特點是發(fā)病率高、分布廣，是口腔常見疾病，也是人類最普遍的疾病之一。世界衛(wèi)生組織已將其與腫瘤和心血管疾病并列為人類三大重點防治疾病。齲洞中的微生物都是以牙菌斑生物膜的形式定植在齲洞中［1］，在齲洞中存在一定數(shù)量的真菌，其中白色念珠菌(C.albicas)占優(yōu)勢［2］。在健康成年人齲洞中白色念珠菌被檢出 50% ～60%［3］，有報道［4］高齲兒童的白色念珠菌檢出率高于無齲兒童，在兒童牙本質(zhì)齲中白色念珠菌的檢出率占71% ～97%［5］，中老年人齲洞中的白色念珠菌檢出率也很高［6］。同時，白色念珠菌也是在根管治療中檢出率最高的真菌［7］。

近些年來，研究［8］發(fā)現(xiàn)中藥在治療真菌生物膜方面具有較好的療效，很少出現(xiàn)耐藥，其具有藥效長，不良作用小，能夠調(diào)節(jié)菌群平衡等優(yōu)點。中藥厚樸為木蘭科木蘭屬植物厚樸或凹葉厚樸的干燥干皮、根皮及枝皮?，F(xiàn)代藥理試驗［9］證明厚樸具有廣譜抗菌、抗腫瘤、抗炎、保護心腦血管、抗?jié)円约翱鼓茸饔?。厚樸?magnolol)及和厚樸酚(honokiol)是公認(rèn)的厚樸基本活性成分，田玉珠等［8］觀察了和厚樸酚對體外白色念珠菌生物膜形成的影響，發(fā)現(xiàn)其對白色念珠菌黏附及其生物膜的形成及厚度均有抑制。厚樸酚與和厚樸酚同屬酚類，筆者推測其對白色念珠菌也應(yīng)具有抑制作用，因此本試驗擬通過微孔板法復(fù)制白色念珠菌體外黏附及生物膜模型，采用XTT〔2，3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide〕減低法初步探討厚樸酚對白色念珠菌黏附、生物膜形成的影響，為厚樸酚用于口腔治療白色念珠菌相關(guān)齲病提供基礎(chǔ)實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種

白色念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 10231由遵義醫(yī)學(xué)院微免實驗室提供。

1.2 藥物

厚樸酚購于上海圻明生物科技有限公司(HPLC法，純度≥98%)。

1.3 試劑

RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco公司，美國)，YPD液體培養(yǎng)基依據(jù)文獻(xiàn)［10］配制。XTT〔2，3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide〕購于加拿大BBI公司，二甲基亞砜(DMSO)(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，分析純)。

1.4 儀器

96孔微量培養(yǎng)板(Corning公司，美國)，DHP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱 (上海一恒科技有限公司 )。MK3酶標(biāo)儀(Thermo公司，美國)。

1.5 方法

1)C.albicas菌懸液的制備:凍存的菌株接種于沙氏培養(yǎng)基復(fù)蘇、分離純化，挑取單個菌落轉(zhuǎn)種于酵母蛋白胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose medium，YPD)液體培養(yǎng)基中，30℃搖床培養(yǎng)過夜。PBS緩釋液清洗3次后，用RPMI 1640培養(yǎng)基進行稀釋，麥?zhǔn)媳葷峁苷{(diào)整菌液濃度至1×106個細(xì)胞/mL。

2)厚樸酚應(yīng)用液的配制:用40%聚乙二醇400將厚樸酚配成1 mg/mL的母液，濾器過濾除菌后，用RPMI 1640培養(yǎng)液按二倍稀釋法將厚樸酚母液稀釋成以下濃度:125、62.5 31.3、15.6 和7.8 mg/L。

3)不同濃度厚樸酚抗白色念珠菌黏附作用的測定:將100 μL的菌液(1×106cells/mL)接種于96 孔板中，37℃分別培養(yǎng)1、2和3 h，吸棄培養(yǎng)基，PBS洗去未黏附菌，加入上述各濃度藥液100 μL，設(shè)陰性對照孔(僅含菌液)，每組設(shè)8個復(fù)孔，37℃培養(yǎng)24 h［9］，XTT 法檢測 490 nm 的吸光度值(A 值)，重復(fù) 3次，取平均值。

4)不同濃度厚樸酚抗24 h白色念珠菌生物膜的測定:將100 μL濃度為1×106cells/mL的菌液加入96孔板第2～10孔，第11孔加入RPMI 1640培養(yǎng)液100 μL，37 ℃分別培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)基及浮菌，用PBS沖洗3次，第2～9孔加入上述各濃度藥液100 μL，每個濃度均設(shè)8個復(fù)孔，第10～11孔各加RPMI 1640培養(yǎng)液100 μL，第10孔為陰性對照孔、11孔為空白對照孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取XTT/PMS應(yīng)用液100 μL加到已形成生物膜的培養(yǎng)孔中，繼續(xù)37℃避光培養(yǎng)2 h［9］。在酶標(biāo)儀波長490 nm處檢測各孔吸光度(A值)。實驗重復(fù)3次，計算抑菌率。按以下公式計算抑制率:抑制率=(陰性對照孔A值-實驗組A值)/(陰性對照孔 A值-空白對照孔 A值)×100%［11］。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

全部數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件處理。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，并進行單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度厚樸酚抗白色念珠菌黏附作用

厚樸酚對白色念珠菌的黏附具有抑制作用，在同一時間點其作用具有濃度依賴性，125 mg/L及62.5 mg/L兩個濃度組其抑制作用具有時間依賴性，見表1及圖1。除2 h 7.8 mg/L濃度組，其余各實驗組與陰性對照組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 不同濃度厚樸酚對白色念珠菌生物被膜形成的影響

厚樸酚對白色念珠菌形成的生物膜具有抑制作用，其作用具有濃度依賴性，125 mg/L及62.5 mg/L兩個濃度組與陰性對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，詳見表2。

表1 不同濃度厚樸酚1、2、3 h對白色念珠菌黏附作用的抑制情況Tab.1 Different concentrations of magnolol inhibition effect on C.albicas adhesion (n=8)

圖1 不同濃度厚樸酚1、2、3 h對白色念珠菌黏附作用的抑制情況Fig.1 Different concentrations of magnolol inhibition effect on C.albicas adhesion(1 h，2 h，3 h)

表2 不同濃度厚樸酚對白色念珠菌生物被膜形成的抑制情況Tab.2 Different concentrations of magnolol inhibition effect on C.albicas biofilm formation (n=8)

3 討論

牙菌斑生物膜是齲病發(fā)生的始動因子，齲病在本質(zhì)上是菌群生態(tài)失衡性疾病。大多數(shù)微生物黏附在任何有生命或無生命的物體上，都是以生物膜的形式存在的。在牙菌斑中，變形鏈球菌、血鏈球菌、黏性放線菌、內(nèi)氏放線菌、乳酸桿菌均為口腔天然常駐菌，與齲病發(fā)生關(guān)系密切。但是在齲洞中也存在一定數(shù)量的真菌，其中白色念珠菌(C.albicas)占優(yōu)勢［2］。白色念珠菌是臨床最常見的條件致病真菌，調(diào)查結(jié)果顯示念珠菌感染占真菌感染的73.4% ，其中白色念珠菌感染最為常見［12］。生物膜的形成經(jīng)歷黏附、微菌落形成、微菌落融合、生物膜形成與生物膜成熟等階段，其中黏附是生物膜形成的第一步，至關(guān)重要，故抑制黏附是抗白色念珠菌生物膜感染的關(guān)鍵措施［13-15］。馮瑾等［16］研究發(fā)現(xiàn)厚樸酚對主要致齲的變異鏈球菌、血鏈球菌、內(nèi)氏放線菌、黏性放線菌及乳酸桿菌等5種細(xì)菌具有抑制作用，并能減少菌斑生物膜中致病菌的數(shù)量。但目前無厚樸酚針對菌斑中白色念珠菌作用的相關(guān)研究。本試驗采用微孔板法觀察不同濃度的厚樸酚對白色念珠菌黏附的影響，發(fā)現(xiàn)62.5 mg/L和125 mg/L厚樸酚可以顯著的抑制白色念珠菌的黏附，其抑制作用具有時間及濃度依賴性，與陰性對照組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。采用微孔板法復(fù)制體外生物膜模型，觀察不同濃度的厚樸酚對白色念珠菌生物膜的影響，發(fā)現(xiàn)實驗所選5個濃度的厚樸酚對白色念珠菌的生物膜均有不同程度的抑制作用，其中125 mg/L厚樸酚對其抑制率達(dá)到66.32%。黏附是白色念珠菌發(fā)揮致病性的一個重要因素，厚樸酚可有效抑制白色念珠菌的黏附，當(dāng)生物膜形成后，厚樸酚又能有效抑制生物膜形成。筆者推測厚樸酚可通過抑制白色念珠菌的黏附而有效降低其致病性，并對已形成的生物膜具有明顯的抑制作用，但厚樸酚抗白色念珠菌確切的作用機制還有待進一步研究。

綜上，厚樸酚能抑制白色念珠菌的黏附及生物膜的形成，提示其作為抗齲藥物有良好的應(yīng)用前景。

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