栗志民, 錢佳慧, 劉志剛, 劉錦上, 李艷紅

(廣東海洋大學 水產(chǎn)學院, 廣東 湛江 524025)

皺肋文蛤(Meretrix lyrata), 又名越南文蛤、琴文蛤,隸屬軟體動物門(Mollusca), 瓣鰓綱(Lamellibranchia),異齒亞綱(Heterodonta), 簾蛤目(Veneroida), 簾蛤科(Veneridae), 文蛤?qū)?Meretrix)。主要分布在中國臺灣、廣西和廣東, 以及越南和菲律賓[1], 是潮間帶中低潮區(qū)典型的埋棲型雙殼經(jīng)濟貝類。20世紀90年代后期中國從越南引進天然種苗進行養(yǎng)殖后, 在雷州半島沿海各地出現(xiàn)了小規(guī)模的自然種群。由于該貝適應(yīng)性強、養(yǎng)殖周期短、產(chǎn)量高、肉質(zhì)鮮美, 因此深受國內(nèi)外市場歡迎, 市場需求越來越大, 價格一路攀升, 依靠進口天然種苗養(yǎng)殖已經(jīng)不能滿足市場需要。近年來, 廣東海洋大學攻克種苗規(guī)?；a(chǎn)技術(shù)難關(guān), 已能夠生產(chǎn)出大量種苗供應(yīng)市場, 在雷州半島沿海初步實現(xiàn)了皺肋文蛤的規(guī)?；?。

國外學者先后研究了皺肋文蛤?qū)ξ⒘拷饘僭氐纳锔患蛢艋饔肹2]; 評估了其營養(yǎng)成分[3]; 調(diào)查了其在越南海域生存的環(huán)境因子、養(yǎng)殖生物學及群體動態(tài)分布模式[4-6]; 分析了自然條件與皺肋文蛤棲息場的形成和發(fā)展之間的關(guān)系[7]。國內(nèi)學者在皺肋文蛤的人工育苗[8]、養(yǎng)殖技術(shù)[9]、攝食生理[10]、呼吸生理[11], 以及對溫、鹽度的適應(yīng)性[12]等方面開展了研究, 但有關(guān)皺肋文蛤的早期胚胎發(fā)育過程, 以及幼蟲和稚貝的形態(tài)學特征和行為方式, 尚未見報道。作者在皺肋文蛤人工育苗過程中, 詳細觀察了其早期發(fā)育的形態(tài)學特征和行為方式, 旨在為皺肋文蛤的人工育苗和養(yǎng)殖提供理論指導, 以及為該貝胚胎、幼蟲和稚貝的質(zhì)量評價提供基礎(chǔ)研究資料。

1 材料和方法

1.1 材料

實驗于2013年6～7月在湛江市遂溪縣湛江銀浪海洋生物技術(shù)有限公司水產(chǎn)種苗場進行。皺肋文蛤親貝1～2齡, 采自湛江港北月村灘涂養(yǎng)殖區(qū), 平均殼長(51.54±1.63)mm、平均殼高(44.03±1.34)mm、平均殼寬(22.61±1.15)mm、平均個體鮮質(zhì)量(37.15±1.27)g。

1.2 方法

1.2.1 催產(chǎn)、孵化及幼蟲培育

皺肋文蛤在每年的 6～7月份進入繁殖盛期, 選取性腺飽滿的親貝, 將親貝置于室內(nèi)催產(chǎn)池(長7.0 m×寬3.5 m×高0.9 m)中, 采用陰干結(jié)合流水刺激催產(chǎn),一般30 min后雄貝開始排精, 緊接著雌貝產(chǎn)卵。卵子密度控制在4～5 個/mL, 催產(chǎn)、孵化和幼蟲培育均在原池中進行, D形幼蟲培育密度2個/mL。當幼蟲平衡囊明顯可見, 達到 30%時即倒池移入室外已鋪好附著基的池中, 池頂加蓋遮陽網(wǎng)。幼蟲附著期密度0.5 個/mL, 附著期一般2～3 d, 從受精卵至附著完畢約需9 d。附著后36 d左右, 稚貝殼長達到0.8～1.0 mm時即可出池。培育期間用石英砂作為變態(tài)幼蟲的附著基和稚貝的棲息底質(zhì)。

孵化期間保持微充氣, 水溫 28.5～30℃, 鹽度23.6～25.4, pH 8.1～8.2。幼蟲期的管理參考栗志民等[8]方法。前3 d通過加水方式改善育苗池水質(zhì), 開口餌料選擇湛江等邊金藻(Isochrysis zhanjianggensis), 投餌密度 5000 個/mL。3 d后開始換水, 每次換水20%～30%, 保持水質(zhì)新鮮, 換水網(wǎng)目隨幼蟲的生長做相應(yīng)調(diào)整, 換水溫差不超過2℃。每天7: 30和17: 00各投餌一次, 依幼蟲的攝食情況調(diào)整投餌密度, 一般保持湛江等邊金藻(1.5～2)×104個/mL, 牟氏角毛藻(0.4～0.8)×104個/ mL。每天測量水溫、鹽度, 以及幼蟲的密度、殼長和殼高。

1.2.2 胚胎、幼蟲及稚貝形態(tài)特征觀察與測量

胚胎、幼蟲和稚貝發(fā)育過程在光學顯微鏡下觀察, 并用數(shù)碼相機顯微攝影。胚胎期用目微尺測量其長徑和短徑, 并記錄發(fā)育期。幼蟲及稚貝期測量其殼長和殼高, 并記錄發(fā)育情況。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用平均值(M)±標準差(SD)表示, 用Excel軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 胚胎發(fā)育

皺肋文蛤成熟卵細胞呈圓球形, 胚泡已經(jīng)破裂,直徑(80±0.87)μm。受精后, 受精卵表面隆起極薄而透明的受精膜(圖版Ⅰ-1), 卵周隙約 8～10μm, 受精膜在后續(xù)的胚胎發(fā)育中逐漸膨脹, 最終在多細胞期破裂。在水溫28.5～30℃, 鹽度23.6～25.4條件下, 受精卵經(jīng)過20 min左右第一極體排出(圖版Ⅰ-2), 經(jīng)過30 min第二極體排出(圖版Ⅰ-3)。受精后50 min左右,卵進行第一次不等分裂, 分裂線與卵子動植軸平行偏于一側(cè), 縱裂成 2 個大小不等的分裂球, 即為 2細胞期, 二者之間的卵裂溝十分明顯(圖版Ⅰ-4)。第二次不等卵裂開始于受精后 1h 10 min 左右, 分裂面與第一次垂直, 與卵軸方向平行, 但在較大分裂球上的分裂線稍偏一邊, 形成一大三小的 4個卵裂球, 進入4細胞期(圖版Ⅰ-5)。受精后1h 50 min, 進行第三次卵裂, 分裂面位于赤道附近, 與卵的動植軸垂直, 每個分裂球上半部向右旋轉(zhuǎn), 分裂后分裂球繼續(xù)位移, 把上部4個分裂球移向頂端, 形成8細胞期(圖版Ⅰ-6)。約2h 30 min, 行第四次分裂, 分裂球旋轉(zhuǎn)方向與前一次相反, 即左旋分裂, 形成 16細胞期(圖版Ⅰ-7)。隨著細胞不斷分裂, 分裂球數(shù)量不斷增多, 而胚胎總體積并不增大, 分裂球體積越來越小, 受精4h后成為桑椹胚(圖版Ⅰ-8)。桑椹胚進一步發(fā)育, 約4h 30 min, 大分裂球逐漸陷入胚體之內(nèi),小分裂球包圍大分裂球, 形成一囊狀的結(jié)構(gòu), 此期為囊胚期, 囊胚的表面布有纖毛, 開始孵化游動(圖版Ⅰ-9)。由于外胚層小細胞下包, 以及大細胞內(nèi)陷,受精后5h, 發(fā)育形成一個具有兩胚層的原腸胚(圖版Ⅰ-10)。受精后7h 30 min, 胚體漸變梨形, 頂端膨大,細胞加厚, 長出一圈纖毛環(huán), 中央具有一叢纖毛, 為頂纖毛束, 早期幼蟲喜浮游水表面和明晰透亮的地方, 具有較強的游泳能力, 此期為擔輪幼蟲期(圖版Ⅰ-11)。皺肋文蛤早期胚胎發(fā)育時間和生長見表1。

2.2 幼蟲及稚貝發(fā)育

根據(jù)幼蟲和稚貝的規(guī)格、行為特征、足部發(fā)育狀況、平衡囊及鰓絲出現(xiàn)時間、面盤退化時間、足絲分泌階段、水管形成情況、殼色及其透明度等特征, 把皺肋文蛤幼蟲發(fā)育階段分為 D形幼蟲、殼頂初期幼蟲、殼頂中期幼蟲、殼頂后期幼蟲、變態(tài)期幼蟲、附著期幼蟲, 把稚貝階段劃分為無管期稚貝、單管期稚貝、雙管期稚貝(表 2)。依顯微觀察, 幼蟲和稚貝各個時期形態(tài)結(jié)構(gòu)特征如下。

表1 皺肋文蛤早期胚胎發(fā)育時間和生長Tab.1 Developmental time and growth of early embryo of Meretrix lyrata

(1) 直線鉸合幼蟲(D 形幼蟲): 受精后 16h, 胚體兩側(cè)覆蓋 2片較硬而透明的半圓形的幼蟲殼, 呈“D”形, 1 d 后, 幼蟲殼長(110.8±1.9)μm, 殼高(87.7±2.5)μm。兩殼在背部成直線鉸合, 胚體頂端呈橢圓盤狀, 形成運動器官面盤, 其四周細胞被有纖毛, 貝殼開殼依賴位于鉸合線下方的前后閉殼肌, 消化器官分化尚未完善, 胃和消化盲囊不發(fā)達(圖版Ⅰ-12)。

(2) 殼頂初期幼蟲: 3 d時, 幼蟲貝殼兩側(cè)靠近中央處稍稍隆起, 鉸合線成微弧形, 形成微隆起的幼蟲殼頂, 內(nèi)臟團下方出現(xiàn)圓球狀足原基。幼蟲消化盲囊較發(fā)達, 對食物的消化吸收能力大大增強, 消化盲囊顏色變深, 呈黃褐色(圖版Ⅰ-13)。

(3) 殼頂中期幼蟲: 殼頂微隆起, 變化不顯著,殼透明無色, 殼長較初期幼蟲, 生長明顯。足原基發(fā)育成靴狀足, 足基部出現(xiàn)1對中空的細胞團, 稱平衡囊, 中央包含1?；液稚?圖版Ⅰ-14)。

(4) 殼頂后期幼蟲: 殼頂微隆起, 變化仍不顯著。靴狀足延長為棒狀。平衡囊愈加顯著, 清晰可見, 耳石顆粒增大。在足的基部兩側(cè), 形成 1對成管狀的內(nèi)鰓絲。值得一提, 在皺肋文蛤幼蟲發(fā)育過程中沒有出現(xiàn)眼點, 幼蟲成熟的判斷依據(jù)為殼長及平衡囊(圖版Ⅰ-15)。

(5) 變態(tài)期幼蟲: 從 D 型幼蟲到變態(tài)期幼蟲約需6 d時間。此期幼蟲面盤逐漸萎縮, 浮游能力逐漸尚失, 最終下沉至底部, 在底部一邊依靠尚未脫落的面盤做間歇性游動, 一邊利用足在底部做匍匐運動。變態(tài)期幼蟲面盤上的纖毛逐漸脫離面盤, 最終使幼蟲失去游動能力, 完全進入底棲生活, 完成從浮游向底棲的變態(tài)(圖版Ⅰ-16)。

(6) 附著期幼蟲: 殼頂隆起變圓, 變化十分明顯。幼蟲進入底棲生活時, 幼蟲足部分泌黏狀足絲附著在沙粒上, 面盤消失。內(nèi)鰓絲逐漸增多, 開始用鰓呼吸, 靠鰓絲的擺動濾食水中食物顆粒。幼蟲殼色與前面各期均為透明無色(圖版Ⅰ-17)。

(7) 無管期稚貝: 貝殼外觀卵圓形。稚貝的胚殼與次生殼的銜接處平滑, 無明顯的交界, 兩者透明度相同, 但殼色在次生殼部分為紅褐色。從胚殼到次生殼, 殼面生長線明顯且隆起。水管尚未形成, 靠進出水孔進行攝食與排泄(圖版Ⅰ-18)。

(8) 單管期稚貝: 殼頂逐漸隆起變尖。在殼背后方長出出水管, 管口缺乏觸手。此期稚貝肉眼明顯可見, 外觀呈紅褐色, 育苗生產(chǎn)上把此期稱為“紅殼期”(圖版Ⅰ-19)。

表2 皺肋文蛤幼蟲和稚貝的形態(tài)特征和行為方式Tab.2 The morphological character and behavioral manner of larvae and spat of Meretrix lyrata

(9) 雙管期稚貝: 稚貝在殼后腹方長出進水管,長度短于出水管, 管口環(huán)繞觸手。此期稚貝貝殼邊緣殼色變白而不透明, 育苗生產(chǎn)上把此期稱為“白殼期”(圖版Ⅰ-20)。此期稚貝各器官已發(fā)育完善, 外部形態(tài)與成體基本相同, 但殼頂仍呈紅褐色, 不同于成體的殼頂。育苗生產(chǎn)早期培育結(jié)束, 可進入種苗中間培育階段。

2.3 皺肋文蛤胚胎、幼蟲和稚貝的生長

如表 1所示, 皺肋文蛤胚胎發(fā)育階段從受精卵開始直至擔輪幼蟲, 該貝類受精卵大小為(80×80)μm,隨著胚胎不斷發(fā)育, 細胞數(shù)目迅速增多, 約 5h胚胎進入原腸期, 其胚胎大小為(90×90)μm, 受精后 7h 30 min, 胚體發(fā)育至擔輪幼蟲期, 其胚胎大小為(110×75)μm。如圖 1所示, 從 D形幼蟲期開始直至附著期幼蟲, 該階段幼蟲體積出現(xiàn)較大幅度增長, D形幼蟲規(guī)格(110.8×87.7)μm, 達附著期幼蟲時, 規(guī)格為(196×184)μm。幼蟲期殼形變化也較明顯, D形幼蟲期鉸合部呈直線鉸合, 附著期幼蟲殼頂明顯, 隆起變圓。而殼顏色仍保持透明無色。變態(tài)完成的稚貝進入埋期生活, 稚貝階段包括無管期稚貝、單管期稚貝和雙管期稚貝, 殼體積變化明顯, 其中, 無管期稚貝(280.5×262)μm, 而雙管期稚貝(877.5×860.5)μm。殼形由隆起變圓向隆起變尖過渡, 而且該階段長出了明顯的出、入水管。

圖1 皺肋文蛤幼蟲和稚貝的生長Fig.1 The growth of larvae and spat of Meretrix lyrata

如圖 2所示, 皺肋文蛤從 D形幼蟲到雙管期稚貝的發(fā)育過程中, 殼長/殼高呈現(xiàn)先快速下降再緩慢下降的趨勢。其中, 從D形幼蟲到附著期幼蟲, 殼長/殼高迅速下降, 而從附著期幼蟲, 經(jīng)無管期稚貝、單管期稚貝到雙管期稚貝, 殼長/殼高呈緩慢下降趨勢。

3 討論

3.1 皺肋文蛤早期發(fā)育的分期

作者依據(jù)皺肋文蛤的早期發(fā)育狀況, 將其早期發(fā)育分為胚胎發(fā)育階段、幼蟲發(fā)育階段和稚貝發(fā)育階段, 其中胚胎發(fā)育階段從受精卵開始至擔輪幼蟲分8期, 即受精卵、第一極體、第二極體、卵裂期、桑椹期、囊胚期、原腸胚期、擔輪幼蟲期。依據(jù)幼蟲的行為方式、殼頂形狀、面盤和足將幼蟲發(fā)育階段分為 6期, 即 D形幼蟲、殼頂初期幼蟲、殼頂中期幼蟲、殼頂后期幼蟲、變態(tài)期幼蟲和附著期幼蟲。依據(jù)水管的有無和發(fā)育狀況將稚貝發(fā)育階段分為 3期, 即無管期稚貝、單管期稚貝和雙管期稚貝。

3.2 皺肋文蛤胚胎發(fā)育

圖版Ⅰ 皺肋文蛤胚胎、幼蟲及稚貝發(fā)育過程的光鏡觀察PlateⅠ Microscopic observation on the development of embryo, larvae and spat of Meretrix lyrata

圖2 皺肋文蛤幼蟲和稚貝的殼長與殼高的比值Fig.2 The ratio of shell length and shell height for larvae and spat of Meretrix lyrata

皺肋文蛤雌雄異體, 一般1齡性成熟, 成熟性腺分布在內(nèi)臟團周圍, 并延伸至足基部。雌性性腺呈乳白色, 雄性性腺呈淺黃色。精子屬于鞭毛型, 成熟卵子充滿大量卵黃, 正圓形, 呈現(xiàn)均黃卵和沉性卵特性。皺肋文蛤?qū)袤w外受精, 精子入卵的部位是隨機的,可以從卵的任意部位入卵, 這與櫛孔扇貝[13]、太平洋牡蠣[14]、泥蚶[15]菲律賓蛤仔[16]等貝類相似。皺肋文蛤精子和卵子在水中結(jié)合完成受精, 受精卵大小均勻, 卵徑80μm。受精后50 min左右, 受精卵進行分裂, 卵裂方式為完全不等分裂, 第一次分裂為縱裂,分裂線與卵子動植軸平行偏于一側(cè), 縱裂成 2 個大小不等的分裂球, 即為2細胞期, 二者之間的卵裂溝十分明顯。第二次卵裂與第一次卵裂過程基本相同,也是縱裂, 不過與第一次卵裂方向垂直。在第一次和第二次分裂前均無極葉形成, 這與厚殼貽貝[17]、渤海鴨嘴蛤[18]、大獺蛤[19]胚胎發(fā)育不同, 與文蛤[20]、中國蛤蜊[21]和縊蟶[22]相同。受精后1h 50 min, 進行第三次卵裂, 仍為不等全裂, 但此后開始進行螺旋分裂, 左旋分裂和右旋分裂交替進行。

3.3 皺肋文蛤幼蟲和稚貝發(fā)育

海洋軟體動物主要有 3種幼蟲發(fā)育形式[23-24]:一是浮游異養(yǎng)型, 幼蟲主要以浮游植物為食; 二是卵黃營養(yǎng)型, 幼蟲以自身的卵黃為營養(yǎng), 極少數(shù)甚至不依賴浮游生物; 三是直接發(fā)育型, 整個胚胎和幼蟲發(fā)育過程在卵殼內(nèi)進行, 不經(jīng)歷浮游階段而直接進入成年底棲生活。皺肋文蛤在發(fā)育過程中經(jīng)歷擔輪幼蟲期和面盤幼蟲期, 屬間接發(fā)育, 幼蟲階段營養(yǎng)來源依賴浮游植物, 因此, 皺肋文蛤幼蟲發(fā)育形式屬浮游異養(yǎng)型。

雙殼貝類幼蟲從殼頂后期進入變態(tài)附著時, 其外部形態(tài)、內(nèi)部構(gòu)造、生理機能和生態(tài)習性等方面發(fā)生較大的變化。皺肋文蛤殼頂后期進入變態(tài)附著時, 行為方式從浮游生活轉(zhuǎn)變?yōu)槎虝旱馁橘肷?最后附著生活。殼頂由微隆起逐漸變圓, 面盤逐漸脫落, 開始以棒狀足作為運動器官。鰓絲逐漸增多, 出現(xiàn)明顯的平衡囊, 消化系統(tǒng)逐漸完善, 攝食能力增強。許多雙殼貝類, 如牡蠣、扇貝、珍珠貝等[25]在結(jié)束浮游生活即將進入變態(tài)附著時, 可以看到在鰓原基的背部形成 1對球形的由黑色素聚集起來的感覺器官, 稱為眼點。因眼點是貝類幼蟲即將附著變態(tài)時顯而易見的特征, 所以一般以眼點的出現(xiàn)作為幼蟲附著變態(tài)的標志。但對皺肋文蛤幼蟲附著變態(tài)階段的觀察結(jié)果表明, 該貝在幼蟲附著變態(tài)時并未出現(xiàn)眼點, 進一步證實了作者此前的結(jié)論[8]。雙殼貝類在附著變態(tài)階段沒有眼點的現(xiàn)象也出現(xiàn)在施氏獺蛤[26]中。皺肋文蛤幼蟲附著變態(tài)過程中雖然沒有眼點出現(xiàn), 但有明顯的平衡囊, 在光鏡下可清晰地看到平衡囊呈透明的同心圓狀, 位于足的基部, 其可作為皺肋文蛤幼蟲附著變態(tài)的標志。

皺肋文蛤在擔輪幼蟲初期發(fā)育階段, 胚體背部后半段細胞加厚并逐漸陷入, 成為殼腺。以后殼腺分泌出2片透明而柔軟的薄膜, 緊貼胚體的兩側(cè), 背部鉸合, 腹部開啟, 薄膜鈣化后形成兩片且半透明的貝殼, 此殼稱為胚殼或初生殼。隨著皺肋文蛤幼蟲的繼續(xù)發(fā)育, 外套膜逐漸形成, 在附著變態(tài)期之后, 在胚殼的基礎(chǔ)上, 外套膜開始分泌形成新的貝殼, 該種貝殼稱為次生殼。皺肋文蛤次生殼的形成, 標志著該貝類已發(fā)育到稚貝期。無管期稚貝的殼色在次生殼部分為紅褐色, 殼面生長線明顯且隆起。當稚貝殼長達到近 600μm 時, 在殼后背方長出出水管, 管口缺乏觸手, 稱為單管期稚貝。該期稚貝殼頂逐漸隆起變尖, 外觀呈紅褐色, 育苗生產(chǎn)上把此期稱為“紅殼期”。隨著稚貝在殼后腹方長出進水管, 管口環(huán)繞觸手, 標志雙管期稚貝的形成, 此期稚貝貝殼邊緣殼色變白而不透明, 育苗生產(chǎn)上把此期稱為“白殼期”。此期稚貝器官和外部形態(tài)已接近成體。

3.4 皺肋文蛤早期發(fā)育階段的生長規(guī)律

皺肋文蛤胚胎發(fā)育階段從受精卵開始直至原腸胚, 雖然隨著細胞不斷分裂使細胞數(shù)目迅速增多,但胚胎體積變化較小。自受精卵經(jīng)卵裂, 孵化至擔輪幼蟲, 胚體長徑僅增到原有長度的 1.38倍。幼蟲階段從擔輪幼蟲開始直至附著期幼蟲, 盡管 D形幼蟲之后, 幼蟲的消化道已經(jīng)形成并開始攝食, 但由于攝食和消化等內(nèi)部器官發(fā)育并不完善, 攝食量較小,導致幼蟲階段皺肋文蛤生長依然緩慢。從D形幼蟲經(jīng)殼頂初期幼蟲、殼頂中期幼蟲和殼頂后期幼蟲變態(tài)發(fā)育到附著期幼蟲, 其殼長和殼高分別增加到原有殼長和殼高的1.77倍和2.10倍(表1和表2)。皺肋文蛤稚貝階段從無管期稚貝至雙管期稚貝, 該階段稚貝內(nèi)部器官發(fā)育完善, 攝食量增加, 稚貝生長速度明顯加快, 自無管期稚貝經(jīng)單管期稚貝發(fā)育到雙管期稚貝, 稚貝殼長和殼高分別增加到原有殼長和殼高的3.13倍和3.28倍。由此可見, 皺肋文蛤早期發(fā)育階段呈現(xiàn)胚胎和幼蟲階段緩慢生長, 稚貝階段快速生長的規(guī)律。

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