董 鑫, 邢 坤, 隋宥珍, 劉海映

(大連海洋大學 海洋科技與環(huán)境學院, 大連 116023)

口蝦蛄(Oratosqilla oratoria)隸屬節(jié)肢動物門(Arthropoda)、甲殼動物亞門(Crustacea)、軟甲綱(Malacostraca)、口足目(Stomatopoda)、蝦蛄科(Squilidae)、口蝦蛄屬(Oratosquilla)[1], 俗稱蝦爬子、螳螂蝦、蝦虎等, 具有很高的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值, 是中國沿海地區(qū)重要的經(jīng)濟蝦類之一。近年來, 人們對海鮮食品的需求不斷增加, 因而加速了人們對海洋經(jīng)濟生物的索取力度, 口蝦蛄作為中國近海捕撈的優(yōu)勢種[2],其資源量隨著捕撈壓力的增大而逐步減小[3], 加之生態(tài)環(huán)境的不斷惡化, 野生口蝦蛄資源受到嚴重威脅, 所以亟需對口蝦蛄的種質資源現(xiàn)狀進行研究。

目前對口蝦蛄的研究多集中在形態(tài)學[4]、生物學特征[5], 生理生態(tài)[6]和人工育苗[7]等方面, 關于從分子水平上研究其種群遺傳多樣性的報道也日漸增多,Zhang等[8]用 11個微衛(wèi)星標記初步分析了葫蘆島、青島、煙臺3個海域口蝦群體的遺傳多樣性狀況, 得到觀測等位基因數(shù)為2～11個不等, 遺傳多樣性水平較高。張代臻[9-13]等用細胞色素 C氧化酶亞基I(mtDNACOI)標記的方法研究了黃海海域、渤海海域和粵東海域口蝦蛄的遺傳多樣性和遺傳結構, 結果顯示黃海海域口蝦蛄的單倍型多樣性和核苷酸多樣性水平均高于渤海海域而低于粵東海域。目前尚未見應用線粒體COI標記的方法對包括南北方海域的口蝦蛄野生種質資源現(xiàn)狀進行綜合詳細報道。

線粒體DNA(mitochondrial DNA, 簡稱mtDNA)相對于核DNA具有結構簡單、母系遺傳、進化速率快、幾乎不發(fā)生重組、富含系統(tǒng)發(fā)育信號等特點, 是作為種屬進化研究的良好標記[14]。其中,COI是目前應用最多、結構和進化動力學研究比較清楚的基因之一, 且其能被通用引物所擴增, 所以被廣泛應用于動物近緣種間的系統(tǒng)進化研究。本研究對分布于皮口、綏中、青島、廣州 4個海域口蝦蛄群體的遺傳多樣性和遺傳結構進行研究, 以期為口蝦蛄野生種質資源的合理開發(fā)和保護提供分子生物學依據(jù), 并為口蝦蛄在COI方面的研究積累更多可利用數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗材料是2011年～2013年采集于皮口、綏中、青島、廣州 4個海域的口蝦蛄樣本, 共計 100只(表1)。樣本活體運回實驗室后, 置于–80℃冰箱中冷凍備用。

表1 口蝦蛄樣本采集信息Tab. 1 Oratosqilla oratoria sampling information

1.2 DNA的提取、擴增及測序

用已滅菌的剪刀取口蝦蛄背部肌肉組織, 置于加入液氮的研缽中充分研磨, 用購于上海生工的Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒提取, DNA溶解于 TE溶液中, 瓊脂糖凝膠電泳檢驗其純度后–20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

COI擴增所用引物為通用引物, 引物序列:LCO1490: 5′-GGTCAAATCATAAAGATATTGG-3′和HCO2198: 5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′。PCR 反應的總體積為 25 μL, 其中 10×Buffer2.5 μL、Taq DNA polymerase(5 U/μL)0.2 μL、dNTPs(各 2.5 mmol/L)2 μL、上下游引物(10 μmol/L)各 1 μL、DNA 模板 1 μL、ddH2O 補足體積。在Eppendorf PCR儀上進行擴增, 反應程序均為94℃預變性5 min; 94℃變性30s, 50℃退火30 s, 72℃延伸90 s, 32個循環(huán); 72℃最后延伸10 min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)過1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后, 利用凝膠成像系統(tǒng)進行拍照和比較, 挑選較好的 PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司進行雙向測序, 測序儀為XL3730基因分析儀。

1.3 外群的選擇及序列分析

鬼蝦蛄(Squilla empusa)在分類學上與口蝦蛄關系密切, 因此本研究選擇鬼蝦蛄作為外群分析口蝦蛄野生群體的親緣關系[15]。

用 ClustalX 1.83[16]對所測序列進行比對并人工校對。采用Mega4.0[17]軟件統(tǒng)計序列的堿基組成、變異位點、簡約信息位點、轉換和顛換的比率和不同群體間的遺傳距離, 并以鄰接法[18](Neighbor-Joining,NJ)基于 Kimura雙參數(shù)(Kimura 2-parameter)模型構建群體和單倍型的系統(tǒng)發(fā)育樹(以 Bootstrap法[19]1000次重復來檢驗系統(tǒng)樹各分支的置信度)。用DnaSp5.1軟件[20]計算群體的單倍型數(shù), 單倍型多態(tài)性(Hd), 核苷酸多樣性指數(shù)(π)及平均核苷酸差異數(shù)(K)等。應用 Arlequin3.5軟件中的分子方差分析(AMOVA)估算遺傳變異的分布和遺傳分化系數(shù)(F-statistics,Fst)[21]。用軟件TCS1.21[22]來分析單倍型的進化網(wǎng)絡關系。

2 結果與分析

2.1 COI序列特征及遺傳多樣性分析

本研究采用的是無脊椎動物通用引物, 對 4個海域口蝦蛄COI進行PCR擴增和測序, 共得到100個樣本的COI序列, 經(jīng) ClustalX 比對后, 去除引物及序列起始的部分序列, 與 GenBank上下載的口蝦蛄的同源COI基因序列進行MEGA比對后, 確認得到 585bp的序列。 4個群體的堿基組成基本一致,COI基因序列的A、G、C、T平均含量分別為28.2%、17.6%、17.6%、36.6%, A+T含量(64.8%)顯著高于G+T含量(35.2%)4個群體口蝦蛄所有序列中共存在簡約信息位點54個。轉換與顛換的平均比值是7.84,轉換高于顛換。

所有樣本共定義 35個單倍型, 分別命名為Hap1～Hap35(表2)。在皮口、綏中、青島和廣州共檢測到的單倍型數(shù)分別為14個、17個、16個和11個。其中5個單倍型涵蓋的樣本數(shù)最多, 分別為Hap1、Hap2、Hap7、Hap8和Hap16。被共享個體數(shù)最多的是Hap2, 為皮口, 青島, 綏中3個海域的26個樣本所共享。被兩個以上種群共享的單倍型有16個, 被3個以上種群共享的單倍型有7個, 即Hap1、Hap2、Hap6、Hap7、Hap8、Hap16、Hap20。4個群體的單倍型及遺傳多樣性系數(shù)見表3。4個群體的整體單倍型多樣性和平均核苷酸多樣性值是0.9162和0.0203。單倍型多樣性最高的為廣州群體(Hd=0.9338), 最低為皮口群體(Hd=0.8783)。核苷酸多樣性以廣州群體最高(π=0.0049), 以皮口群體最低(π=0.0032)。4個海域中廣州群體的遺傳多樣性最高, 明顯高于其他3個海域。

表2 口蝦蛄COI序列的核苷酸變異位點及各單倍型的分布Tab. 2 Distribution of nucleotide variation sites and haplotypes in COI sequences of O.oraotoria

表3 基于COI基因序列得出的4個口蝦蛄群體遺傳多樣性參數(shù)Tab. 3 Parameters of genetic diversity in 4 O.oratoria populations based on COI sequences

2.2 群體遺傳結構分析

利用COI序列比較4個海域口蝦蛄種群的遺傳分化, 由 Arlequin3.5軟件的 AMOVA計算表明, 來自于群體間的遺傳差異(84.53%)明顯高于來自群體內的差異(15.47%)(表 4)。遺傳分化系數(shù)(Fst)在廣州與皮口群體間最高(Fst=0.9358)(表5)。皮口、綏中、青島3個群體的Fst值均為負值, 表明3個群體間幾乎沒有發(fā)生遺傳分化, 存在高度的遺傳同質性; 而廣州與皮口、綏中、青島3個群體間的Fst值(0.9287～0.9358)均較高, 說明廣州群體與其他 3個群體間的遺傳分化很大。

表4 4個口蝦蛄群體線粒體COI變異區(qū)序列的AMOVA結果Tab. 4 The result of AMOVA based on COI gene of mtDNA in 4 O.oratoria populations

表5 4個口蝦蛄群體間的平均遺傳距離和Fst值Tab. 5 Mean distance between 4 O.oratoria populations and Fst

采用MEGE4.0 軟件根據(jù)Kimura 雙參數(shù)模型計算各群體間的遺傳距離, 由表5可知, 皮口和綏中群體的遺傳距離最近, 為 0.00357; 廣州和綏中群體的遺傳距離最遠, 為 0.04574。廣州與皮口、青島、綏中 3個群體間的遺傳距離均較遠(0.04567～0.04574),皮口、青島、綏中群體間的遺傳距離很近(0.00357～0.00370)。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育和嵌套分析

從GenBank下載19條粵東海域(汕尾和深圳)的口蝦蛄COI序列和鬼蝦蛄的COI序列, 與本研究所檢測的100條口蝦蛄樣本的COI同源基因序列構建群體的 NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(圖 1), 整體分析系統(tǒng)進化關系。由圖1可知, 進化樹主要分為3個分支: 皮口、綏中、青島 3個海域口蝦蛄群體遺傳距離較近首先聚為一個小支, 與廣州和粵東(汕尾和深圳)海域口蝦蛄群體相聚的小支聚為一個大支, 最后才與外群鬼蝦蛄群體聚在一起。從構建的單倍型NJ系統(tǒng)進化樹可以看出(圖2), 綏中、青島、皮口3個海域的口蝦蛄的所有個體以嵌套的方式聚集在一起, 沒有形成明顯的地理格局, 廣州群體特有的單倍型形成單獨的分支。

基于單倍型的進化網(wǎng)絡關系圖(圖 3)(圓代表單倍型, 斜線代表演變事件, 小圓點代表未檢測到的單倍型)可知, 廣州群體特有單倍型形成的進化網(wǎng)絡關系圖獨立于皮口、綏中和青島單倍型形成的進化網(wǎng)絡圖之外, 形成了明顯的地理譜系結構, 廣州單倍型與其他3個群體單倍型遺傳分化明顯。

圖1 基于COI基因序列構建的NJ系統(tǒng)進化樹Fig. 1 Neighbor-joining tree based on COI gene sequences

圖2 35個口蝦蛄單倍型的NJ系統(tǒng)進化樹Fig. 2 Neighbor-joining tree of 35 O.oratoria haplotypes

圖3 口蝦蛄群體所有單倍型進化網(wǎng)絡關系圖Fig. 3 Haplotype network from all haplotypes based on COI sequence of O.oratoria

圖3顯示, 在皮口、綏中和青島單倍型形成的進化網(wǎng)絡關系圖中, Hap2是最主要最原始的單倍型,Hap1、Hap8、Hap9、Hap16、Hap21、Hap23和 Hap24是由其直接拓展而出, 呈星狀輻射分布, 其他單倍型由以上 7個單倍型間接拓展出來, 其中由 Hap16拓展出的單倍型數(shù)最多, 皮口、綏中和青島單倍型沒有明顯的分化, 24個單倍型以相互交錯的形式聚合在一起。在廣州特有單倍型形成的進化網(wǎng)絡關系圖中, Hap31是最原始的單倍型, Hap26、Hap29和Hap34以一步突變與其連接在一起, 其他單倍型從以上3個單倍型間接拓展出來, 其中Hap26、Hap27、Hap30和Hap33聚合成一組, 顯示出較近的親緣關系。

3 討論與結論

本實驗所研究的口蝦蛄100條COI同源序列中,A、G、C、T的平均含量為28.2%、17.6%、17.6%、36.6%, 這與江蘇連云港與鹽城海域(A=27.6%、G=17.7%、C=17.6%、T=37.1%)[10]、粵東海域(A=27.1%、G=18.9%、C=17.6%、T=36.4%)[13]、渤海灣葫蘆島海域(A=27.8%、G=17.9%、C=17.6%、T=36.8%)[11]、黃海海域(A=27.5%、G=17.8%、C=17.6%、T=37.1%)[9]所研究的口蝦蛄平均堿基組成相當, 說明口蝦蛄COI序列具有相似的組成特點。A+T含量(64.8%)明顯高于G+C含量(35.2%), 該結果與許多研究者在農(nóng)田金龜子、蝦類、蟹類等COI中觀察到的結果相似[23-25],AT含量高是節(jié)肢動物線粒體DNA堿基組成中普遍存在的現(xiàn)象。本研究中, 轉換與顛換的平均比值是7.84, 轉換高于顛換, 說明4個群體中口蝦蛄COI序列替換未達到飽和。一般在 mtDNA序列的變異中,轉換較易在近親種間頻繁發(fā)生, 而顛換則發(fā)生在遠緣種間, 在同物種內部, 轉換高于顛換[26]。

遺傳多樣性參數(shù)是衡量群體遺傳多樣性程度的重要指標之一。根據(jù)線粒體基因序列的單倍型多樣性(Hd)和核苷酸多樣性(π), 將海洋生物的遺傳多樣性分為 4種類型: 低Hd(<0.5)和低π(<0.5%), 高Hd(>0.5)和低π(<0.5%), 低Hd(<0.5)和高π(>0.5%),高Hd(>0.5)和高π(>0.5%)[27]。本研究中 4個群體的遺傳多樣性均表現(xiàn)出高的單倍型多樣性和低的核苷酸多樣性的特點, 因此屬于第二種類型, 說明4個海域口蝦蛄群體的遺傳多樣性均處于中等水平。廣州海域口蝦蛄群體的單倍型多樣性和核苷酸多樣性均為最高, 可知廣州海域口蝦蛄的遺傳多樣性最高。近年來, 雖然中國近海口蝦蛄的捕撈量有所下降, 但其現(xiàn)存資源量仍很高[28], 因此, 盡管口蝦蛄資源處于過度捕撈的狀態(tài), 然而大的資源量仍維持了口蝦蛄中等水平的遺傳多樣性。群體這種高的單倍型多樣性和低的核苷酸多樣性的特點, 表明物種經(jīng)歷了一個由較小的有效種群在近期快速增長為一個大的種群的過程[27]。本研究中的 4個口蝦蛄群體的平均核苷酸多樣性(π=0.0203)明顯高于粵東海域[13](π=0.00755)、渤海灣[12](π=0.00485)和黃海海域[9](π=0.00512)的口蝦蛄群體, 整體單倍型多樣性與以上海域研究結果相當, 是由于本研究中的口蝦蛄樣本來自中國的黃海(皮口和青島)、渤海(綏中)和南海(廣州)3大海域, 取樣范圍較以往研究都大, 因此口蝦蛄的核苷酸多態(tài)性高。

遺傳距離是評價種群遺傳變異差異水平的另一重要指標。根據(jù)MEGA4.0計算的遺傳距離分析, 皮口和綏中海域口蝦蛄的遺傳距離最近(0.00357), 廣州和綏中海域口蝦蛄的遺傳距離最遠(0.04574)。研究認為, 遺傳距離在 0.01以上的, 表示群體的遺傳變異較大[29], 廣州與其他 3個群體間的遺傳差異值均顯著大于 0.01, 反映了廣州群體較大的遺傳變異水平, 這可能是由于廣州口蝦蛄棲息地保護較好,沒有遭到人為破壞, 種群發(fā)展比較穩(wěn)定, 積累的變異較多, 因此遺傳變異水平較高; 皮口、綏中、青島群體間的遺傳距離均小于0.01, 表明3個群體的遺傳差異較小, 3個海域口蝦蛄之間有著頻繁的基因交流,這可能是由于口蝦蛄為廣溫、廣鹽性生態(tài)類群, 其生活水溫為 6～31℃, 適鹽范圍為 12～35, 其生存空間范圍大, 可以在棲息地漁場及鄰近大部分海域移動生存[28]。

群體的NJ進化樹顯示, 皮口、綏中和青島3個群體聚為一支, 廣州與粵東(深圳和汕尾)群體聚為另一支。5個群體的系統(tǒng)發(fā)育關系在一定程度上是由群體的地理位置分布情況決定的, 廣州在地理位置上與粵東的深圳和汕尾相近, 而與皮口、綏中、青島3個海域相距甚遠, 這與本實驗構建的 NJ進化樹結果相一致, 展現(xiàn)了廣州群體與其他 3個群體間較遠的親緣關系。從單倍型進化樹上也可以看出皮口、綏中和青島 3個群體的單倍型嵌套聚集形成一支,沒有形成明顯的地理分化格局, 而廣州群體特有單倍型獨立形成另一支, 說明廣州群體與其他 3個群體間具有顯著的遺傳分化?？谖r蛄群體所有單倍型形成的進化網(wǎng)絡關系圖也顯示出廣州群體與皮口、綏中和青島3個海域的口蝦蛄群體間大的遺傳分化,結果與單倍型的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹一致。

在線粒體基因組序列中, 受選擇壓力的不同而導致各個區(qū)域進化速率的不同。如 D-Loop 由于不編碼蛋白質受到的選擇壓力少, 所以進化速度較快,比較適用于群體遺傳學及近緣種間的分析研究[30]。16S rRNA、12S rRNA及CO氧化酶亞單位等適用于種屬間至科級以下分類階元的探討[31-32]。COI與Cytb進化速率適中, 適合種群水平差異的研究[33]。

基于對口蝦蛄線粒體COI序列的檢測, 了解口蝦蛄的遺傳多樣性后, 有助于對其野生資源制定具體的科學的保護措施。本研究獲得的遺傳多樣性較好的廣州種群, 遺傳多樣性相對較低的皮口、綏中和青島種群, 為以后口蝦蛄的科學育苗、野生種質資源保護和合理開發(fā)利用提供了新的依據(jù)。作者測定的口蝦蛄COI序列豐富了GenBank報道的同種同源序列, 提供了更多可供研究的基因片段。今后, 可再進行COI作為DNA條形碼對蝦蛄科進行物種識別的可行性的探討[34]。

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