田會(huì)芹, 李 賢, 傅松哲, 任 香, 王順奎, 王先平, 宋協(xié)法, 劉 鷹

(1. 中國(guó)海洋大學(xué), 山東 青島 266100; 2. 中國(guó)科學(xué)院海洋研究所, 山東 青島 266071; 3. 南昌市疾病預(yù)防控制中心, 江西 南昌 330038; 4. 山東東方海洋科技股份有限公司, 山東 煙臺(tái) 264003)

殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonicha)屬于Aeromonadacea科、氣單胞菌屬(Aeromonas)。它分布范圍廣, 能引起鮭鱒魚類患癤瘡病[1]。同時(shí)它也是一些其他水生動(dòng)物疾病的原發(fā)性病原菌, 可感染大菱鲆[2]、石鰈[3]、刺參[4]等。近幾年, 隨著中國(guó)鮭鱒魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的不斷擴(kuò)大, 殺鮭氣單胞菌引起的病害問題隨之出現(xiàn)。2007年10月至2008年3月在成都市都江堰虹口深溪溝通威大西洋鮭流水養(yǎng)殖廠發(fā)生了大規(guī)模大西洋鮭體表皮膚肌肉潰瘍病, 對(duì)養(yǎng)殖業(yè)者造成了嚴(yán)重?fù)p失[5]。山東東方海洋科技股份有限公司工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖的大西洋鮭也出現(xiàn)了不同程度的病害情況, 并從病魚體內(nèi)分離得到了殺鮭氣單胞菌。為降低該菌對(duì)鮭鱒魚類的危害, 有必要對(duì)其生長(zhǎng)特性進(jìn)行研究, 但目前相關(guān)研究尚未見報(bào)道[6-7]。作者選擇從養(yǎng)殖生產(chǎn)系統(tǒng)分離出的殺鮭氣單胞菌菌株,進(jìn)行了不同溫度及pH條件下的生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)研究, 繪制了不同條件下殺鮭氣單胞菌的生長(zhǎng)曲線, 闡明了溫度及pH對(duì)其生長(zhǎng)的影響, 為在養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中通過調(diào)控水體溫度及pH等環(huán)境因子, 抑制殺鮭氣單胞菌生長(zhǎng), 降低養(yǎng)殖魚類發(fā)病率提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonicha), 從山東東方海洋科技股份有限公司養(yǎng)殖的大西洋鮭患病個(gè)體分離得到, 保藏于中國(guó)科學(xué)院海洋研究所實(shí)驗(yàn)室,保藏編號(hào)是CGMCC No. 7335。

1.2 培養(yǎng)基制備

(1) LB液體培養(yǎng)基: 蛋白胨 10 g, 酵母粉 5 g,氯化鈉10 g, 蒸餾水1 L, 121 ℃, 15 min滅菌。

(2) 2216E瓊脂: 青島海博生物技術(shù)有限公司生產(chǎn), 按配制說明配制。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 殺鮭氣單胞菌的活化培養(yǎng)

將保藏的殺鮭氣單胞菌接種于 2216E瓊脂平板上, 28℃恒溫培養(yǎng), 長(zhǎng)出菌落后, 將單菌落接種于100 mL滅菌LB液體培養(yǎng)基中180 r/min、28 ℃恒溫培養(yǎng)18 h作為種子液。

1.3.2 不同溫度下殺鮭氣單胞菌生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)

取1.3.1中所述種子液, 按5%接種量接種于300 mL無(wú)菌LB液體培養(yǎng)基中, 充分搖勻后分裝成3份, 于28 ℃下靜置培養(yǎng), 每隔2 h取樣, 以無(wú)菌LB液體培養(yǎng)基作對(duì)照, 用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)菌液A600值, 同時(shí)另取菌液進(jìn)行梯度稀釋, 于 2216E瓊脂平板涂布計(jì)數(shù), 統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù), 繪制其在該溫度下的生長(zhǎng)曲線。其他溫度(15、10、5℃)梯度條件下實(shí)驗(yàn)方法類同。

1.3.3 不同pH條件下殺鮭氣單胞菌生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)

取5瓶200 mL滅菌LB液體培養(yǎng)基, 無(wú)菌操作,用1.0 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0, 以 5%接種量各接入相同濃度的種子液(同1.3.1), 混勻后分裝到已滅菌的試管中, 每支 10 mL,做好標(biāo)記, 置于180 r/min、28 ℃恒溫培養(yǎng), 每隔2 h取出對(duì)應(yīng)的試管, 測(cè)定菌液A600, 并在實(shí)驗(yàn)過程中定時(shí)檢測(cè)菌液pH值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)實(shí)驗(yàn)測(cè)得的A600值及平板計(jì)數(shù)得到的細(xì)菌對(duì)數(shù)值, 繪制不同溫度及pH條件下殺鮭氣單胞菌生長(zhǎng)曲線。用SPSS18.0軟件對(duì)不同溫度或pH值條件下培養(yǎng)相同時(shí)間的細(xì)菌數(shù)進(jìn)行單因素方差分析(Oneway ANOVA), 比較不同溫度或pH條件對(duì)該菌生長(zhǎng)的影響差異。

2 結(jié)果

2.1 不同溫度下殺鮭氣單胞菌的生長(zhǎng)曲線

本實(shí)驗(yàn)采用了A值法與平板計(jì)數(shù)法相結(jié)合的方式, 對(duì)殺鮭氣單胞菌生長(zhǎng)曲線進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示,在細(xì)菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期, 兩種方法測(cè)得的生長(zhǎng)曲線變化趨勢(shì)基本一致, 但在細(xì)菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期之后, 菌液A值會(huì)繼續(xù)增加, 而平板計(jì)數(shù)法顯示細(xì)菌生長(zhǎng)已進(jìn)入穩(wěn)定期甚至已經(jīng)開始衰亡(圖1)。對(duì)兩種方法進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn), 在細(xì)菌生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期之后, 平板計(jì)數(shù)法更能真實(shí)反映細(xì)菌生長(zhǎng)狀態(tài)(詳見 3.2)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn), 不同溫度下殺鮭氣單胞菌生長(zhǎng)曲線差異較大(圖2)。隨著培養(yǎng)溫度的降低, 殺鮭氣單胞菌生長(zhǎng)速率下降。當(dāng)培養(yǎng)溫度為28 ℃時(shí), 殺鮭氣單胞菌在2h后就進(jìn)入了對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期, 并在 8 h左右達(dá)到數(shù)量高峰期, 為 6.6×108CFU/mL。20 h之后, CFU對(duì)數(shù)值顯示其數(shù)量開始下降(圖1a)。培養(yǎng)溫度為15℃時(shí), 該菌在6 h之后進(jìn)入快速增長(zhǎng)期, 從CFU對(duì)數(shù)值可以看出, 在48 h左右細(xì)菌生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期(圖1b)。當(dāng)溫度降低到10℃時(shí),其生長(zhǎng)速率進(jìn)一步降低(圖1c), 14 h左右生長(zhǎng)速率加快, 54 h趨于穩(wěn)定。而當(dāng)溫度降低到5℃時(shí), 在36 h之內(nèi), 殺鮭氣單胞菌數(shù)量無(wú)顯著變化。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn), 在實(shí)驗(yàn)第24小時(shí)和第48小時(shí), 各溫度組殺鮭氣單胞菌數(shù)量均出現(xiàn)顯著差異(P<0.05); 在第 72小時(shí),15℃及 5℃條件下殺鮭氣單胞菌數(shù)量差異顯著(P<0.05), 說明隨溫度降低, 殺鮭氣單胞菌生長(zhǎng)速率顯著降低(圖3)。

圖1 不同溫度下殺鮭氣單胞菌生長(zhǎng)曲線Fig. 1 Growth curves of Aeromonas salmonicida under different temperatures

圖2 不同溫度下殺鮭氣單胞菌生長(zhǎng)曲線的比較Fig.2 Comparison of Aeromonas salmonicida growth curves under different temperatures

圖3 殺鮭氣單胞菌在不同溫度下培養(yǎng)24、48、72h的細(xì)菌對(duì)數(shù)值Fig. 3 Logarithm of Aeromonas salmonicida cultivated under different temperatures for 24, 48and 72 h

2.2 不同 pH 條件下殺鮭氣單胞菌的生長(zhǎng)曲線

pH是影響細(xì)菌生長(zhǎng)的一個(gè)重要因素。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 培養(yǎng)液pH不同, 殺鮭氣單胞菌生長(zhǎng)速率差異顯著, 且其在 pH6.0～8.0范圍內(nèi)均可生長(zhǎng)(圖 4)。從生長(zhǎng)曲線來(lái)看, 當(dāng)初始pH為7.5時(shí), 殺鮭氣單胞菌在6 h左右進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期, 20 h基本穩(wěn)定, 菌液A600值為 0.293。初始pH為 7.0時(shí)細(xì)菌生長(zhǎng)趨勢(shì)與上述基本相同, 菌液A600略低。當(dāng)培養(yǎng)液初始 pH為 8.0時(shí), 殺鮭氣單胞菌生長(zhǎng)速率及菌液A600值均有所降低, 20 h的A600值為0.245。當(dāng)培養(yǎng)液顯酸性, 即初始pH為6或6.5時(shí), 細(xì)菌生長(zhǎng)速率明顯下降, 對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期延緩, 在14 h之后菌液A600值才快速增加。對(duì)12 h及24 h時(shí)菌液A600值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn), 在第12小時(shí), 初始pH為6.0和6.5兩組菌液A600值與其他各組相比差異顯著(P<0.05); 且在第 24小時(shí), 初始pH為7.0及7.5的兩組菌液A600值與其他各組有顯著性差異(P<0.05)(圖 5)。通過統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果可知,pH7.0～8.0是殺鮭氣單胞菌生長(zhǎng)較適宜的范圍。

圖4 不同pH條件下殺鮭氣單胞菌生長(zhǎng)曲線Fig. 4 Growth curves of Aeromonas salmonicida under different pH

圖5 殺鮭氣單胞菌在不同pH條件下培養(yǎng)12h、24h菌液A600值Fig. 5 A600 of Aeromonas salmonicida cultivated under different pH for 24 h and 48 h

另外, 實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn), 隨著殺鮭氣單胞菌的生長(zhǎng),菌液pH會(huì)發(fā)生變化(表1), 總體呈下降趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)前后pH變化范圍為0.101～0.207, pH下降說明殺鮭氣單胞菌在生長(zhǎng)過程中會(huì)產(chǎn)生酸性代謝產(chǎn)物。

3 討論

3.1 不同溫度對(duì)殺鮭氣單胞菌生長(zhǎng)的影響

從本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果可以看出, 殺鮭氣單胞菌適宜生長(zhǎng)溫度為28℃, 這與Statner B等[8]的研究結(jié)果一致。在實(shí)際生產(chǎn)當(dāng)中, 殺鮭氣單胞菌主要感染對(duì)象為鮭科魚類, 而鮭魚屬于冷水性魚類, 其最適生長(zhǎng)水溫一般為 12～18℃, 根據(jù)品種不同而有所差別, 陸封型大西洋鮭(Atlantic Salmon)最佳生長(zhǎng)溫度為12～16℃[9], 高白鮭(Coregonus Peled)為 12～16℃[10],虹鱒(Oncorhynchus mykiss)為 12～18℃[11], 因此在工廠化養(yǎng)殖過程中, 為抑制殺鮭氣單胞菌在系統(tǒng)中的生長(zhǎng)繁殖, 可將水溫調(diào)節(jié)為適宜魚類生長(zhǎng)的最低溫度, 從而降低養(yǎng)殖過程中殺鮭氣單胞菌大量繁殖導(dǎo)致魚類疾病暴發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。但在低溫條件下, 細(xì)菌生長(zhǎng)速率的降低主要是由于酶活性降低, 酶促過程減緩,而不是由于蛋白質(zhì)變性或細(xì)胞死亡[12]引起的。因此,降低溫度只能起到抑制作用, 而不能徹底消滅殺鮭氣單胞菌的危害。在實(shí)際生產(chǎn)當(dāng)中, 降低養(yǎng)殖水體溫度也只能作為一種減少病害的預(yù)防手段, 為降低殺鮭氣單胞菌對(duì)養(yǎng)殖魚類的威脅還需與其他檢測(cè)及防治手段相結(jié)合。

表1 實(shí)驗(yàn)過程中菌液pH的變化Tab.1 Bacterium liquid pH changes during the experimental process

3.2 A值法與平板計(jì)數(shù)法的比較

用于細(xì)菌計(jì)數(shù)的常規(guī)方法有很多, 包括平板計(jì)數(shù)法、MTT法、A值法、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板法、濁度法等, 目前為止最為穩(wěn)定可靠的是平板計(jì)數(shù)法[13]。經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),A值法與平板計(jì)數(shù)法測(cè)得的結(jié)果有一定的差別。A值法不能區(qū)分死亡細(xì)菌, 其測(cè)得的是活菌及死亡細(xì)菌總數(shù)。在細(xì)菌生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期, 死亡細(xì)菌很少可忽略不計(jì), 穩(wěn)定期會(huì)有大量細(xì)菌死亡, 因而在實(shí)驗(yàn)后期測(cè)得的A值并不能真實(shí)的反映細(xì)菌的數(shù)量, 這與前人關(guān)于嗜水氣單胞菌生長(zhǎng)的研究結(jié)果相似[14]。另外, 因測(cè)量?jī)x器量程等的限制, 在測(cè)較低或過高濃度病原菌數(shù)量變化情況時(shí), 該方法會(huì)存在局限性[15]。從實(shí)驗(yàn)操作方面來(lái)看, 平板計(jì)數(shù)法耗時(shí)長(zhǎng), 勞動(dòng)強(qiáng)度大, 無(wú)菌操作要求嚴(yán)格, 而A值法操作簡(jiǎn)便快捷,在一定程度上也可反映細(xì)菌數(shù)量變化趨勢(shì), 因此在細(xì)菌生長(zhǎng)參數(shù)的檢測(cè)中A值法常被廣泛應(yīng)用。針對(duì)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析, 由于該菌在低溫條件下生長(zhǎng)較慢, 菌液濃度較低, 為保證測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性, 建議采用平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行檢測(cè)。

3.3 不同pH對(duì)殺鮭氣單胞菌生長(zhǎng)的影響

環(huán)境pH會(huì)對(duì)細(xì)菌的生命活動(dòng)產(chǎn)生重要影響, pH的改變會(huì)引起細(xì)胞膜電荷變化, 進(jìn)而影響細(xì)菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收, 影響代謝過程中酶的活性; 改變生長(zhǎng)環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的可給性以及有害物質(zhì)的毒性。多數(shù)病原菌的最適 pH為中性或弱堿性(pH7.0～7.6),部分病原菌最適pH為酸性, 如乳本鄉(xiāng)桿菌(pH5.5)。個(gè)別病原菌在堿性條件下生長(zhǎng)良好, 如霍亂孤菌在pH8.4～9.2時(shí)生長(zhǎng)最好。張國(guó)軍等[16]報(bào)道香港海鷗型菌最適生長(zhǎng) pH為 5.5～6.0。陳向敏等[17]報(bào)道創(chuàng)傷弧菌在pH8.0～8.5的條件下細(xì)菌的濃度能達(dá)到最高。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明, 殺鮭氣單胞菌最適pH為中性或弱堿性(7.0～8.0)。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示, 在酸性與堿性條件下其生長(zhǎng)差異性顯著(P<0.05), 說明酸性條件能明顯抑制其生長(zhǎng)。在實(shí)際養(yǎng)殖生產(chǎn)中, 殺鮭氣單胞菌主要感染鮭鱒魚類, 不同品種的鮭鱒魚對(duì)養(yǎng)殖水體pH要求不同, 如高白鮭(Coregonus peled)的pH6～9[10]、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)的 pH6.5～7.5[11]。因此, 在養(yǎng)殖過程中可根據(jù)養(yǎng)殖魚品種的不同, 合理調(diào)控水體 pH, 在保證魚正常生長(zhǎng)條件下, 抑制殺鮭氣單胞菌在系統(tǒng)中的生長(zhǎng)繁殖, 從而降低魚類發(fā)病率。

4 結(jié)論

殺鮭氣單胞菌會(huì)對(duì)大西洋鮭魚的健康養(yǎng)殖造成威脅。作者以養(yǎng)殖生產(chǎn)系統(tǒng)中分離得到的殺鮭氣單胞菌為實(shí)驗(yàn)對(duì)象, 研究了不同溫度及pH對(duì)殺鮭氣單胞菌生長(zhǎng)的影響, 并繪制了其在不同條件下的生長(zhǎng)曲線。通過本實(shí)驗(yàn)研究得到以下結(jié)論。

(1) 在本實(shí)驗(yàn)條件下, 殺鮭氣單胞菌生長(zhǎng)速率隨溫度降低逐漸下降;

(2) 在 pH6.0～8.0時(shí), 酸性條件下能明顯抑制殺鮭氣單胞菌的生長(zhǎng);

(3) 28℃、pH7.5為殺鮭氣單胞菌生長(zhǎng)的最佳條件, 在此條件下殺鮭氣單胞菌生長(zhǎng)速率最快, 達(dá)到穩(wěn)定期時(shí)細(xì)菌數(shù)量也最多。

(4) 建議在不影響魚類正常生長(zhǎng)的條件下, 盡量降低養(yǎng)殖水體溫度并合理控制水體 pH, 對(duì)抑制魚類養(yǎng)殖過程中殺鮭氣單胞菌的生長(zhǎng)繁殖, 降低養(yǎng)殖魚類發(fā)病率具有一定的理論指導(dǎo)意義。

近幾年, 一些地區(qū)將鮭鱒魚類養(yǎng)殖作為特色產(chǎn)業(yè)和重要漁業(yè)經(jīng)濟(jì)支持其發(fā)展[18], 工廠化養(yǎng)殖規(guī)模也逐步擴(kuò)大, 環(huán)境條件可控性逐步增強(qiáng)。但隨之也出現(xiàn)了一系列的病害問題, 其中殺鮭氣單胞菌的危害十分嚴(yán)重, 死亡率高達(dá)70%以上[19]。因此, 在鮭鱒魚實(shí)際養(yǎng)殖過程中, 可以根據(jù)殺鮭氣單胞菌生長(zhǎng)特點(diǎn),合理控制養(yǎng)殖水體溫度或 pH, 抑制殺鮭氣單胞菌的生長(zhǎng)繁殖, 從而減少養(yǎng)殖魚類感染該致病菌的可能性, 降低發(fā)病率。

為促進(jìn)鮭鱒魚類的健康養(yǎng)殖, 針對(duì)其主要病原菌殺鮭氣單胞菌的研究需繼續(xù)深入開展。在將來(lái)的工作中, 可選擇其他環(huán)境因子, 包括C/N比、鹽度等作為影響因素進(jìn)一步探討殺鮭氣單胞菌的生長(zhǎng)特點(diǎn), 深入研究其生物學(xué)特性, 建立其在不同條件下的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型, 為合理預(yù)測(cè)殺鮭氣單胞菌在魚類養(yǎng)殖水體中的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)變化, 建立病害預(yù)警機(jī)制提供理論依據(jù)。

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