夏 冬 , 孫軍燕 , 劉娜娜 劉 冰 杜振寧

(1. 中國科學(xué)院 煙臺(tái)海岸帶研究所 海岸帶生物學(xué)與生物資源利用所重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 煙臺(tái) 264003; 2. 煙臺(tái)大學(xué) 藥學(xué)院, 山東 煙臺(tái) 264005)

藻藍(lán)蛋白(Phycocyanin, 簡稱 PC, 吸收光譜615～640 nm)是一類普遍存在于藍(lán)藻中具有光合作用的捕光色素蛋白[1]。藻藍(lán)蛋白具有眾多的藥理活性,如抗炎、抗腫瘤、抗過敏、維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)以及減毒增效等[2], 藥理試驗(yàn)證明其對(duì)機(jī)體內(nèi)自由基代謝紊亂具有顯著的調(diào)節(jié)作用。自由基參與很多疾病的發(fā)生過程, 包括: 炎癥, 動(dòng)脈粥樣硬化, 癌癥, 再灌注造成的損害及氧化脅迫引起的其他機(jī)能障礙等[3]。本文對(duì)藻藍(lán)蛋白的抗氧化活性和藥理效果進(jìn)行梳理,推論了藻藍(lán)蛋白的藥效活性和抗氧化機(jī)理的關(guān)系,為藻藍(lán)蛋白的藥理學(xué)研究提供參考。

1 藻藍(lán)蛋白的結(jié)構(gòu)與功能

藻類可利用自身的捕光色素復(fù)合體的桿狀結(jié)構(gòu)來捕光, 色素復(fù)合體中含有數(shù)千個(gè)捕光色素分子,可幫助海藻吸收極微弱的陽光。 鈍頂螺旋藻藻膽體的藻藍(lán)蛋白(C-Phycocyanin, C-PC)和別藻藍(lán)蛋白(Allophycocyanin, APC)通過連接蛋白非共價(jià)地交聯(lián)在一起, 能量從CPC傳到 APC, 最后傳到光合作用反應(yīng)中心以推動(dòng)光合作用的進(jìn)行[4]。藻藍(lán)蛋白的抗氧化作用與其特有的結(jié)構(gòu)有關(guān)(圖1)。藻藍(lán)蛋白中捕光色素、色氨酸殘基與色基間存在著激發(fā)能傳遞現(xiàn)象[5],具有從基態(tài)到激發(fā)態(tài)轉(zhuǎn)變的能力, 具有傳遞電子的能力傳遞, 包含了氧化還原的過程。

另外, Stocker 等[7]研究表明, 膽紅素具有消除過氧化物自由基的作用, 其機(jī)理是膽紅素可將過氧自由基綁定到C-10位的四吡咯分子的一個(gè)氫原子上,使自由基與中心碳原子形成共振穩(wěn)定, 最終擴(kuò)展到整個(gè)膽紅素分子。藻藍(lán)蛋白的發(fā)色團(tuán)(藻藍(lán)素)中開放的四吡咯鏈(如圖 2A)與膽紅素(如圖 2B)非常相似,或?yàn)槠淇寡趸钚宰龀鲐暙I(xiàn)。

圖1 藻膽體的基本結(jié)構(gòu)[6]

圖2 藻藍(lán)蛋白發(fā)色團(tuán)(A)和膽紅素(B)的常見結(jié)構(gòu)[8-9]

Romay[10]首先報(bào)道了藻藍(lán)蛋白的抗氧化的特性,其評(píng)價(jià)了藻藍(lán)蛋白在體內(nèi)外作為抗氧化劑的潛力,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示藻藍(lán)蛋白能夠有效消除羥基自由基和烷氧自由基, 表明藻藍(lán)蛋白具有在體內(nèi)外作為抗氧化劑的潛力。Halliwell[11]研究發(fā)現(xiàn), 藻藍(lán)蛋白對(duì)肝微粒體脂質(zhì)過氧化也有抑制作用, 該實(shí)驗(yàn)中超氧化物歧化酶(SOD)的抗氧化能力比藻藍(lán)蛋白高3倍, 而增加 SOD 的量, 卻沒有改變?cè)逅{(lán)蛋白的抗氧化能力,表明它們存在不同的抗氧化作用機(jī)制。另外, 藻藍(lán)蛋白的抗氧化機(jī)理與常用的抗氧化劑如生育酚和抗壞血酸類似, 可以抑制2, 2-偶氮二(2-瞇基丙烷)二鹽酸鹽引起的紅細(xì)胞溶血[12]。Hirata等[13]研究了藻藍(lán)蛋白對(duì)疏水系統(tǒng)的亞油酸甲酯和磷脂酰膽堿脂質(zhì)體模型的抗氧化作用。該實(shí)驗(yàn)表明, 每摩爾的藻藍(lán)素(藻藍(lán)蛋白的一個(gè)組成部分)的抗氧化活性高于同等摩爾量α-生育酚。并且, 從噴霧干燥的螺旋藻中提取的藻藍(lán)蛋白與從新鮮螺旋藻提取的藻藍(lán)蛋白具有類似的抗氧化活性。因?yàn)樵诟稍镞^程中藻藍(lán)蛋白的部分脫輔基蛋白會(huì)發(fā)生變性, 這些結(jié)果表明藻藍(lán)蛋白的藻藍(lán)素對(duì)其抗氧化能力具有重要貢獻(xiàn)。該研究顯示藻藍(lán)蛋白具有較好的抗氧化活性, 干燥后的藻藍(lán)蛋白由于穩(wěn)定性較好, 所以在商業(yè)開發(fā)上具有重要的利用價(jià)值。

2 藻藍(lán)蛋白抗氧化活性與相關(guān)藥理活性

2.1 藻藍(lán)蛋白抗氧化活性與抗炎作用

首先, 藻藍(lán)蛋白可以抑制魯米諾在堿性條件下的氧化發(fā)光反應(yīng)[14], 作用于吞噬細(xì)胞呼吸爆發(fā), 使自由基(·OH, H2O2, RO·)和多余過氧化物減少, 從而達(dá)到抑制作用。有證據(jù)[15]表明活性氧如超氧陰離子,過氧化氫和羥基自由基, 可以使花生四烯酸級(jí)聯(lián),從而造成肥大細(xì)胞脫顆粒并釋放組胺、5-羥色胺、腫瘤壞死因子和其他炎癥介質(zhì)。而藻藍(lán)蛋白正好能夠清除過氧化物, 羥基和烷基自由基。Spillert等[16]為了了解藻藍(lán)蛋白對(duì) H2O2和·OH潛在的清除能力, 研究了其對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)的體外炎癥反應(yīng)模型的抑制作用。結(jié)果顯示, 藻藍(lán)蛋白減輕了葡萄糖氧化酶在小鼠爪子上引起的水腫。因此, 藻藍(lán)蛋白對(duì)·OH的清除效果使它具有了抗炎作用。在相同的劑量范圍內(nèi), 藻藍(lán)蛋白在角叉菜膠誘導(dǎo)的大鼠后爪水腫和大鼠的棉花小球肉芽腫實(shí)驗(yàn)中均具有抗炎活性[17]。藻藍(lán)蛋白能顯著降低花生四烯酸介導(dǎo)的小鼠耳水腫以及角叉菜膠誘導(dǎo)的大鼠足跖浮腫, 歸因于對(duì)活性氧的清除和對(duì)花生四烯酸代謝的抑制。Gonzalez和 Fretland等[18-19]將藻藍(lán)蛋白作用于醋酸誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎的動(dòng)物模型, 通過分析結(jié)腸組織以及測(cè)定髓過氧化物酶活性, 結(jié)果表明, 給予藻藍(lán)蛋白的受損動(dòng)物結(jié)腸炎模型的結(jié)腸黏膜中, 嗜中性粒細(xì)胞浸潤顯著減少, 顯著降低產(chǎn)生自由基和多種反應(yīng)性物質(zhì)誘發(fā)疾病的髓過氧化物酶活性, 證實(shí)藻藍(lán)蛋白能有效降低乙酸造成的大鼠結(jié)腸炎發(fā)生率, 抗炎機(jī)理和其抗氧化活性有關(guān)。

2.2 藻藍(lán)蛋白抗氧化活性與保護(hù)肝臟的作用

Bhat等[20]研究了藻藍(lán)蛋白對(duì)用 R-(+)-長葉薄荷酮和CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝毒性藥理活性。結(jié)果顯示藻藍(lán)蛋白可以顯著降低兩種化合物產(chǎn)生大量自由基引起的肝毒性。2002年, Remirez等[21]研究了藻藍(lán)蛋白對(duì)肝臟枯否細(xì)胞氧化應(yīng)激的相關(guān)參數(shù)影響。結(jié)果顯示, 藻藍(lán)蛋白顯著降低了枯否細(xì)胞的吞噬功能和相關(guān)的呼吸爆發(fā)活動(dòng), 其原理是藻藍(lán)蛋白減少了氧化應(yīng)激產(chǎn)生的腫瘤壞死因子TNF-α和甲亢狀態(tài)下產(chǎn)生的一氧化氮。所以我們認(rèn)為, 藻藍(lán)蛋白的保肝作用主要?dú)w功于其抑制了氧化反應(yīng)中活性代謝產(chǎn)物的生成以及有效的消除自由基。此外, 藻藍(lán)蛋白還可以抑制細(xì)胞色素P450介導(dǎo)的一些反應(yīng), 例如, 抑制P450參與的氧化反應(yīng)活性代謝物的生成。Bhat等[22]也證實(shí)了藻藍(lán)蛋白可以抑制由CCl4誘導(dǎo)的大鼠體內(nèi)肝臟脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。

2.3 藻藍(lán)蛋白抗氧化作用與消除白內(nèi)障作用

Ou等[23]發(fā)現(xiàn)藻藍(lán)蛋白通過線粒體和未折疊蛋白反應(yīng)途徑抑制 D-半乳糖誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡。晶狀體上皮細(xì)胞凋亡是白內(nèi)障形成的重要原因, 預(yù)防 LEC細(xì)胞凋亡可以作為白內(nèi)障的一種治療策略。Kumari等[24]又研究了藻藍(lán)蛋白對(duì)由亞硒酸鈉誘導(dǎo)的大鼠白內(nèi)障的調(diào)節(jié)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明藻藍(lán)蛋白可以通過調(diào)節(jié)體內(nèi)外抗氧化酶的水平, 以致減少體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng), 降低了亞硒酸鈉誘導(dǎo)的白內(nèi)障的發(fā)病率。

2.4 藻藍(lán)蛋白抗氧化活性與保護(hù)血管作用

Ross[25]于1999年提出動(dòng)脈粥樣硬化是一種炎癥性疾病, 具有慢性炎癥反應(yīng)病理過程的特征。Riss等[26]實(shí)驗(yàn)證實(shí)螺旋藻中的藻藍(lán)蛋白通過抑制活性自由基和環(huán)氧合酶-2的生成, 從而提高了體內(nèi)抗氧化酶的水平, 有效改善了動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物氧化應(yīng)激所造成的炎癥損傷, 并具有調(diào)節(jié)血脂的作用。由于動(dòng)脈粥樣硬化病變的形成是動(dòng)脈對(duì)內(nèi)膜損傷做出炎癥-纖維增生性反應(yīng)的結(jié)果, 褚現(xiàn)明等[27]通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn), 研究了鈍頂螺旋藻藻藍(lán)蛋白對(duì)血管平滑肌細(xì)胞過度增殖、血管損傷后內(nèi)膜增生和管腔狹窄的抑制作用和機(jī)制。證實(shí)藻藍(lán)蛋白可以通過抑制細(xì)胞 G1/S周期進(jìn)程, 抑制VSMCs的過度增殖及新生內(nèi)膜的形成, 從而降低血管氧化炎癥損傷, 明顯抑制管腔狹窄, 因此證明了藻藍(lán)蛋白抗氧化活性對(duì)血管健康具有良好的保健預(yù)防作用。Strasky等[28]研究了藻藍(lán)蛋白對(duì)血紅素加氧酶-1的激活作用, 這種酶可以使血紅素分解代謝產(chǎn)生強(qiáng)效的抗氧化膽紅素。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 螺旋藻中的藻藍(lán)素能夠減少氧化應(yīng)激反應(yīng), 在內(nèi)皮細(xì)胞中激活HMOX1, 造成載脂蛋白E基因缺陷小鼠動(dòng)脈粥樣硬化病變中增加HMOX1的表達(dá)。這也為藻藍(lán)蛋白降低血管粥樣硬化提供了新的理論依據(jù), 即增加血紅素加氧酶-1的表達(dá)來增加抗氧化效果。

2.5 藻藍(lán)蛋白抗氧化活性與神經(jīng)保護(hù)作用

抗氧化能力的下降和氮氧活性自由基的增加與人體器官老化和神經(jīng)退行性疾病有很大關(guān)聯(lián)[29-31]。在某些動(dòng)物模型中注射 SOD, 發(fā)現(xiàn)其可以抑制這些模型的炎癥反應(yīng), 在離體免疫細(xì)胞以及動(dòng)物和人類體內(nèi), 可以增加免疫功能的某些分子表達(dá)[32]。許多臨床試驗(yàn)報(bào)告表明, 在腦損傷或梗死的患者的腦脊液和腦組織中, 細(xì)胞因子的表達(dá)明顯增加[33-34]。藻藍(lán)蛋白的抗氧化性可能作用在細(xì)胞因子上, 從而及時(shí)修復(fù)腦損傷, 抑制細(xì)胞壞死。

Rimbau等[35]研究發(fā)現(xiàn), 藻藍(lán)蛋白可以減少在大鼠海馬區(qū)紅藻氨酸誘導(dǎo)的癲癇反應(yīng), 具有保護(hù)神經(jīng)元的作用。紅藻氨酸導(dǎo)致癲癇是因?yàn)槠渖闪舜罅垦趸钚宰杂苫? 藻藍(lán)蛋白通過減少自由基起到對(duì)神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用。該實(shí)驗(yàn)提示藻藍(lán)蛋白可以用于治療神經(jīng)退行性疾病中的氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷, 如阿耳茨海默氏病和帕金森綜合癥等。另外,Rimbau等[36]還發(fā)現(xiàn), 藻藍(lán)蛋白通過減少氧自由基來保護(hù)體外鉀和血清缺乏培養(yǎng)的大鼠小腦顆粒細(xì)胞的死亡。Marin等[37]實(shí)驗(yàn)證明, 藻藍(lán)蛋白可以保護(hù)SH- SY5Y神經(jīng)細(xì)胞免受氧化損傷, 減少大鼠視網(wǎng)膜短暫性腦缺血和大鼠腦線粒體內(nèi)Ca2+/磷酸鹽引起的功能損傷。

2.6 藻藍(lán)蛋白抗氧化活性與腎肺器官的作用

Shukkur等[38]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)藻藍(lán)蛋白能夠預(yù)防由草酸在犬腎細(xì)胞觸發(fā)氧化應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞損傷, 降低細(xì)胞中草酸誘導(dǎo)的活性氧(ROS)和脂質(zhì)過氧化(LPO)反應(yīng), 對(duì)線粒體膜通透性具有顯著的保護(hù)作用。Zheng等[39]發(fā)現(xiàn)螺旋藻藻藍(lán)蛋白和藻藍(lán)素可以通過抑制氧化應(yīng)激、從而達(dá)到預(yù)防糖尿病腎病的發(fā)生?？诜?10周藻藍(lán)蛋白可以防止二型糖尿病小鼠(db/db小鼠)出現(xiàn)蛋白尿和腎系膜擴(kuò)張, 使腫瘤生長因子-β和纖維連接蛋白表達(dá)正常化, 使腎臟中氧化應(yīng)激標(biāo)記物NADPH氧化酶表達(dá)降低。另外, 在Gonzalez等[40]的試驗(yàn)中, 藻藍(lán)蛋白與卡那霉素合用可以減少大小鼠腎小管血管充血和炎癥浸潤, 降低卡那霉素這種氨基糖甙類抗生素所造成的腎毒性。Sun等[41]實(shí)驗(yàn)證明藻藍(lán)蛋白可以提高肺組織(SOD)和血漿谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)活性, 降低肺組織羥脯氨酸(HYP)、丙二醛(MDA)和血漿MDA含量, 減輕百草枯中毒大鼠肺泡炎及后期纖維化程度, 對(duì)百草枯誘導(dǎo)的大鼠肺泡炎及肺纖維化具有顯著的抑制作用。

2.7 藻藍(lán)蛋白抗氧化活性與預(yù)防腫瘤作用

鄰苯三酚紅漂白實(shí)驗(yàn)[42]結(jié)果顯示, 藻藍(lán)蛋白輔基比藻藍(lán)素對(duì)過氧亞硝基陰離子有更強(qiáng)的清除作用,而藻藍(lán)素也很顯著的抑制了過氧亞硝基陰離子造成的 DNA單鏈斷裂, 并呈劑量依賴關(guān)系, 這種效果可能為預(yù)防細(xì)胞發(fā)生癌變打下了基礎(chǔ)。Gupta等[43]研究了藻藍(lán)蛋白對(duì)暴露于12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯(12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetate, TPA)的小鼠皮膚腫瘤基因的保護(hù)作用。當(dāng)TPA誘導(dǎo)的小鼠出現(xiàn)腫瘤關(guān)鍵特征因子, 如鳥氨酸脫羧酶, 環(huán)氧合酶-2,白細(xì)胞介素 6和磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子 3的表達(dá)時(shí), 使用藻藍(lán)蛋白可抑制這些由 TPA引起的腫瘤關(guān)鍵特征因子的表達(dá), 并且具有劑量依賴性。Thangam 等[44]對(duì)藻藍(lán)蛋白的抗氧化和抑制癌細(xì)胞生長進(jìn)行了研究。通過熒光和相差顯微鏡觀察到藻藍(lán)蛋白可抑制HT-29(結(jié)腸癌)和A549(肺癌)細(xì)胞的生長,使癌細(xì)胞的DNA在G(0)/G(1)期停滯和裂解。

另外, 藻藍(lán)蛋白對(duì)于化療過程中產(chǎn)生的機(jī)體氧化應(yīng)激損傷的良好保護(hù)能力。Fernandez等[45]研究了藻藍(lán)蛋白對(duì)順鉑導(dǎo)致的腎毒性的作用, 結(jié)果顯示,藻藍(lán)蛋白可以防止順鉑引起的谷胱甘肽還原酶的降低, 減少過氧化氫的含量, 維持血液中尿素氮的水平, 對(duì)氧化應(yīng)激有良好的抑制作用, 具有抑制順鉑所致的腎毒性的作用。不僅如此, 多年癌癥研究證明,恰當(dāng)?shù)乃幬锏慕M合可以有效的提高單一藥物在治療方案中的安全性和有效性[46]。1998年, 辛華雯等[47]研究了藻藍(lán)蛋白對(duì)氨甲喋呤和順鉑的體外增效作用。結(jié)果顯示, 藻藍(lán)蛋白與氨甲蝶呤合用后顯著增強(qiáng)后者的細(xì)胞毒性, 隨著氨甲蝶呤濃度的提高, 其增效作用也增強(qiáng), 無藻藍(lán)蛋白與加用藻藍(lán)蛋白的細(xì)胞存活率之間存在高度顯著性差異, 其與現(xiàn)有增效劑維拉帕米(鈣離子通道抑制劑)相比, 效果相近但毒性更小。Miroslav等[48]用 10%的常規(guī)劑量的拓?fù)涮婵蹬c藻藍(lán)蛋白聯(lián)用, 效果比單用常規(guī)劑量的拓?fù)涮婵敌Ч? 激活了大量的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(caspase-9)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)。在提高拓?fù)涮婵档男Ч耐瑫r(shí)降低其副作用的發(fā)生。Saini等[49]也在同年證實(shí)了傳統(tǒng)的非甾體抗炎藥吡羅昔康和藻藍(lán)蛋白聯(lián)合用藥, 效果比單用提高 70%以上, 環(huán)氧合酶 2(COX-2)表達(dá)和前列腺素 E2 (PGE-2)水平大大降低,DNA斷裂也被抑制。不難看出, 藻藍(lán)蛋白的抗氧化作用起到了提高免疫力和保護(hù)受損器官的作用, 而藻藍(lán)蛋白作為一種光敏劑與現(xiàn)有臨床抗癌藥物的聯(lián)用將會(huì)在化療的增效方面起到重要的作用。

3 總結(jié)與展望

本實(shí)驗(yàn)室對(duì)重組別藻藍(lán)蛋白的抗氧化活性研究[50-51]表明, 重組別藻藍(lán)蛋白具有清除自由基的能力, 但其對(duì)不同類型自由基的清除效果有較大差別。由于藻藍(lán)蛋白結(jié)構(gòu)組成與別藻藍(lán)蛋白相類似, 藻藍(lán)蛋白的輔基蛋白也具有類似的抗氧化活性[52]。隨后進(jìn)一步驗(yàn)證藻藍(lán)素(phycocyanobilin, PCB) 對(duì)DPPH自由基的清除作用呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系[53]; Pleonsil等[54]的最新研究結(jié)果顯示, 天然藻藍(lán)蛋白的抗氧化活性大于重組藻藍(lán)蛋白。藻藍(lán)蛋白的抗氧化活性, 藻藍(lán)色素起到了一部分作用[13], 而輔基蛋白也應(yīng)具有與藻藍(lán)素不同途徑的抗氧化作用[52], 間接證實(shí)了藻藍(lán)蛋白是從脫輔基蛋白和藻藍(lán)素兩個(gè)水平上清除自由基的。

當(dāng)今，我們已經(jīng)可以通過比較成熟的化學(xué)和生物工程技術(shù)得到純度較高的藻藍(lán)蛋白。但活性會(huì)隨著原料和提取工藝的不同而出現(xiàn)差別。藻藍(lán)蛋白擁有了良好的抗氧化能力可以為申請(qǐng)保健品和候選藥品打下基礎(chǔ)，成功與否取決于其自身良好的品質(zhì)控制。傳統(tǒng)開放式養(yǎng)殖獲取藻藍(lán)蛋白需要大量的條件摸索達(dá)到品質(zhì)恒定，而工業(yè)化的生物重組表達(dá)較為可控，但藻藍(lán)素很難能夠通過生物工程裝配到多聚體的蛋白亞基上，其得到藻藍(lán)蛋白活性和品質(zhì)還需進(jìn)一步研究。另外，藻藍(lán)蛋白代謝產(chǎn)物和衍生物較為復(fù)雜。通過口服和注射等給藥途徑，確定藻藍(lán)蛋白的活性效果是由整體還是由它的代謝產(chǎn)物起到的，是我們接下來所要研究的目標(biāo)。文中提到了藻藍(lán)蛋白可以在不同的疾病器官中發(fā)揮抗氧化作用，藻藍(lán)蛋白是如何進(jìn)入細(xì)胞，又如何發(fā)揮作用是研究的關(guān)鍵。螺旋藻的大規(guī)模的養(yǎng)殖為藻藍(lán)蛋白開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)，其功能性食品為其應(yīng)用進(jìn)行了探索。因此，未來藻藍(lán)蛋白活性與機(jī)制的深層研究和臨床試驗(yàn)將為其應(yīng)用開辟更大的空間。

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