李鳳超，蘇榮國**，王 科，李旭朝，盧 偉

（1.中國海洋大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，山東 青島 266100；2.海洋化工研究院，山東 青島 266071）

海洋生物污損是指有害的微型或大型生物在物體表面的有害沉積，是人類開發(fā)和利用海洋資源過程中遇到的重大難題之一。它能降低船速增加燃料消耗，嚴(yán)重影響海上鉆井平臺、防波堤等建筑設(shè)施的性能與壽命，給人類造成巨大的經(jīng)濟損失［1－2］。

涂裝防污涂層是最為有效、經(jīng)濟的防污方法。海洋防污涂料有著非常悠久的歷史，最早可追溯到公元前2000多年［3］。傳統(tǒng)的防污涂料如有機錫類防污涂料、氧化亞銅類防污涂料等曾達(dá)到了人們所期望的防污效果，但卻給海洋生態(tài)系統(tǒng)帶來了嚴(yán)重的災(zāi)害，也間接危害了人類健康［4］。國際海洋組織禁止在2003年1月以后使用含有TBT的防污涂料，并決定到2008年全面禁用有機錫的防污涂料［5］，為此研制開發(fā)環(huán)境友好型的防污劑和防污涂料成為亟待解決的問題。

天然防污活性物質(zhì)因?qū)θ祟惣胺悄繕?biāo)生物無害，對環(huán)境無污染、易降解等特點成為新型防污劑研制的重點對象［6］。例如從桉樹、辣椒等陸生植物或從海洋植物、海洋無脊椎動物和海洋微生物中提取具有防污活性的天然產(chǎn)物［7］。海藻類植物是海洋中的初級生產(chǎn)者，廣泛的分布在世界大洋中，它們能夠產(chǎn)生豐富的具有生物活性的次級代謝產(chǎn)物，是天然防污劑重要的潛在來源［8］。

本文以典型的海洋污損生物中肋骨條藻（Skeletonemacostatum）和東方小藤壺（Chthamaluschallengeri）的Ⅱ期幼蟲為受試生物研究了海帶（Laminar-ia）和厚葉解曼藻（Kjellmaniellacrassifolia）粗提物的防污活性，為天然生物活性物質(zhì)作為防污劑應(yīng)用到防污涂料中提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

LDZX-50FBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；GXZ-3800型智能光照培養(yǎng)箱（寧波東南儀器廠）；Fluorolog3-11熒光分光光度計（Jobin Yvon，france）；OSB-2100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛明儀器有限公司）；HZQ-F160型全溫振蕩培養(yǎng)箱（哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司）；f/2營養(yǎng)液；乙醇（AR）天津市富宇精細(xì)化工有限公司；二氯甲烷（AR）天津市富宇精細(xì)化工有限公司；無水硫酸鈉（AR）國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 生物活性物質(zhì)的提取

本文所用的海帶（Laminaria）和厚葉解曼藻（Kjellmaniellacrassifolia）是由中國海洋大學(xué)大型海藻種質(zhì)資源庫提供。兩種海藻均屬于褐藻門，其中海帶“三海”為人工培育的海帶品種（Laminariajaponica×Saccharinalatissima），在中國已廣泛養(yǎng)殖。將海帶和厚葉解曼藻用蒸餾水沖洗干凈，然后用5%的乙醇溶液沖洗除去表面的微菌群，用濾紙拭干其表面，室溫下陰干。陰干后的原材料磨成粉密封于塑料袋并存放在冰箱中備用。取兩種海藻粉各80g于500mL的錐形瓶中，加入95%的乙醇溶液120mL，封口置于恒溫（4℃）振蕩培養(yǎng)箱中振蕩提取4h后收集上層清液。同樣的提取過程重復(fù)5次。將5次乙醇提取液混合，低溫下（＜40℃）于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸干，加入蒸餾水（100mL）和二氯甲烷（400mL）溶解后轉(zhuǎn)入梨形分液漏斗中充分振蕩30min靜置分層。收集二氯甲烷相并加入適量的Na2SO4粉末靜置干燥24h，過濾。將二氯甲烷相低溫（＜40℃）旋蒸至約5mL，轉(zhuǎn)移到50mL的稱量瓶中，用氮氣吹干、稱重并配制成粗提物溶液［9］。

1.3 抑制海藻生長活性實驗

中肋骨條藻（Skeletonemacostatum）為受試藻種，由中國海洋大學(xué)海洋生態(tài)防污實驗室提供。中肋骨條藻是常見的污損硅藻（Diatom），具有極高的抗防污能力［10］。使用過濾后（GF/F，Whatman）的黃海海水配制成F/2-Si營養(yǎng)液［11－12］進(jìn)行培養(yǎng)，其pH 為8.0±0.1，鹽度為30.01±1.0。所用培養(yǎng)容器和營養(yǎng)液均進(jìn)行高壓滅菌處理（120℃，20min），接種后將藻液放在智能光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，光照強度（E）為3 000～4 000lux、光暗比為12h∶12h、溫度為（20±1）℃，每天手工振蕩藻液以進(jìn)行氣體交換，培養(yǎng)到指數(shù)生長期（105cells/mL）備用。

將指數(shù)生長期的中肋骨條藻藻液轉(zhuǎn)入250mL的錐形瓶，每瓶100mL，按設(shè)定的濃度梯度加入粗提物溶液搖勻。海帶粗提物濃度梯度設(shè)定為0，5.0、7.5、10.0、15.0、25.0μg·mL－1，厚葉解曼藻粗提物濃度梯度設(shè)定為0，10.0、15.0，20.0、30.0、35.0μg·mL－1，每個濃度梯度設(shè)定3個平行樣。將其放在溫度為（20±1）℃、光照約3 000～4 000lux、光暗比為12h∶12h智能光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96h，每24h用熒光分光光度計測定葉綠素a的熒光強度（FI），以此反應(yīng)藻的生長情況［13］。熒光強度的測定條件：室溫20～25℃；激發(fā)波長為450nm；發(fā)射波長為685nm；狹縫寬度為5nm；積分時間為0.05s。

1.4 抑制藤壺幼蟲急性毒性實驗

藤壺是世界上分布最廣、數(shù)量最多的一類海洋污損生物。目前，許多國內(nèi)外學(xué)者把藤壺作為生物污損和污損防治的重要研究對象［14－16］。實驗所用的藤壺為小藤壺科（Chthamalidea）的東方小藤壺（Chthamalus challengeri）。所用藤壺于2014年5—9月采自青島太平角石質(zhì)潮間帶。選取藤壺個體大（底基直徑大于5nm）且多的巖石，用錘子將巖石敲下帶回實驗室，用清水將石塊洗凈后放入盛有新鮮海水的大桶中，加入培養(yǎng)的亞心型扁藻（Platymonassubcordiforus）作為餌料，每天更換新鮮海水。

實驗前，將成體藤壺的石塊從桶中取出，自來水沖凈，陰干后放入新鮮海水中，適當(dāng)光照刺激，幾分鐘之后就有藤壺幼蟲釋放出來。利用幼蟲的趨光性用吸管吸出轉(zhuǎn)移到盛有滅菌的海水的燒杯中，投入少量餌料藻液并充氣培養(yǎng)12h，獲得藤壺Ⅱ期幼蟲，選取活潑個體用于實驗。

急性毒性試驗在24孔聚苯乙烯板中進(jìn)行，每孔體積3mL。每孔移入30只Ⅱ期藤壺幼蟲，按設(shè)好的濃度梯度加入粗提物，海帶粗提物濃度梯度設(shè)定為0，5.0、7.5、10.0、20.0、30.0μg·mL－1，厚葉解曼藻粗提物濃度梯度設(shè)定為0，5.0、10.0、15.0、20.0、35.0μg·mL－1，然后補加新鮮海水至2.5mL。每個濃度梯度設(shè)3個平行，溫度28℃，不投餌，不充氣，避光培養(yǎng)。24h后觀察并記錄結(jié)果。計算不同濃度的粗提物對藤壺幼蟲的致死率，即每個濃度梯度下死亡的藤壺幼蟲數(shù)目占總的藤壺幼蟲數(shù)目的百分比。

1.5 實驗數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS軟件分析，SPSS軟件提供了完整的數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析功能［17］。實驗組與對照組的差異運用單向方差分析，再運用Dunnett-t檢驗（α＝0.05）。以EC50表示粗提取物的抑藻效果，以LC50表示粗提取物對藤壺幼蟲的致死效果。EC50是指在一定時間內(nèi)，引起50%試驗生物產(chǎn)生某一特定反應(yīng)，或是某反應(yīng)指標(biāo)被抑制一半時的毒性物質(zhì)濃度［18］。LC50是指一定時間內(nèi)，使受試生物死亡一半時所需毒性物質(zhì)的濃度［19］。

2 結(jié)果與討論

2.1 粗提物對中肋骨條藻生長的抑制作用

圖1 不同濃度海帶粗提物影響下中肋骨條藻96h生長曲線Fig.1 Growth curve of S.costatumsubjected to different concentrations of the crude extract of Laminaria within 96h

兩種粗提物對中肋骨條藻的生長均具有較好的抑制作用（見圖1、2）。不同濃度海帶粗提物對中肋骨條藻生長的抑制作用隨濃度增加而增強（見圖1），當(dāng)海帶粗提物濃度為10.0μg·mL－1時，在72h內(nèi)對中肋骨條藻的生長具有顯著抑制作用，在96h后中肋骨條藻逐漸恢復(fù)生長；當(dāng)粗提物的濃度達(dá)15.0μg·mL－1時，就可以完全抑制中肋骨條藻的生長。經(jīng)計算得海帶粗提物抑藻的EC50值為（8.9±0.6）μg·mL－1。

圖2 不同濃度厚葉解曼藻粗提物影響下中肋骨條藻96h生長曲線Fig.2 Growth curve of S.costatumsubjected to different concentrations of the crude extract of Kjellmaniella crassifolia within 96h

厚葉解曼藻粗提物對中肋骨條藻生長的抑制作用符合量效關(guān)系（見圖2）。當(dāng)厚葉解曼藻粗提物的濃度為35.0μg·mL－1時，可完全抑制中肋骨條藻的生長；當(dāng)其濃度達(dá)到30.0μg·mL－1時，可抑制80%以上的中肋骨條藻生長；當(dāng)其濃度為15.0μg·mL－1時，可抑制40%以上的中肋骨條藻生長；而當(dāng)其濃度低于10.0 μg·mL－1時，藻的生長基本不受影響。經(jīng)計算得厚葉解曼藻粗提物抑藻的 EC50值為（17.3±1.2）μg·mL－1。

關(guān)于從海洋生物中提取抑藻活性物質(zhì)，國內(nèi)外已有相關(guān)報道。如海洋真菌（Aureobasidiumpullulans）氯仿萃取物可有效抑制中肋骨條藻的生長，其EC50值為49.4μg·mL－1［20］；孔石莼（Ulvalactuca）的二氯甲烷提取物對三角褐指藻（Phaeodactylumtricornutum Bohlin）生長有抑制作用，其EC50值為300.0μg·mL－1［21］；當(dāng)囊鏈藻（Bifurcariabrassicaeformis）的粗提物濃度為30.0μg·mL－1時，可以阻止60%以上大型海藻（如滸苔等）孢子的附著［22］；鈍馬尾藻（Sargassummuticum）的二氯甲烷提取物可抑制新月菱形藻（硅藻）的生長，其 EC50值為45.5μg·mL－1［23］；銅藻（Sargassumhorneri）的粗提物可抑制硅藻（Navicula annexa）的生長，其 EC50值為1.79μg·mL－1［24］。根據(jù)現(xiàn)有的文獻(xiàn)報道，本研究所得到的兩種海藻粗提物具有較好的抑藻活性。

2.2 粗提物對藤壺幼蟲急性毒性作用

由圖3可知，海帶粗提物對藤壺幼蟲有較好的毒性效應(yīng)，其對藤壺幼蟲的致死率隨濃度的增大而升高。當(dāng)海帶粗提物濃度達(dá)到20.0μg·mL－1時，即可使50%以上的藤壺幼蟲死亡；而當(dāng)其濃度達(dá)到30.0μg·mL－1時，對藤壺幼蟲的致死率達(dá)100%。根據(jù)該急性毒性試驗結(jié)果計算得到海帶粗提物對藤壺幼蟲的LC50值為（12.0±1.6）μg·mL－1。

圖3 海帶粗提物對藤壺幼蟲的致死率（24h）Fig.3 Lethal effects of the crude extract against C.challengeri larvae after 24hexposure

圖4 厚葉解曼藻粗提物對藤壺幼蟲的致死率（24h）Fig.4 Lethal effects of the crude extract of Kjellmaniella crassifoliaagainst C.challengeri larvae（24h）

厚葉解曼藻粗提物對藤壺幼蟲的致死作用也隨著濃度的增大而增強（見圖4）。厚葉解曼藻粗提物濃度低于15.0μg·mL－1時，對藤壺幼蟲的致死率小于40%；當(dāng)其濃度增加到20.0μg·mL－1時，可使藤壺幼蟲的致死率達(dá)到50%；而當(dāng)厚葉解曼藻粗提物濃度達(dá)到35.0μg·mL－1時，藤壺幼蟲基本全部死亡。經(jīng)計算得到厚葉解曼藻粗提物對藤壺幼蟲的LC50值為（16.1±2.5）μg·mL－1。

從海洋生物中提取防污活性物質(zhì)的研究已經(jīng)受到國內(nèi)外科技工作者的廣泛重視，一些具有較強藤壺幼蟲抑制作用的海洋天然活性物質(zhì)被發(fā)現(xiàn)。2009年，Limna Mol等［25］發(fā)現(xiàn)海綿（Haliclonaexigua）提取物對紋藤壺幼蟲有明顯毒性效應(yīng)，經(jīng)急性毒性實驗得其LC50值為18.07μg·mL－1。海洋真菌（Aureobasidiumpullulans）氯仿萃取物對紋藤壺幼蟲也有較強的致死作用，其 LC50值 為 22.2 μg·mL－1［20］；從 柳 珊 瑚（Subergorgiasuberosa）中提取的柳珊瑚酸對紋藤壺幼蟲的附著表現(xiàn)出較強的抑制作用，其對紋藤壺幼蟲的LC50值為200μg·mL－1［26］。另外，海條藻（Himanthaliaelongata）的二氯甲烷提取物對紋藤壺幼蟲的LC50值為96.2μg·mL－1［27］；囊鏈藻（Bifurcariabifurcate）中提取的代謝產(chǎn)物對藤壺幼蟲的LC50值為38.3μg·mL－1［28］。本文中海帶和厚葉解曼藻粗提物對藤壺幼蟲的 LC50值分別為（12.0±1.6）和（16.1±2.5）μg·mL－1，相比而言具有較強的致死作用。

表1 兩種海藻粗提物的生物毒性測試結(jié)果Table 1 Biological toxicity test results of the seaweeds/μg·mL－1

3 結(jié)語

本文從人工培育海帶“三?！焙秃袢~解曼藻中提取得到具有較強防污活性的物質(zhì)，其對兩種典型污損生物中肋骨條藻和東方小藤壺幼蟲具有顯著的抑制或致死作用，海帶粗提物抑制中肋骨條藻生長的EC50值為（8.9±0.6）μg·mL－1，對藤壺Ⅱ期幼蟲急性毒性試驗的LC50值為（12.0±1.6）μg·mL－1。厚葉解曼藻粗提物抑藻實驗的EC50值為（17.3±1.2）μg·mL－1，對藤壺Ⅱ期幼蟲的LC50值為（16.1±2.5）μg·mL－1。研究結(jié)果表明，2種海藻提取物均具有較強的生物毒性，可作為環(huán)境友好型防污劑的來源進(jìn)行深入細(xì)致的研究。

到目前為止，從海洋藻類特別是褐藻和紅藻中提取的生物活性物質(zhì)多為脂肪酸類、生物堿類、萜類、酚類以及甾醇類化合物［29］。羅先群等［30］研究發(fā)現(xiàn)紅藻門的細(xì)基江蘺藻（Gracilariarenuistipctata）和褐藻門的匍枝馬尾藻（Sargassumpolycystum）的乙醚和95%乙醇提取物具有較好的抑菌活性，經(jīng)進(jìn)一步的分離鑒定，發(fā)現(xiàn)主要的抑菌活性成分為一系列脂肪酸類化合物，如棕櫚酸、十八碳烯酸、5，8，11，14-二十碳四烯酸等。Vallim等［31］研究發(fā)現(xiàn)褐藻門網(wǎng)地藻（Dictyotacean）的防污活性物質(zhì)為萜類化合物。Manilal等［32］研究發(fā)現(xiàn)紅藻門的凹頂藻（Laurenciabrandenii）甲醇粗提物經(jīng)層析柱梯度洗脫純化后的組分可抑制藤壺、貽貝的附著，經(jīng)GC-MS鑒定防污活性成分主要為十八碳二烯酸和棕櫚酸。Mautner等［33］首次試驗紅藻門松節(jié)藻（Rhodomelaconfervoides）的提取物有很強的抗菌活性，經(jīng)鑒定活性物質(zhì)為溴代酚。海帶和厚葉解曼藻的是海洋中普遍存在的褐藻類植物，其防污活性物質(zhì)應(yīng)該為中級性的脂肪酸類、萜類或酚類化合物，在進(jìn)一步研究中需要利用柱層析、紅外、高分辨質(zhì)譜等分離鑒定技術(shù)對提取的防污活性物質(zhì)進(jìn)行分析。

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