王 勇，高 升，李水明（.深圳大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，深圳市海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳 58060；.深圳大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，深圳市微生物基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳 58060）

串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜的碎片離子相對(duì)強(qiáng)度在區(qū)分亮氨酸和異亮氨酸殘基中的應(yīng)用

王 勇1，高 升2，李水明1
（1.深圳大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，深圳市海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳 518060；
2.深圳大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，深圳市微生物基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳 518060）

研究肽段從頭測(cè)序需要解決的問(wèn)題之一是區(qū)分亮氨酸和異亮氨酸殘基，利用基質(zhì)輔助激光解吸電離-串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF／TOF）所產(chǎn)生的w型離子區(qū)分這兩種氨基酸殘基是目前最常用的方法。本研究以6對(duì)合成的同分異構(gòu)肽段（由7～15個(gè)氨基酸構(gòu)成）為例，來(lái)說(shuō)明w離子信號(hào)強(qiáng)度較低且有時(shí)不能產(chǎn)生，在區(qū)分多肽中的亮氨酸和異亮氨酸時(shí)受肽段長(zhǎng)度和序列的限制。而亮氨酸與異亮氨酸的變化會(huì)導(dǎo)致亞胺相關(guān)離子、內(nèi)部斷裂離子、b-型和y-型離子等相對(duì)強(qiáng)度的微小變化。通過(guò)比較這些骨架斷裂變化所產(chǎn)生的微小差異，可為區(qū)分肽段中的亮氨酸和異亮氨酸殘基提供新的線索和判據(jù)。

從頭測(cè)序；串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF／TOF）；亮氨酸；異亮氨酸

數(shù)據(jù)庫(kù)搜索和從頭測(cè)序是基于串聯(lián)質(zhì)譜鑒定肽段的兩種基本方法［1-2］。相比于數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，從頭測(cè)序的關(guān)鍵是串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)是否能提供足夠的序列信息，其中，亮氨酸和異亮氨酸殘基的區(qū)分就是亟待解決的問(wèn)題之一。一般來(lái)說(shuō)，基于氨基酸序列的相似性，局部同源搜索工具（BLAST）可以為從頭測(cè)序提供區(qū)分亮氨酸和異亮氨酸的參考信息［3-5］，然而，該方法不適用于亮氨酸和異亮氨酸的基因發(fā)生相互突變的情況［6］。此外，在人類(lèi)轉(zhuǎn)錄組中，核糖核酸（RNA）和脫氧核糖核酸（DNA）序列也存在廣泛的差異，亮氨酸或異亮氨酸也可能通過(guò)其他氨基酸的突變產(chǎn)生［7-8］。因此，對(duì)串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行深入地分析非常重要。

在低能碰撞誘導(dǎo)解離模式下，通過(guò)分析亮氨酸和異亮氨酸亞銨離子碎片的三級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜可將其有效區(qū)分。亮氨酸和異亮氨酸都可以產(chǎn)生m／z30和m／z44離子，然而，亮氨酸由麥?zhǔn)现嘏胖饕獢嗔殉蒻／z 43和m／z 44離子，異亮氨酸則通過(guò)失去氨和乙烯生成m／z69和m／z41離子［9-12］。這些信息可用于區(qū)分金屬離子復(fù)合物中的亮氨酸和異亮氨酸［13］。此外，基質(zhì)輔助激光解吸電離源內(nèi)裂解與亞穩(wěn)態(tài)原子活化解析質(zhì)譜相結(jié)合也可區(qū)分這兩種氨基酸［14-16］。

高能碰撞誘導(dǎo)解離是通過(guò)將前體離子加速后與碰撞池中的氣體原子或分子進(jìn)行碰撞而實(shí)現(xiàn)離子碎裂。一次碰撞足以引起前體離子電子的激發(fā)，隨后的碰撞會(huì)產(chǎn)生所有可能的斷裂，這在增加串聯(lián)圖譜復(fù)雜性的同時(shí)，也提高了所獲得序列信息的確定性［17］。高能碰撞誘導(dǎo)解離產(chǎn)生的w離子碎片可以區(qū)分亮氨酸和異亮氨酸［18］，但是，由于多肽結(jié)構(gòu)、樣品濃度和儀器條件等因素的影響，有時(shí)觀測(cè)不到w離子。本工作通過(guò)研究亮氨酸和異亮氨酸殘基之間的取代導(dǎo)致的串聯(lián)質(zhì)譜中各碎片離子相對(duì)強(qiáng)度的變化，尋找有可能區(qū)分出亮氨酸和異亮氨酸殘基的新線索。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

4800MALDI-TOF／TOF Analyzer基質(zhì)輔助激光解吸電離-串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀：美國(guó)AB Sciex公司產(chǎn)品；Milli-Q超純水處理系統(tǒng)：美國(guó)Millipore公司產(chǎn)品。

多肽的合成與制備：所有標(biāo)準(zhǔn)肽由強(qiáng)生生物（上海）科技有限公司合成，合成的多肽通過(guò)反相HPLC純化，冷凍干燥，并用分析型HPLC和質(zhì)譜確定所有多肽的純度均在95%以上；α-腈基-4-羥基肉桂酸：美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品，使用前重結(jié)晶，濃度為6g／L。將制備的適量固態(tài)多肽溶解在CH3CN（分析純）與去離子水的溶液（1∶1，V／V）中，最終形成的多肽溶液濃度范圍在100～500nmol／L之間。

1.2 質(zhì)譜條件

所有實(shí)驗(yàn)在MALDI-TOF／TOF 4800質(zhì)譜儀上完成。一級(jí)質(zhì)譜每張譜圖累加800次。在串聯(lián)質(zhì)譜模式中，碰撞誘導(dǎo)解離條件為1keV碰撞能加空氣碰撞，碰撞能為1 000V，二級(jí)加速電壓為15 000V，最大累積激光發(fā)射次數(shù)為2 000次。通過(guò)MS-Product程序確定子離子質(zhì)荷比。

2 結(jié)果與討論

2.1 利用w離子區(qū)分亮氨酸和異亮氨酸多肽同分異構(gòu)體的局限性

目前，肽段斷裂后所產(chǎn)生離子的命名一般采用2009年美國(guó)化學(xué)會(huì)規(guī)定的系統(tǒng)命名法，示于圖1。含有亮氨酸和異亮氨酸殘基的多肽可由w型離子區(qū)分，但也存在一些問(wèn)題，本研究將通過(guò)6組合成的模擬胰蛋白酶水解肽段（以賴(lài)氨酸或精氨酸結(jié)尾）加以說(shuō)明。例如，肽段HKDLYGK和HKDIYGK的MALDI-TOF／TOF串聯(lián)質(zhì)譜圖非常相似，互補(bǔ)的y和b系列離子為優(yōu)勢(shì)斷裂，組氨酸亞胺離子m／z 110.08為基峰，雖然能夠在放大的譜圖上觀察到可以區(qū)分它們的w離子，但是離子強(qiáng)度很低，示于圖2。同樣地，在肽段EQWTEGTIK放大的串聯(lián)質(zhì)譜圖上，可以觀察到wa2離子，但信號(hào)強(qiáng)度很低，示于圖3。為了進(jìn)一步說(shuō)明該問(wèn)題，將所有多肽的w離子相對(duì)強(qiáng)度和信噪比列于表1。

圖1 肽段斷裂離子的系統(tǒng)命名法［14］Fig.1 Nomenclature of peptide fragment ions［14］

圖2 500nmol／L HKDLYGK（a）和500nmol／L HKDIYGK（b）的串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜圖Fig.2 MALDI-TOF／TOF CID spectrumsof 500nmol／L HKDLYGK（a）and 500nmol／L HKDIYGK（b）

表1 12種多肽對(duì)應(yīng)的w離子和它們的相對(duì)強(qiáng)度Table 1 Summary of the observed w ions and their relative intensity for twelve peptides

續(xù)表1

圖3 100nmol/L EQWTEGTIK 的串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜圖（a）和放大圖（b）Fig.3 MALDI-TOF/CID sprctrums of 100 nmol/L EQWTEGTIK (a）and expand region（b）

如表1所示，對(duì)于編號(hào)為5、6、10、11和12的肽段未觀察到相應(yīng)的w離子，在其他肽段的串聯(lián)質(zhì)譜中，wa和wb離子的相對(duì)強(qiáng)度也很低。氨基酸殘基的位置和肽段長(zhǎng)度是影響w離子能否被檢測(cè)到的關(guān)鍵因素。對(duì)于多肽NLPAELQPFETLLAK和NIPAELQPFETIIAK，只能檢測(cè)到wa3、wa4、wb4離子，因?yàn)樗槠x子在高質(zhì)量區(qū)普遍強(qiáng)度較低，在N端第14的位置亮氨酸和異亮氨酸難以區(qū)分。除了相對(duì)較低的強(qiáng)度，利用w離子的另一個(gè)缺點(diǎn)是在低質(zhì)量區(qū)域的其他碎片離子也可能對(duì)w離子的檢測(cè)造成干擾。例如，理論上肽段EQWTEGTLK和EQWTEGTIK可通過(guò)EQWTEGTLK的wa2離子m／z201.12和EQWTEGTIK的wa2離子m／z215.14、wb2離子m／z229.15加以區(qū)分，但是，在這2個(gè)肽段的串聯(lián)質(zhì)譜中均檢測(cè)到了較高強(qiáng)度的m／z215.14離子，來(lái)源于它們的內(nèi)部斷裂離子TI／TL。類(lèi)似地，并不是所有的亮氨酸和異亮氨酸殘基都可以由157nm光解產(chǎn)生的v型和w型離子進(jìn)行區(qū)分［19］。綜上，雖然側(cè)鏈碎片離子可在區(qū)分多肽中的亮氨酸或異亮氨酸時(shí)發(fā)揮重要作用，但其適用性受肽段長(zhǎng)度和序列的限制。

2.2 利用亞銨相關(guān)離子相對(duì)強(qiáng)度區(qū)分亮氨酸和異亮氨酸的多肽異構(gòu)體

相比于亮氨酸，異亮氨酸更易產(chǎn)生亞胺相關(guān)離子m／z69和m／z 41［20］。Armirotti等［14］研究表明，由亮氨酸產(chǎn)生m／z69的亞銨離子需要更多的能量，即亮氨酸亞銨離子必須克服＋305.4J／mol的能壘完成重排，并克服147.3J／mol失去氨，而異亮氨酸則只需要＋219.7J／mol的能壘完成重排，＋76.6J／mol進(jìn)一步產(chǎn)生m／z41離子［14］。在串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜中該規(guī)律同樣適用。對(duì)m／z41和m／z69離子的相對(duì)強(qiáng)度進(jìn)行總結(jié)，發(fā)現(xiàn)在含有異亮氨酸的多肽串聯(lián)質(zhì)譜中，m／z41和m／z 69亞銨離子的相對(duì)強(qiáng)度均高于相對(duì)應(yīng)的含有亮氨酸的多肽，結(jié)果列于表2。但在本研究中，當(dāng)肽段長(zhǎng)度大于10個(gè)氨基酸時(shí)，就不會(huì)產(chǎn)生m／z69亞胺離子，因此，該判據(jù)也有一定的局限性。

表2 12個(gè)肽段4種亞胺相關(guān)離子的相對(duì)強(qiáng)度Table 2 The relative intensities of four kinds of immonium related ions of Leu／Ile for twelve peptides

2.3 利用b和y系列離子的相對(duì)強(qiáng)度區(qū)分亮氨酸和異亮氨酸同分異構(gòu)多肽

由于亮氨酸和異亮氨酸的同分異構(gòu)體是在相同的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析的，所以離子強(qiáng)度的差異應(yīng)來(lái)源于這兩種氨基酸之間的取代所導(dǎo)致的多肽結(jié)構(gòu)的微小差別。肽段5～12的串聯(lián)質(zhì)譜各碎片離子的相對(duì)強(qiáng)度示于圖4。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)于肽段1～6和11～12，大多數(shù)肽段肽裂解產(chǎn)生含異亮氨酸離子的相對(duì)豐度明顯高于亮氨酸異構(gòu)體，因此認(rèn)為該特征可以用來(lái)區(qū)分這兩種氨基酸殘基。例如，在圖2中，HKDIYGK的b3、b4離子的相對(duì)強(qiáng)度明顯高于HKDLYGK所產(chǎn)生的b3、b4離子。特別是在肽段FLQPGSPR的串聯(lián)質(zhì)譜中，母離子m／z901.2為基峰，其他碎片離子的強(qiáng)度也較高；而在肽段FIQPGSPR的串聯(lián)質(zhì)譜中，m／z 70.08離子為基峰，其質(zhì)譜圖示于圖5。對(duì)于肽段7～10，其碎片離子的相對(duì)強(qiáng)度相差較小，然而，正如上面所提到的，肽段EQWTEGTLK 和EQWTEGTIK可通過(guò)m／z41和m／z69離子區(qū)分，在肽段LHYFNARGR的串聯(lián)質(zhì)譜中也檢測(cè)到了wa9離子。對(duì)于性質(zhì)非常相近的肽段，例如含有IL或LI殘基的肽段，雖然預(yù)期各碎片離子強(qiáng)度可能很相近，但仍需w離子進(jìn)行區(qū)分。

2.4 TOF／TOF譜形狀的相對(duì)穩(wěn)定性

高能碰撞誘導(dǎo)解離譜圖被認(rèn)為具有較好的重復(fù)性，這是由于前體離子具有很高的動(dòng)能，與

圖4 肽段HQDLL／IIYGK（a），EQWTEGTL／IK（b），L／IHYFNARGR（c），NL／IPAELQPFETLL／IIAK（d）各主要子離子的相對(duì)強(qiáng)度Fig.4 The relative intensities of the main product ions of HQDLL／IIYGK（a），EQWTEGTL／IK（b），L／IHYFNARGR（c）and NL／IPAELQPFETLL／IIAK（d）

千電子伏前體離子的能量相比，碰撞過(guò)程中氣體原子的動(dòng)能可以忽略不計(jì)。這意味著，在相同的碰撞條件下，碰撞氣種類(lèi)、氣體壓力和溫度的變化不會(huì)明顯影響離子分布［17］。Vestal和Campbell指出TOF／TOF高CID的動(dòng)態(tài)范圍在典型的實(shí)驗(yàn)條件下為3個(gè)數(shù)量級(jí)［21］。在一定程度上，離子強(qiáng)度也可以被看作是串聯(lián)質(zhì)譜的本質(zhì)特征，因?yàn)樽与x子的產(chǎn)生概率與肽結(jié)構(gòu)是高度相關(guān)的。因此，離子強(qiáng)度信息可以改善從頭測(cè)序的準(zhǔn)確性［22］，MALDI-TOF／TOF可以檢測(cè)到多肽中的D-氨基酸［23］。離子的性質(zhì)決定了最有利的解離通道［24］，即串聯(lián)質(zhì)譜的本質(zhì)依賴(lài)于蛋白質(zhì)的氨基酸組成［25］，但目前尚未見(jiàn)用離子強(qiáng)度區(qū)分亮氨酸和異亮氨酸殘基的報(bào)道。

圖5 100nmol／L FLQPGSPR（a）和100nmol／L FIQPGSPR（b）的串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜圖Fig.5 MALDI-TOF／TOF CID spectrums of 100nmol／L FLQPGSPR（a）and 100nmol／L FIQPGSPR（b）

3 結(jié)論

由于蛋白質(zhì)序列的多樣性，很難找到一個(gè)通用的標(biāo)準(zhǔn)從TOF／TOF譜中直接確定亮氨酸或異亮氨酸。本研究表明，亮氨酸和異亮氨酸殘基同分異構(gòu)體的差異有可能體現(xiàn)在碎片離子的相對(duì)強(qiáng)度上。這種方法的缺點(diǎn)是需要合成肽段比較差異性，并且不適于大規(guī)模數(shù)據(jù)分析。

［1］ PEVTSOV S，F(xiàn)EDULOVA I，MIRZAEI H，et al.Performance evaluation of existing de novo sequencing algorithms［J］.Journal of Proteome Research，2006，5（11）：3 018-3 028.

［2］ MENSCHAERT G，VANDEKERCKHOVE T T M，BAGGERMAN G，et al.A Hybrid，de novo based，genome-wide database search approach applied to the sea urchin neuropeptidome［J］.Journal of Proteome Research，2010，9（2）：990-996.

［3］ SHEVCHENKO A，SUNYAEV S，LOBODO A，et al.Charting the proteomes of organisms with unsequenced genomes by MALDI-quadrupole timeof-flight mass spectrometry and BLAST homology searching［J］.Analytical and Bioanalytical Chemistry，2001，73（9）：1 917-1 926.

［4］ SIMEONOVA D D，SUSNEA L S，MOISE A， et al.“Unknown Genome”proteomics：A new NAD（P）-dependent epimerase／dehydratase revealed by N-terminal sequencing，inverted PCR，and high resolution mass spectrometry［J］.Molecular ＆Cellular Proteomics，2009，8（1）：122-131.

［5］ WIELSCH N W，THOMAS H，SURENDRANATH V，et al.De novo sequencing of peptides from the parotid secretion of the cane toad，Bufo marinus（Rhinella marina）［J］.Journal of Proteome Research，2006，57（2）：2 448-2 456.

［6］ BROWN A C，MOSS S R，WILSON Z A，et al.An isoleucine to leucine substitution in the ACCase of Alopecurus myosuroides（blackgrass）is associated with resistance to the herbicide sethoxydim Pestic［J］.Pesticide Biochemistry and Physiology，2002，72（3）：160-168.

［7］ WILLIMS J P，CREESE A J，ROPER D R，et al.Hot electron capture dissociation distinguishes leucine from isoleucine in a novel hemoglobin variant，Hb Askew，β54（D5）Val→Ile［J］.Journal of the American Society for Mass Spectrometry，2009，20（9）：1 707-1 713.

［8］ LI M Y，WANG I X，LI Y，et al.Widespread RNA and DNA sequence differences in the human transcriptome［J］.Science，2011，333（6 074）：53-58.

［9］ ARMIROTTI A，MILLO E，DAMONATE G，et al.How to discriminate between Leucine and isoleucine by low energy ESI-TRAP MSn［J］.Journal of the American Society for Mass Spectrom，2007，18（7）：57-63.

［10］KRISHNA P，PRABHAKAR S，VAIRAMANI M.Differentiation of derivatized leucine and isoleucine bt tandem mass spectrometry under liquid secondary ion mass spectral conditions［J］.Rapid Communications in Mass Spectrometry，1998，12 （20）：1 429-1 434.

［11］HULST A G，KIENTZ C E.Differentiation between the isomeric amino acids leucine and isoleucine using low-energy collosion-induced dissociation tandem mass spectrometry［J］.Journal of Mass Spectrom，1996，31（10）：1 188-1 190.

［12］ARMIROTTI A，SCAPOLLA C，BENATTI U，et al.Electrospray ionization ion trap multiplestage mass spectrometric fragmentation pathways of leucine and isoleucine：An ab initio computational study［J］.Rapid Communications in Mass Spectrometry，2007，21（19）：3 180-3 184.

［13］WU L M，LEMR K，AGGERHOLM T，et al.Recognition and quantification of binary and ternary mixtures of isomeric peptides by the kinetic method：Metal ion and ligand effects on the dissociation of metal-bound complexes［J］.Journal of the American Society for Mass Spectrometry，2003，14（2）：152-160.

［14］SOLTWISCH J，DREISEWERD K.Discrimination of isobaric leucine and isoleucine residues and analysis of post-translational modifications in peptides by MALDI in-source decay mass spectrometry combined with collisional cooling［J］.Analytical and Bioanalytical Chemistry，2010，82 （13）：5 628-5 635.

［15］COOK S L，COLLIN O L，JACKSON G P.Metastable atom-activated dissociation mass spectrometry：Leucine／isoleucine differentiation and ring cleavage of praline residues［J］.Journal of Mass Spectrom，2009，44（8）：1 211-1 223.

［16］LEE S S，LIM J，TAN S，et al.Accurate MALDI-TOF／TOF sequencing of one-bead-one-compound peptide libraries with application to the identification of multiligand protein affinity agents using in situ click chemistry screening［J］.Analytical and Bioanalytical Chemistry，2010，82 （2）：672-679.

［17］EKMAN R，SILBERRING J，WESTMANBRINKMALM A，et al.Mass spectrometry instrumentation，interpretation，and applications ［J］.Hoboken，NJ，USA：John Wiley ＆Sons，INC，2008，89-103.

［18］HUANG L，BALDWIN M A，MALTBY D A，et al.The identification of protein-protein interactions of the nuclear pore complex of Saccharomyces cerevisiae using high throughput matrixassisted laser desorption ionization time-of-flight tandem mass spectrometry［J］.Molecular ＆Cellular Proteomics，2002，1（6）：434-450.

［19］ZHANG L Y，REILLY J P.Peptide de novo sequencing using 157nm photodissociation in a tandem time-of-flight mass spectrometer［J］.Analytical and Bioanalytical Chemistry，2010，82 （3）：898-908.

［20］GOGICHAEVA N V，WILLIAMS T，ALTERMAN M A.MALDI TOF／TOF tandem mass spectrometry as a new tool for amino acid analysis ［J］.Journal of the American Society for Mass Spectrometry，2007，18（2）：279-284.

［21］VESTAL M L，CAMPBELL J M.Tandem timeof-flight mass spectrometry［J］.Methods in Enzymology，2005，402：79-108.

［22］KANAZAWA M，ANYOJI H，OGIWARA A，et al.De novo peptide sequencing using ion peak intensity and amino acid cleavage intensity ratio ［J］.Bioinformatics，2007，23（9）：1 068-1 072.

［23］SACHON E，CLODIC G，GALANTH C，et al.D-amino acid detection in peptides by MALDITOF-TOF［J］.Analytical and Bioanalytical Chemistry，2009，81（11）：4 389-4 396.

［24］MCLUCKEY S A，MENTINOVA.M.Ion／neutral，ion／electron，ion／photon，and ion／ion interactions in tandem mass spectrometry：Do we need them all？Are they enough？［J］.Journal of the American Society for Mass Spectrometry，2011，22（1）：3-12.

［25］MEDZIHRADSZKY K F，CAMPBELL J M，BALDWIN M A，et al.The characteristics of peptide collision-induced dissociation using a high-performance MALDI-TOF／TOF tandem mass spectrometer［J］.Analytical and Bioanalytical Chemistry，2000，72（3）：552-558.

Differentiation of Leucine and Isoleucine Residues Using Relative Intensities of Fragment Ions of MALDI-TOF／TOF

WANG Yong1，GAO Sheng2，LI Shui-ming1
（1.Shenzhen Key Laboratory of Marine Bioresources and Ecology，College of Life Science，Shenzhen University，Shenzhen518060，China；2.Shenzhen Key Laboratory of Microbial Genetic Engineering，College of Life Science，Shenzhen University，Shenzhen518060，China）

Differentiation of leucine（Leu）and isoleucine（Ile）is a difficult problem for de novo peptide sequencing.There is a general agreement that backbone cleavage is not capable of discriminating Leu and Ile residues and w-type ions produced by MALDITOF／TOF high energy collision-induced dissociation（CID）can provide distinguishable information.The experiment based on six pairs of tryptic-like isomeric peptides which contain 7to 15residues，showed that w ions were not always can be observed，while the displacement between Leu and Ile will lead to the change of relative abundance of immonium ions，internal fragment ions，b-and y-types of ions，the degree of changes depends on peptide composition and Leu／Ile position.Therefore，it is possible to distinguish Leu from Ile by comparing the relative intensities of the fragment ions of MALDI-TOF／TOF high energy CID spectra.

de novo peptide sequencing；MALDI-TOF／TOF；Leucine；Isoleucine

O657.63

A

1004-2997（2015）04-0302-08

10.7538／zpxb.youxian.2015.0012

2014-07-08；

修回日期：2014-08-28

王 勇（1970—），男（漢族），吉林人，副教授，從事生物質(zhì)譜分析研究。E-mail：wyong＠szu.edu.cn

時(shí)間：2015-01-30

；

http：∥www.cnki.net／kcms／detail／11.2979.TH.20150130.1553.012.html