朱培曦，賈 飛，陳 悅，陸靜嫻，潘芳芳，李會(huì)林，鄭金琪，蔣可志，林 瓊（.浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院，浙江杭州 0004；.杭州師范大學(xué)有機(jī)硅重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州 ；.浙江工業(yè)大學(xué)化學(xué)工程與材料學(xué)院，浙江杭州 004）

兩對(duì)頭孢菌素類抗生素異構(gòu)體的質(zhì)譜識(shí)別研究

朱培曦1，賈 飛1，陳 悅1，陸靜嫻1，潘芳芳1，李會(huì)林1，
鄭金琪1，蔣可志2，林 瓊3
（1.浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院，浙江杭州 310004；2.杭州師范大學(xué)有機(jī)硅重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州 311121；
3.浙江工業(yè)大學(xué)化學(xué)工程與材料學(xué)院，浙江杭州 310014）

采用電噴霧四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)對(duì)頭孢他啶及Δ3異構(gòu)體，頭孢曲松Z／E異構(gòu)體進(jìn)行了分析研究，并使用離子阱質(zhì)譜技術(shù)對(duì)頭孢他啶的碎裂途徑進(jìn)行了確認(rèn)。頭孢他啶質(zhì)子化離子容易丟失CO或CO2而形成碎片離子m／z440、424、396；由于雙鍵與六元環(huán)上硫原子相連，頭孢他啶Δ3異構(gòu)體容易發(fā)生開環(huán)反應(yīng)，產(chǎn)生特征碎片離子m／z313。頭孢曲松Z異構(gòu)體中，酰胺鍵氮上的氫容易與肟基上的氧原子形成分子內(nèi)氫鍵，所對(duì)應(yīng)的碎片離子m／z324較穩(wěn)定，豐度較高；而頭孢曲松E異構(gòu)體中，酰胺鍵氮上的氫卻與肟基上的N原子形成分子內(nèi)氫鍵，促進(jìn)其進(jìn)一步發(fā)生丟失甲氧基碎裂，形成碎片離子m／z293和m／z112。上述特征碎裂可用于這兩類異構(gòu)體的質(zhì)譜識(shí)別，也可為類似樣品中異構(gòu)體雜質(zhì)的分離鑒定提供數(shù)據(jù)支持。

頭孢他啶；頭孢曲松；異構(gòu)體區(qū)分；質(zhì)譜識(shí)別；正離子

頭孢菌素是一類廣譜半合成抗生素，具有抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)、療效高、耐酸、耐堿、耐β-內(nèi)酰胺酶、低致敏、副作用小等優(yōu)點(diǎn)［1-3］。頭孢他啶和頭孢曲松為第三代頭孢菌素，在耐β-內(nèi)酰胺酶、抗革蘭陰性菌及抗菌譜等方面的性能比第二代更優(yōu)越。由于在合成或保存過程中，頭孢菌素類藥物容易產(chǎn)生各種異構(gòu)體雜質(zhì)，如Δ3異構(gòu)體和順反異構(gòu)體等［4］，而異構(gòu)體雜質(zhì)與藥物主成分的結(jié)構(gòu)較為接近，是藥品中雜質(zhì)鑒定的難點(diǎn)，因此，通過對(duì)異構(gòu)體雜質(zhì)裂解規(guī)律的總結(jié)，可以為未知雜質(zhì)結(jié)構(gòu)的推導(dǎo)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

自20世紀(jì)80年代以來，人們就一直嘗試使用質(zhì)譜技術(shù)對(duì)異構(gòu)體分子進(jìn)行鑒定和區(qū)分［5-6］，且隨著軟電離技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了許多使用電噴霧質(zhì)譜技術(shù)對(duì)各種異構(gòu)體進(jìn)行區(qū)分的報(bào)道［7-15］。頭孢菌素類藥物是廣泛使用的抗生素藥物，已有文獻(xiàn)對(duì)其質(zhì)譜裂解行為進(jìn)行了總結(jié)［16-19］，并且嘗試對(duì)鹽酸頭孢吡肟、鹽酸頭孢甲肟、頭孢泊肟酯等藥物的Z／E異構(gòu)體或Δ2／Δ3異構(gòu)體進(jìn)行鑒定［20-22］。

頭孢丙烯和中間體7-氨基-3-丙烯基-4-頭孢烷酸（7-APRA）的裂解規(guī)律已有報(bào)道［23］。頭孢他啶的Δ2／Δ3異構(gòu)體和頭孢曲松的Z／E異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)式示于圖1。本工作擬采用四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)對(duì)其進(jìn)行區(qū)分，旨為直接使用液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)分離鑒定類似樣品中的異構(gòu)體雜質(zhì)提供數(shù)據(jù)支持。

圖1 頭孢他啶（a）、頭孢他啶Δ3異構(gòu)體（b）、頭孢曲松（c）和頭孢曲松E異構(gòu)體（d）的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of ceftazidime（a），Δ3isomer（b），ceftriaxone（c）and ceftriaxone E isomer（d）

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

6538四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀、6320離子阱質(zhì)譜儀：美國Agilent公司產(chǎn)品；KDS-100-CE流動(dòng)注射泵：美國KD Scientific公司產(chǎn)品。

頭孢他啶和頭孢曲松對(duì)照品：由中國食品

藥品檢定研究院提供；頭孢他啶Δ3異構(gòu)體和頭孢曲松E異構(gòu)體：美國藥典標(biāo)準(zhǔn)品；甲醇（色譜純）：美國Merck公司產(chǎn)品；超純水：美國Millipore公司產(chǎn)品。

1.2 質(zhì)譜條件

1.2.1 四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀 電噴霧離子源，正離子模式，毛細(xì)管電壓4 000V，毛細(xì)管溫度300℃，霧化氣壓力241.325kPa，干燥氣流速600L／h，質(zhì)量掃描范圍m／z 50～1 000，碰撞氣為N2，流動(dòng)泵進(jìn)樣速度180μL／h。質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集模式為Extended Dynamic Range （2GHz），正離子模式下，m／z 121.050 8和m／z922.009 8作為內(nèi)標(biāo)離子，實(shí)時(shí)對(duì)樣品測(cè)定結(jié)果進(jìn)行校正；LC／MS數(shù)據(jù)采用Mass Hunter Qualitative Analysis B.04.00軟件分析。

1.2.2 離子阱質(zhì)譜儀 電噴霧離子源，正離子模式，毛細(xì)管電壓4 000V，毛細(xì)管溫度250℃，霧化氣壓力206.85kPa，干燥氣流速600L／h，質(zhì)量掃描范圍m／z 50～1 000，碰撞氣為He，流動(dòng)泵進(jìn)樣速度500μL／h。

1.3 樣品處理

精密稱取各對(duì)照品0.010g，置于200mL

容量瓶中，用50%甲醇溶解并稀釋至刻度，經(jīng)0.45μm濾膜過濾，作為測(cè)試溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 頭孢他啶及其Δ3異構(gòu)體的質(zhì)譜區(qū)分研究

正離子模式下，頭孢他啶及其Δ3異構(gòu)體的二級(jí)質(zhì)譜圖示于圖2。頭孢他啶經(jīng)電噴霧電離容易形成質(zhì)子化離子［A＋H］＋（m／z 547），其二級(jí)質(zhì)譜圖示于圖2a，其中基峰離子m／z 468是由母離子［A＋H］＋失去一分子吡啶形成的。碎片離子m／z 468可進(jìn)一步丟失一分子CO或CO2，形成二級(jí)碎片離子m／z 440或m／z424；碎片離子m／z 396可由二級(jí)離子m／z440丟失一分子CO2或由二級(jí)離子m／z424丟失一分子CO形成；碎片離子m／z 396可再丟失一分子NH3和一分子末端羧基基團(tuán)形成碎片離子m／z 277；碎片離子m／z 167則可由碎片離子m／z396斷裂羰基與肟基相連的單鍵形成。頭孢他啶的碎裂途徑示于圖3，該斷裂方式與文獻(xiàn)報(bào)道的一致［24］，并采用多級(jí)質(zhì)譜進(jìn)行確證，示于圖4。同時(shí)，上述碎片離子的元素組成均得到高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)的確證，結(jié)果列于表1。

在頭孢他啶Δ3異構(gòu)體的二級(jí)質(zhì)譜圖中，［B＋H］＋同樣容易丟失一分子吡啶形成碎片離子m／z468（基峰），示于圖2b。與［A＋H］＋不同的是，［B＋H］＋在碎裂過程中不易產(chǎn)生碎片離子m／z 440、424和396，卻容易形成碎片離子m／z313，該特征碎裂可作為這對(duì)異構(gòu)體的質(zhì)譜識(shí)別。在［B＋H］＋結(jié)構(gòu)中，六元環(huán)上的雙鍵與S原子相連，碎片離子a（m／z468）在正電荷的誘導(dǎo)下發(fā)生六元環(huán)的開環(huán)反應(yīng)形成異構(gòu)體b；由于羧基官能團(tuán)上羰基氧原子親核進(jìn)攻，結(jié)構(gòu)b發(fā)生閉環(huán)反應(yīng)形成異構(gòu)體c；并繼續(xù)發(fā)生質(zhì)子遷移形成結(jié)構(gòu)d；由于電荷誘導(dǎo)，相鄰的酰胺O發(fā)生閉環(huán)反應(yīng)產(chǎn)生結(jié)構(gòu)e；由于芳構(gòu)化作用，結(jié)構(gòu)e發(fā)生四元環(huán)開環(huán)反應(yīng)產(chǎn)生碎片離子m／z313。由此可見，Δ3異構(gòu)體結(jié)構(gòu)中的雙鍵與硫原子相連，從而引發(fā)形成碎片離子m／z 313的特征碎裂反應(yīng)，其裂解途徑示于圖5。根據(jù)譜圖中特征碎裂離子的顯著差異，這對(duì)異構(gòu)體的質(zhì)譜識(shí)別可以實(shí)現(xiàn)。

圖2 四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀采集的頭孢他啶（a）及其Δ3異構(gòu)體（b）準(zhǔn)分子離子的MS2質(zhì)譜圖（12V）Fig.2 MS2 spectra of protonated ceftazidime（a）andΔ3isomer（b）acquired by Q-TOF MS（12V）

圖3 頭孢他啶可能的碎裂途徑Fig.3 Possible fragmentation pathways of ceftazidime

表1 頭孢他啶和頭孢曲松的高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)Table 1 Accurate mass measurements of ceftazidime and ceftriaxone

續(xù)表1

圖4 離子阱質(zhì)譜儀采集的頭孢他啶準(zhǔn)分子離子的MSn質(zhì)譜圖Fig.4 MSn spectra of protonated ceftazidime acquired by ion trap MS

圖5 頭孢他啶Δ3異構(gòu)體（m／z 313）可能的裂解途徑Fig.5 Possible fragmentation pathways of ceftazidimeΔ3isomer（m／z 313）

2.2 頭孢曲松Z／E異構(gòu)體的質(zhì)譜區(qū)分研究

電噴霧正離子模式下，頭孢曲松Z／E異構(gòu)體的二級(jí)質(zhì)譜圖示于圖6。頭孢曲松容易產(chǎn)生質(zhì)子化離子［C＋H］＋，其二級(jí)質(zhì)譜圖示于圖6a，母離子［C＋H］＋（m／z 555）容易發(fā)生C—S鍵斷裂而形成碎片離子m／z 396（基峰）。與頭孢他啶類似，頭孢曲松的碎片離子m／z 396分別丟失一分子CO或CO2，形成二級(jí)碎片離子m／z368或m／z352；而三級(jí)碎片離子m／z324則由離子m／z 368丟失一分子CO2或由離子m／z352丟失一分子CO形成，裂解途徑示于圖7a。上述碎片離子的化學(xué)式均得到高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)的確證，結(jié)果列于表1。

對(duì)比頭孢曲松Z／E異構(gòu)體的二級(jí)質(zhì)譜圖可以發(fā)現(xiàn)，Z異構(gòu)體［C＋H］＋在碎裂過程中容易形成碎片離子m／z 324，E異構(gòu)體［D＋H］＋卻容易形成碎片離子m／z 293和m／z 112，因此二者異構(gòu)體可實(shí)現(xiàn)質(zhì)譜區(qū)分，其二級(jí)質(zhì)譜圖示于圖6b。其中，E異構(gòu)體中的碎片離子m／z 293可以由碎片離子m／z324進(jìn)一步丟失甲氧基自由基產(chǎn)生。在Z異構(gòu)體結(jié)構(gòu)中，酰胺鍵的氮原子上的H原子容易與肟基上的O原子形成較穩(wěn)定的分子內(nèi)氫鍵（六元環(huán)），故碎片離子m／z324較穩(wěn)定，相對(duì)豐度較高；而在E異構(gòu)體結(jié)構(gòu)中，酰胺鍵的氮原子上的H原子卻與肟基上的N原子形成分子內(nèi)氫鍵（五元環(huán)），故進(jìn)一步促進(jìn)了碎片離子m／z 324丟失甲氧基，形成相對(duì)豐度較高的碎片離子m／z 293，其裂解途徑示于圖7b。上述區(qū)分與頭孢吡肟Z／E異構(gòu)體的相似［20］。

圖6 四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀采集的頭孢曲松Z異構(gòu)體（a）和E異構(gòu)體（b）準(zhǔn)分子離子的MS2質(zhì)譜圖（10V）Fig.6 MS2 spectra of protonated ceftriaxone Z isomer（a）and E isomer（b）acquired by Q-TOF MS（10V）

圖7 頭孢曲松Z異構(gòu)體（a）和E異構(gòu)體（b）準(zhǔn)分子離子可能的碎裂途徑Fig.7 Possible fragmentation pathways of protonated ceftriaxone Z isomer（a）and E isomer（b）

3 結(jié)論

本工作采用四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)對(duì)頭孢他啶及其Δ3異構(gòu)體，以及頭孢曲松Z／E異構(gòu)體進(jìn)行碎裂研究，并使用離子阱質(zhì)譜技術(shù)對(duì)頭孢他啶的碎裂途徑進(jìn)行驗(yàn)證。由于雙鍵位置產(chǎn)生移動(dòng)，導(dǎo)致了頭孢他啶及其Δ3異構(gòu)體六元環(huán)穩(wěn)定性的差異，產(chǎn)生了各自特征的質(zhì)譜碎裂模式。頭孢曲松Z／E異構(gòu)體可以形成不同的分子內(nèi)氫鍵，導(dǎo)致碎片離子的穩(wěn)定性不同，且區(qū)分較為明顯。上述結(jié)果表明，由于空間結(jié)構(gòu)不同，導(dǎo)致頭孢菌素異構(gòu)體的裂解方式或難易程度不同，從而在二級(jí)質(zhì)譜圖中表現(xiàn)出明顯的差異。因此，可以使用質(zhì)譜技術(shù)對(duì)異構(gòu)體進(jìn)行有效地區(qū)分，該結(jié)果也可為類似樣品中異構(gòu)體雜質(zhì)的分離鑒定提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。

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Differentiation of Two Pairs
of Cephalosporins Isomers by Mass Spectrometry

ZHU Pei-xi1，JIA Fei1，CHEN Yue1，LU Jing-xian1，PAN Fang-fang1，LI Hui-lin1，ZHENG Jin-qi1，JIANG Ke-zhi2，LIN Qiong3
（1.Zhejiang Institute for Food and Drug Control，Hangzhou310004，China；
2.Key Laboratory of Organosilicon Chemistry and Material Technology，Hangzhou Normal University，Hangzhou311121，China；3.College of Chemistry Engineering and Material Science，Zhejiang University of Technology，Hangzhou310014，China）

Two pairs of cephalosporins isomers，includingΔ2／Δ3isomer of ceftazidime and Z／E isomer of ceftriaxone，were discriminated by electrospray quadrupole-time-offlight mass spectrometry（ESI-Q-TOF MS）.In addition，the fragmentation characters of cephalosporins were identified by ion trap mass spectrometry.The protonated ceftazi-dime is found to facilely undergo fragmentation vialosing CO or CO2to afford the fragment ions at m／z440，424and 396；in contrast，fragmentation of itsΔ3isomer readily leads to the fragment ion at m／z313 viathe ring-opening reaction initiated by the positive charge on the double bond.For the protonated ceftriaxone，the amide group is facile to interact with the oxygen atom of the oxyimino group viaan intramolecular hydrogen bond in the structure of the Z isomer，thereby its fragment ion at m／z 324shows high abundance.Whereas，there is an intramolecular hydrogen bond between the amide group and the nitrogen atom of the oxyimino group in the structure of its E isomer，which facilitates the loss of methoxyl group to form the fragment ions at m／z 293and m／z112.These different fragmentation patterns can be used to discriminate the two pairs of isomers.This work can also contribute to differentiation and characterization of the potential isomeric impurities of cephalosporins.

ceftazidime；ceftriaxone；isomer differentiation；mass spectrometry；positive ions

O657.63

A

1004-2997（2015）04-0350-09

10.7538／zpxb.youxian.2015.0021

2014-09-04；

修回日期：2014-10-26

國家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（21205025）；浙江省科技廳分析測(cè)試科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013C37055，2014C37059）資助

朱培曦（1984—），男（漢族），浙江杭州人，主管藥師，從事化學(xué)藥品質(zhì)量研究工作。E-mail：zhpx110＠126.com

蔣可志（1980—），男（漢族），浙江永嘉人，副研究員，從事有機(jī)質(zhì)譜研究工作。E-mail：jiangkezhi＠hznu.edu.cn

時(shí)間：2015-05-26；

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：∥www.cnki.net／kcms／detail／11.2979.TH.20150526.0905.005.html