李英滋，張 宇，王道安，董解榮，王子申，張成林, ，陳 寧

(1. 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2. 菱花集團(tuán)有限公司，濟(jì)寧 272073)

4-羥基異亮氨酸為 L-異亮氨酸羥化物，具有血糖水平依賴的促進(jìn)胰島素分泌的特性以及促進(jìn)脂肪代謝等功能，對(duì)糖尿病具有良好的治療效果，具有廣闊的應(yīng)用前景[1-6]．目前 4-羥基異亮氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)主要采用胡蘆巴種子提取法，然而此方法生產(chǎn)效率低(約 0.015%)，致使生產(chǎn)規(guī)模小、產(chǎn)量低、成本高，嚴(yán)重限制了其應(yīng)用[7-10]．此外，化學(xué)合成法因在生產(chǎn)過程中使用產(chǎn)生乙醛等有毒或易爆物，且存在提取收率低等不足，仍停留在實(shí)驗(yàn)室研究階段[9-12]．Kodera等[9]在蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis)中發(fā)現(xiàn)了由 ido編碼的異亮氨酸羥化酶(isoleucine dioxygenase，IDO)，該酶能夠以 L-異亮氨酸、α-酮戊二酸及氧氣為底物催化生成 4-羥基異亮氨酸、琥珀酸和二氧化碳(圖1[9])，為其生物合成提供重要基礎(chǔ)．

圖1 異亮氨酸羥化酶催化生成 4-羥異亮氨酸的反應(yīng)示意圖Fig. 1 IDO catalyzing 4-hydroxyisoleucine synthesis

Kivero等[12]將異亮氨酸羥化酶編碼基因 ido轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，并在發(fā)酵過程中添加 L-異亮氨酸，實(shí)現(xiàn)前體物添加法合成 4-羥基異亮氨酸，優(yōu)化條件下產(chǎn)量為 163.0mmol/L；但該方法存在 L-異亮氨酸被額外消耗及耗糖高等不足．Shi等[13-15]利用谷氨酸棒桿菌過表達(dá)ido，在優(yōu)化條件下經(jīng)144h發(fā)酵，最高產(chǎn)量達(dá)到95.7mmol/L；但該方法發(fā)酵周期長(zhǎng)，產(chǎn)酸水平較低．本課題組在前期研究[16-17]中從蘇云金芽胞桿菌B. thuringiensis TCCC 11826中克隆出ido(Accession No. KC884243)，利用該基因建立了微生物轉(zhuǎn)化法 4-羥基異亮氨酸合成體系，然而該方法產(chǎn)量較低(36h生成 44.6mmol/L)．此外，在轉(zhuǎn)化過程中底物L(fēng)-異亮氨酸和α-酮戊二酸額外消耗嚴(yán)重，致使其轉(zhuǎn)化率偏低(89.3%)．本文針對(duì)上述問題，建立了靜息細(xì)胞法合成 4-羥基異亮氨酸體系，并對(duì)催化條件進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)其高效合成．

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

本文所用大腸桿菌Escherich coli BL21(DE3)以及質(zhì)粒pXMJ-IDO和pET-28a均由本實(shí)驗(yàn)室保藏．

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：胰化蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，pH 7.0～7.5，121℃高壓蒸汽滅菌20min[18].

1.1.3 主要試劑

限制性內(nèi)切酶、連接酶、DNA聚合酶等分子生物學(xué)試劑，寶生物工程(大連)有限公司；PCR產(chǎn)物回收、質(zhì)粒提取等試劑盒，北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司；4-羥基異亮氨酸、L-異亮氨酸及α-酮戊二酸標(biāo)準(zhǔn)品，美國(guó)Sigma 公司．

1.2 方法

1.2.1 ido過表達(dá)菌株E. coli pET-ido的構(gòu)建

以含ido基因的重組質(zhì)粒pXMJ-IDO為模板，利用引物 ido-A：CCGCATATGATGAAAATGAGTGG CTTTAGCATAG(NdeⅠ)和 ido-B：CCGCTCGAGT TATTTTGTCTCCTTATAAGAAAATGTTACTA(XhoⅠ)，擴(kuò)增 ido基因，經(jīng) NdeⅠ和 XhoⅠ酶切、回收后連接至經(jīng)相同酶切的表達(dá)載體 pET-28a，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 E. coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞．轉(zhuǎn)化子經(jīng)菌落 PCR初步鑒定、活化后，提取重組質(zhì)粒，分別利用 NdeⅠ以及 NdeⅠ和 XhoⅠ進(jìn)行單、雙酶切驗(yàn)證，并由蘇州金唯智生物科技有限公司測(cè)定質(zhì)粒中 ido序列．分別將重組質(zhì)粒和重組菌株命名為pET-ido和E. coli pET-ido．

1.2.2 重組IDO誘導(dǎo)表達(dá)及靜息細(xì)胞的培養(yǎng)和收集

將E. coli pET-ido于含100μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中活化后，接種至 1L相同培養(yǎng)基，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)至A600為0.6～0.8時(shí)，加入IPTG(終濃度為 0.1mmol/L)，繼續(xù)培養(yǎng) 4h，4℃、5000g離心 30min，收集菌體．取少量菌體超聲破碎后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測(cè)[18]．菌體經(jīng)生理鹽水清洗3次后，－80℃放置12h，即為靜息細(xì)胞．待催化反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液 5000g離心30min，回收菌體并用生理鹽水清洗，稱量后重復(fù)利用．

1.2.3 靜息細(xì)胞法合成 4-羥基異亮氨酸的建立及條件優(yōu)化

取靜息細(xì)胞(終質(zhì)量濃度為20g/L)置于3L反應(yīng)體系中，37℃反應(yīng) 16h．反應(yīng)體系為：100mmol/L Tris-HCl(pH 7.0)，200mmol/L L-異亮氨酸和α-酮戊二酸，5mmol/L FeSO4，10mmol/L 維生素 C(VC)．進(jìn)行反應(yīng)條件優(yōu)化時(shí)，根據(jù)需要改變相應(yīng)條件．在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)L9(34)對(duì)催化條件進(jìn)一步優(yōu)化．

1.2.4 L-異亮氨酸、4-羥基異亮氨酸和α-酮戊二酸的檢測(cè)

取反應(yīng)液1mL，5000g離心1min后取上清液，經(jīng)適當(dāng)稀釋后采用 2，4-二硝基氟苯柱前衍生高效液相色譜法測(cè)定 L-異亮氨酸和 4-羥基異亮氨酸濃度．檢測(cè)條件：安捷倫 C18色譜柱(150mm×4.6mm，3.5μm)，采用體積分?jǐn)?shù) 50%乙腈/50mmol/L乙酸鈉為流動(dòng)相梯度洗脫，流量 1mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)360nm，柱溫 33℃[16]．α-酮戊二酸檢測(cè)條件：伯樂Aminex HPX-87H色譜柱(300mm×7.8mm，9μm)，流動(dòng)相 5mmol/L H2SO4，流量 0.5mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng) 215nm，柱溫 30℃[19]．按式(1)—式(3)計(jì)算 3種物質(zhì)的濃度(mmol/L)．

式中：S為利用高效液相色譜儀測(cè)定的 L-異亮氨酸、4-羥基異亮氨酸和α-酮戊二酸的峰面積．

1.2.5 4-羥基異亮氨酸產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率

4-羥基異亮氨酸產(chǎn)量以反應(yīng)體系中其濃度計(jì)，按式(4)計(jì)算轉(zhuǎn)化率．

1.3 數(shù)據(jù)分析

每組實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3個(gè)平行并重復(fù)3次，分別利用軟件SPSS 13.0和Origin 8.0分析和處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)．

2 結(jié)果與分析

2.1 E. coli pET-ido的構(gòu)建

ido基因 PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切后連接至表達(dá)載體pET-28a，經(jīng)轉(zhuǎn)化、篩選獲得轉(zhuǎn)化子．挑取轉(zhuǎn)化單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，結(jié)果如圖2所示．

圖2 E. coli pET-ido菌落 PCR和重組質(zhì)粒 pET-ido酶切驗(yàn)證Fig. 2 PCR colony of E.coli pET-ido and pET-ido digested by restricted endonuclease

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，出現(xiàn)堿基數(shù)約為750bp的條帶，與理論值(738bp，含限制性內(nèi)切酶酶切序列和保護(hù)堿基)接近．提取重組質(zhì)粒，進(jìn)行酶切驗(yàn)證，質(zhì)粒經(jīng)單酶切獲得堿基數(shù)約為6000bp的條帶，與 pET-28a(5369bp)和 ido(732bp)的堿基數(shù)之和接近；質(zhì)粒經(jīng)雙酶切獲得堿基數(shù)分別為5000bp和750bp的條帶，分別與 pET-28a和 ido堿基數(shù)接近，表明ido過表達(dá)重組質(zhì)粒pET-ido和菌株E. coli pET-ido構(gòu)建成功．對(duì)該質(zhì)粒中ido基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)，其堿基序列未發(fā)生突變．

2.2 重組IDO的表達(dá)

收集經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的E. coli pET-ido菌體細(xì)胞，破碎物經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示．E. coli pET-ido菌體破碎液、破碎物上清液和沉淀中均出現(xiàn)相對(duì)分子質(zhì)量約為 2.90×104的條帶，與其理論相對(duì)分子質(zhì)量(2.892×104，包含 6個(gè)組氨酸標(biāo)簽)接近，而對(duì)照菌株則未出現(xiàn)相應(yīng)條帶．這表明重組 IDO能夠于E. coli pET-ido成功可溶性表達(dá)．

圖3 重組IDO的SDS-PAGEFig. 3 SDS-PAGE of recombinant IDO

2.3 靜息細(xì)胞法合成4-羥基異亮氨酸體系的構(gòu)建

在工業(yè)化生產(chǎn)中，利用純酶進(jìn)行催化合成 4-羥基異亮氨酸成本較高，采用微生物轉(zhuǎn)化法或全細(xì)胞催化法是較為理想的方法[20-21]．前期構(gòu)建了大腸桿菌E. coli W3110轉(zhuǎn)化法合成 4-羥基異亮氨酸，但其合成量低(36h產(chǎn)量為 44.6mmol/L)[16]．其原因可能是細(xì)胞膜及細(xì)胞壁阻礙了 L-異亮氨酸和α-酮戊二酸輸入以及4-羥基異亮氨酸輸出．同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)化過程中有部分 L-異亮氨酸和α-酮戊二酸額外消耗．靜息細(xì)胞具有在反應(yīng)過程中不生長(zhǎng)、底物額外消耗量小以及底物和產(chǎn)物透過性強(qiáng)的特性[21]．以 E. coli pET-ido靜息細(xì)胞為酶源進(jìn)行催化反應(yīng)，結(jié)果如圖 4(a)所示．隨催化時(shí)間的延長(zhǎng)，靜息細(xì)胞催化4-羥基異亮氨酸生成量增加，12h達(dá)到最高值 185.6mmol/L，此時(shí)轉(zhuǎn)化率為92.8%．而未經(jīng)冷凍處理的活細(xì)胞僅能合成微量 4-羥基異亮氨酸(最高為 3.8mmol/L)．由異亮氨酸羥化酶催化反應(yīng)特性可知(圖1)，生成該濃度4-羥基異亮氨酸需要消耗同等量的 L-異亮氨酸和α-酮戊二酸．經(jīng)檢測(cè)，靜息細(xì)胞對(duì)其實(shí)際消耗量分別為189.8mmol/L 和 189.5mmol/L(表 1)，由此可見二者幾乎無(wú)額外消耗．

圖4 靜息細(xì)胞合成 4-羥基異亮氨酸過程曲線及靜息細(xì)胞使用次數(shù)對(duì)4-羥基異亮氨酸合成的影響Fig. 4 Production of 4-hydroxyisoleucine with resting cells and effect of recycle of resting cells on 4-hydroxyisoleucine production

靜息細(xì)胞重復(fù)使用次數(shù)對(duì) 4-羥基異亮氨酸合成的影響如圖 4(b)所示．靜息細(xì)胞連續(xù)使用 5次后其催化 4-羥基異亮氨酸合成量未見顯著降低，第 6次時(shí)略有降低，隨后迅速降低．由此可見，利用靜息細(xì)胞法可將L-異亮氨酸和α-酮戊二酸高效地轉(zhuǎn)化為4-羥基異亮氨酸，且靜息細(xì)胞可作為酶源被重復(fù)使用．

2.4 單因素優(yōu)化靜息細(xì)胞法合成4-羥基異亮氨酸條件

2.4.1 底物濃度對(duì)4-羥基異亮氨酸合成的影響

考察了不同濃度 L-異亮氨酸和α-酮戊二酸對(duì)4-羥基異亮氨酸合成的影響，結(jié)果如圖 5所示，隨二者濃度的增加，4-羥基異亮氨酸的合成量和轉(zhuǎn)化率均逐漸提高，250mmol/L時(shí)，其合成量最高(分別為196.7mmol/L和 198.3mmol/L)，但轉(zhuǎn)化率(分別為78.7%和 79.3%)較底物濃度為 200mmol/L時(shí)低．為探究靜息細(xì)胞法合成4-羥基異亮氨酸的潛在水平，選擇L-異亮氨酸和α-酮戊二酸添加量為250mmol/L．

圖5 L-異亮氨酸和α-酮戊二酸添加量對(duì) 4-羥基異亮氨酸合成的影響Fig. 5 Effect of L-isoleucine and α-ketoglutarate concentration on 4-hydroxyisoleucine production

2.4.2 靜息細(xì)胞添加量對(duì)4-羥基異亮氨酸合成的影響

酶含量直接影響4-羥基異亮氨酸的合成效率，不同靜息細(xì)胞添加量對(duì)其合成的影響如圖6所示．

圖6 靜息細(xì)胞添加量對(duì)4-羥基異亮氨酸合成的影響Fig. 6 Effect of resting cells concentration on 4-hydroxyisoleucine production

由圖 6可見：隨著靜息細(xì)胞添加量的增加，4-羥基異亮氨酸合成量提高，當(dāng)添加量為 25g/L時(shí)產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率最高，分別為208.5mmol/L和83.4%．

2.4.3 溫度對(duì)4-羥基異亮氨酸合成的影響

溫度可通過影響異亮氨酸羥化酶活性影響 4-羥基異亮氨酸合成效率．如圖 7所示，4-羥基異亮氨酸生成量隨著溫度的升高而逐漸增加，35℃達(dá)到最高(208.6mmol/L)，隨后降低．前期研究結(jié)果表明，重組IDO 的最適反應(yīng)溫度為 35℃[16]，這可能是該溫度條件下4-羥基異亮氨酸生成量達(dá)到最高的原因．

圖7 溫度對(duì)4-羥基異亮氨酸合成的影響Fig. 7 Effect of temperature on 4-hydroxyisoleucine production

2.4.4 pH對(duì)4-羥基異亮氨酸合成的影響

pH亦可通過改變異亮氨酸羥化酶活性影響 4-羥基異亮氨酸合成效率．如圖 8所示，隨 pH升高，4-羥基異亮氨酸合成量增加，pH 9.0時(shí)最高(216.9mmol/L)．然而，重組 IDO的最適反應(yīng) pH為7.0[16]．檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)結(jié)束后該反應(yīng)液的 pH 為6.8～7.5，故推測(cè)，其催化反應(yīng)中由于 CO2的生成，致使反應(yīng)體系pH降低．

圖8 pH對(duì)4-羥基異亮氨酸合成的影響Fig. 8 Effect of pH on 4-hydroxyisoleucine production

2.4.5 金屬離子對(duì)4-羥基異亮氨酸合成的影響

異亮氨酸羥化酶屬于 Fe2+和α-酮戊二酸依賴型羥化酶家族[10,22]，因此Fe2+對(duì)其活性影響較大．考察了 Fe2+濃度對(duì) 4-羥基異亮氨酸合成的影響(圖9)．由圖 9可知：不添加 Fe2+時(shí)，無(wú) 4-羥基異亮氨酸生成；隨 Fe2+濃度提高，4-羥基異亮氨酸合成量先增加后減少，F(xiàn)e2+濃度為10mmol/L時(shí)其濃度最高．

圖9 Fe2+濃度對(duì)4-羥基異亮氨酸合成的影響Fig. 9 Effect of Fe2+ on 4-hydroxyisoleucine production

Ca2+對(duì) 4-羥基異亮氨酸合成具有明顯抑制作用．然而，在一定濃度下 Na+、K+和 Mg2+對(duì)催化反應(yīng)均具有促進(jìn)作用，最高分別提高 3.76%、4.12%和5.69%．由于其促進(jìn)作用并不明顯，故在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中不添加上述金屬離子．

2.4.6 VC對(duì)4-羥基異亮氨酸合成的影響

Fe2+容易被氧化為 Fe3+，從而影響異亮氨酸羥化酶活性，VC作為抗氧化劑可有效防止Fe2+氧化[23-24].考察了 VC濃度對(duì) 4-羥基異亮氨酸合成的影響(圖10)．由圖 10可知：不添加 VC時(shí)，4-羥基異亮氨酸生成量極低，其原因可能是Fe2+被氧化使得酶促反應(yīng)難以進(jìn)行；VC濃度為6mmol/L時(shí)，4-羥基異亮氨酸濃度最高．

圖10 VC濃度對(duì)4-羥基異亮氨酸合成的影響Fig. 10 Effect of VC on 4-hydroxyisoleucine production

2.5 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化靜息細(xì)胞法合成4-羥基異亮氨酸條件

由單因素實(shí)驗(yàn)可知，pH、靜息細(xì)胞添加量以及Fe2+和VC濃度對(duì)4-羥基異亮氨酸的合成影響較大，因此利用正交實(shí)驗(yàn)對(duì)上述條件進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，結(jié)果見表 2和表 3．上述 4因素均能顯著影響 4-羥基異亮氨酸的合成(P＜0.05)，當(dāng) pH＝9.0、靜息細(xì)胞添加量為 27g/L、Fe2+和 VC 濃度分別為 8mmol/L和6mmol/L時(shí)，4-羥基異亮氨酸合成量達(dá)到最高值242.5mmol/L．

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab. 2 Rerulto of orthogonal experiment

表3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析Tab. 3 Variance analysis of the results

2.6 最適條件下4-羥基異亮氨酸的合成及結(jié)果比較

利用上述最適條件(靜息細(xì)胞添加量 27g/L，L-異亮氨酸 250mmol/L，α-酮戊二酸濃度250mmol/L，F(xiàn)eSO48mmol/L，VC 6mmol/L，反應(yīng)溫度 35℃，pH 9.0)進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)．催化過程曲線如圖11所示，隨催化時(shí)間的增長(zhǎng)，4-羥基異亮氨酸的產(chǎn)量以及 L-異亮氨酸和α-酮戊二酸的消耗量逐漸提高，12h時(shí)4-羥基異亮氨酸產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率分別達(dá)到最高值249.6mmol/L和 99.8%，較優(yōu)化前提高 34.5%和7.5%．該結(jié)果是目前已報(bào)道的生物法合成 4-羥基異亮氨酸的最高值，其主要指標(biāo)比較見表4．

圖11 優(yōu)化條件下4-羥基異亮氨酸生成過程曲線Fig. 11 Curve of the production process of 4-hydroxyisoleucine under optimized condition

表4 已報(bào)道的生物法合成4-羥基異亮氨酸主要指標(biāo)及與本研究對(duì)比Tab. 4 Comparision of this study with the reported data of biosynthesis of 4-hydroxyisoleucine

3 結(jié) 語(yǔ)

為提高 4-羥基異亮氨酸合成效率，建立了靜息細(xì)胞法 4-羥基異亮氨酸合成體系，并避免了底物的額外消耗．在此基礎(chǔ)上，對(duì)催化條件進(jìn)行優(yōu)化，獲得最佳反應(yīng)條件：靜息細(xì)胞 27g/L，L-異亮氨酸250mmol/L，α-酮戊二酸 250mmol/L，F(xiàn)eSO48mmol/L，VC 6mmol/L，反應(yīng)溫度 35℃，pH 9.0．在此條件下，催化反應(yīng) 12h，4-羥基異亮氨酸生成量和轉(zhuǎn)化率均達(dá)到最高值，分別為 249.6mmol/L和99.8%，較優(yōu)化前提高34.5%和7.5%．

在催化過程中，靜息細(xì)胞內(nèi)異亮氨酸羥化酶的平均催化速率為 0.67μmol/(min·mg)，低于純酶的催化速率 1.89μmol/(min·mg). 其原因可能是：(1)異亮氨酸羥化酶在 35℃條件下 4h后活性逐漸下降，10h后僅有 50%的活性．故推測(cè)，隨催化時(shí)間延長(zhǎng)，異亮氨酸羥化酶穩(wěn)定性越低，剩余酶活性越少，其催化效率降低．(2)催化 4h后，4-羥基異亮氨酸濃度高于130mmol/L，可能對(duì)異亮氨酸羥化酶存在反饋抑制作用．后續(xù)研究可針對(duì)上述問題對(duì)異亮氨酸羥化酶進(jìn)行改造，以期獲得穩(wěn)定性更高且解除反饋抑制作用的突變體，從而縮短催化周期．