王莎莎，關(guān)鍵，王珊，成芳娟，任俠，許西琳，高巖

新疆地區(qū)哈薩克族慢性阻塞性肺疾病易感性與ADAM33基因多態(tài)性的關(guān)系

王莎莎，關(guān)鍵△，王珊，成芳娟，任俠，許西琳，高巖

目的探究整合素-金屬蛋白酶33（ADAM33）基因F+1、S2、T1、ST+5位點(diǎn)多態(tài)性與新疆地區(qū)哈薩克族慢性阻塞性肺疾病（COPD）易感性的關(guān)系。方法選擇193例對(duì)照組及197例COPD病例組，提取外周血標(biāo)本DNA，運(yùn)用SNaPshot SNP分型技術(shù)檢測(cè)ADAM33基因各位點(diǎn)多態(tài)性。結(jié)果病例組與對(duì)照組F+1位點(diǎn)的基因型及等位基因頻率分布比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。病例組中，F(xiàn)+1位點(diǎn)CC、CT、TT 3種基因型肺功能相關(guān)指標(biāo)第1秒用力呼氣容積（FEV1）預(yù)計(jì)值（%）、FEV1/用力肺活量（FVC）比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。病例組與對(duì)照組S2、ST+5、T1位點(diǎn)的基因型及等位基因頻率分布比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；F+1、S2位點(diǎn)進(jìn)行單體型分析顯示Hap1（CC）在對(duì)照組和病例組分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且OR＜1，表明此單體型可能降低發(fā)生COPD的風(fēng)險(xiǎn)；Hap3（TC）在對(duì)照組和病例組分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且OR＞1，表明此單體型可能增加了COPD發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)；Hap2（TG）、Hap4（CG）單體型在2組間分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；病例組及對(duì)照組T1、ST+5位點(diǎn)3種單體型比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論ADAM33基因F+1位點(diǎn)多態(tài)性可能與新疆哈薩克族人群COPD的發(fā)生有關(guān)。

肺疾病，慢性阻塞性；ADAM蛋白質(zhì)類；多態(tài)性，單核苷酸；哈薩克族；ADAM33基因；單體型

慢性阻塞性肺疾?。–OPD）是一種呼吸系統(tǒng)的常見疾病，其特點(diǎn)為氣流持續(xù)性受限，并且疾病的發(fā)展呈漸進(jìn)性。目前COPD發(fā)病機(jī)制尚未完全清晰，可能受環(huán)境以及遺傳這兩方面因素影響。2002年

Van Eerdewegh等［1］通過定位克隆的方法確定了ADAM33基因是支氣管哮喘疾病的影響因素，且與氣道高反應(yīng)性也存在相關(guān)性。隨后國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)該基因和COPD之間的關(guān)系進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)ADAM33基因在COPD的發(fā)病過程中發(fā)揮作用，并顯示其單核苷酸多態(tài)性（SNP）與肺功能的快速下降也存在相關(guān)性［2］。本研究旨在探究哈薩克族人群ADAM33基因多態(tài)性與COPD易感性的相關(guān)性，進(jìn)一步從分子水平研究新疆地區(qū)哈薩克族人群COPD病程進(jìn)展中遺傳因素的作用。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象選擇2013年5月—2015年5月石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院、伊犁州友誼醫(yī)院、伊犁州新華醫(yī)院及塔城沙灣縣人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科住院部、門診確診為COPD的哈薩克族患者197例作為病例組，符合2013年中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸分會(huì)制定的COPD診療指南的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并且在入組前未使用過茶堿類、β2受體激動(dòng)劑和糖皮質(zhì)激素類藥物進(jìn)行對(duì)癥治療。對(duì)照組為同期在以上醫(yī)院門診或體檢中心挑選出的哈薩克族體檢健康者193例。排除肺部其他疾病以及胸部手術(shù)史。2組性別、年齡、吸煙指數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，肺功能第1秒用力呼氣容積（FEV1）預(yù)計(jì)值（%）、FEV1/用力肺活量（FVC）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（肺功能選在病例組病情處于穩(wěn)定期時(shí)測(cè)定），見表1。本次試驗(yàn)全部入選人員必須簽署知情同意書并且通過我院倫理委員會(huì)的同意后方可進(jìn)行。

Tab.1Basic information of these two groups表1 2組基本資料比較

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取抽取全部研究對(duì)象的靜脈血（手背部）5 mL，EDTA抗凝，采用由北京TIANGEN生化科技公司提供的非離心柱型試劑盒提取血液基因組DNA，并儲(chǔ)存于-80℃冰箱以便備用，運(yùn)用超微量分光光度計(jì)對(duì)DNA純度及濃度進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2 Q-1、T2位點(diǎn)多態(tài)性的測(cè)試（1）設(shè)計(jì)引物。根據(jù)GenBank提供的基因序列，運(yùn)用Primer3軟件對(duì)引物進(jìn)行設(shè)計(jì)，F(xiàn)+1位點(diǎn)的引物序列為：F 5′-GAGGCCACTGGAACCTCCTGTT-3′，R 5′-GTGGTGCACCTGCTCAGGACTC-3′；S2位點(diǎn)：F 5′-GAGGCCACTGGAACCTCCTGTT-3′，R 5′-GTGGTGCA CCTGCTCAGGACTC-3′；ST+5位點(diǎn)：F 5′-TGCCCACAGA CCCTCAATCAC-3′，R 5′-GGGCCCAGCACATCTTTTCAC-3′；T1位點(diǎn)：F 5′-AGGGTCTGGGAGAAATGGTGGA-3′，R:5′-CACTGTGCCAACCTCCTGGACT-3′。4個(gè)位點(diǎn)擴(kuò)增長(zhǎng)度分別為278、365、369、311 bp。（2）對(duì)目的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)?？侾CR反應(yīng)體系為10 μL，包含1× HotStarTaq buffer、Mg2+3.0 mmol/L、dNTP 0.3 mmol/L，HotStar-Taq polymerase（Qiagen Inc.）1 U、DNA樣本1μL和多重PCR引物1μL。循環(huán)PCR程序：循環(huán)11次以下過程，變性95℃2 min；變性94℃20 s，退火65℃40 s，每次循環(huán)降低0.5℃，延伸72℃1.5 min；變性94℃20 s，退火59℃30 s，延伸2℃1.5 min，循環(huán)24次；延伸72℃2 min，在4℃條件下保存。取擴(kuò)增產(chǎn)物1.5 μL制膠后進(jìn)行電泳檢測(cè)，若有目的片段則驗(yàn)證擴(kuò)增成功。（3）PCR產(chǎn)物純化。取10 μL PCR產(chǎn)物然后加5 U SAP酶和2 U核酸外切酶Ⅰ，在37℃恒溫水浴鍋中1 h，75℃15 min對(duì)酶進(jìn)行滅活。（4）延伸反應(yīng)。延伸過程共需10 μL，其中含有超純水2 μL、SNaPshot Multiplex Kit（ABI）5 μL、多重PCR純化后產(chǎn)物2 μL以及延伸引物混合物1 μL。延伸引物濃度：F+1為0.8 μmol/L、S2為0.8 μmol/L、ST+5為0.8 μmol/L、T1為0.5 μmol/L。延伸過程：變性96℃1 min；變性96℃10 s，退火55℃5 s，延伸60℃30 s，循環(huán)28次；4℃條件下保存。純化延伸產(chǎn)物：取延伸產(chǎn)物10 μL并放入SAP酶1 U，在37℃恒溫水浴鍋中1 h，75℃對(duì)酶進(jìn)行滅活15 min。（5）在ABI3730XL測(cè)序儀上對(duì)延伸產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。經(jīng)過純化的延伸產(chǎn)物0.5 μL、Liz120 SIZE STANDARD 0.5 μL、LHi-Di Formamide 9 μL，變性95℃5 min后進(jìn)行測(cè)序。運(yùn)用Gene-Mapper 4.1（Appliedbiosystems）軟件對(duì)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法運(yùn)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用表示，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料2組間比較用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較用單因素方差分析。計(jì)數(shù)資料組間比較用χ2檢驗(yàn)，采用基因計(jì)數(shù)法計(jì)算基因頻率，Haploview軟件分析基因型分布是否符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律；組間基因型和等位基因頻率分布的比較采用χ2檢驗(yàn)，運(yùn)用Phase軟件進(jìn)行單體型推斷。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ADAM33基因F+1、S2、ST+5、T1位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果F+1、ST+5、T1位點(diǎn)病例組及對(duì)照組共390個(gè)樣本基因分型成功；S2位點(diǎn)病例組191個(gè)樣本基因分型成功，6個(gè)樣本基因分型失敗，對(duì)照組190個(gè)樣本基因分型成功，3個(gè)樣本基因型分型失敗。測(cè)序結(jié)果運(yùn)用GeneMapper 4.1軟件處理得出的各位點(diǎn)SNaPshot圖像，見圖1～4。

2.2 Hardy-Weinberg遺傳平衡符合度檢驗(yàn)F+1、S2、ST+5、T1位點(diǎn)基因型的分布符合與Hardy-Weinberg遺傳平衡（P分別為0.680、0.700、0.591、1.000），選取的樣本群體代表性良好。

2.32 組基因型以及等位基因頻率分布的比較見表2。在病例組與對(duì)照組F+1位點(diǎn)基因型及等位基

因頻率分布比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），S2、ST+5、T1位點(diǎn)基因型以及等位基因頻率分布的比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 病例組ADAM33基因F+1位點(diǎn)各基因型與肺功能的關(guān)系病例組F+1位點(diǎn)各基因型的FEV1預(yù)計(jì)值和FEV1/FVC的比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

Fig.1F+1 locus waveform and genotypes in ADAM33 gene圖1 ADAM33基因F+1位點(diǎn)的波形和基因型

Fig.2S2 locus waveform and genotypes in ADAM33 gene圖2 ADAM33基因S2位點(diǎn)的波形和基因型

Fig.3ST+5 locus waveform and genotypes in ADAM33 gene圖3 ADAM33基因ST+5位點(diǎn)的波形和基因型

Fig.4T1 locus waveform and genotypes in ADAM33 gene圖4 ADAM33基因T1位點(diǎn)的波形和基因型

Tab.2Comparison the gene frequency and allele frequency of F+1，S2，T1 and ST+5 locus between two groups表2 2組F+1、S2、T1、ST+5位點(diǎn)基因型以及等位基因分布頻率的比較例（%）

Tab.3Relationship between ADAM33 genotypes and pulmonary function in case group表3 病例組ADAM33基因F+1位點(diǎn)基因型與肺功能指標(biāo)的關(guān)系（%，）

Tab.3Relationship between ADAM33 genotypes and pulmonary function in case group表3 病例組ADAM33基因F+1位點(diǎn)基因型與肺功能指標(biāo)的關(guān)系（%，）

均P＞0.05

基因型C C C T T T F n 9 5 7 3 2 9 F E V 1預(yù)計(jì)值6 0 . 7 8 ± 1 3 . 2 6 6 5 . 4 4 ± 1 6 . 6 0 6 0 . 2 4 ± 1 6 . 5 7 2 . 3 3 0 F E V 1 / F V C 6 2 . 9 5 ± 8 . 3 4 6 4 . 8 1 ± 7 . 7 3 6 5 . 1 0 ± 7 . 6 3 1 . 4 6 2

2.5 ADAM33基因位點(diǎn)單體型的分析F+1、S2位點(diǎn)有4種單體型，Hap1（CC）在對(duì)照組和病例組分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且OR＜1，此單體型可能降低發(fā)生COPD的風(fēng)險(xiǎn)；Hap3（TC）在對(duì)照組和病例組分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且OR＞1，此單體型可能增加了COPD發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)；Hap2（TG）、Hap4（CG）單體型在2組間分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表4。ST+5、T1位點(diǎn)3種單體型在2組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表5。

Tab.4Analysis of haplotype in F+1 and S2 locus in ADAM33 gene表4 ADAM33基因F+1、S2位點(diǎn)單體型的分析例（%）

Tab.5Analysis of haplotype in ST+5 and T1 locus表5 ADAM33基因ST+5、T1位點(diǎn)單體型的分析例（%）

3 討論

ADAM33基因是ADAM家族的一員，主要表達(dá)于肺組織的成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞以及支氣管上皮細(xì)胞，與氣道炎癥、重塑及血管生成有關(guān)［2］，而氣道炎癥在氣道重塑、膠原量增加以及瘢痕形成中發(fā)揮重要作用，這些也是導(dǎo)致氣道狹窄的關(guān)鍵。氣道狹窄、氣道炎癥及氣流受限為COPD的病理基礎(chǔ)，所以國(guó)內(nèi)外專家開始對(duì)ADAM33基因與不同種族、不同國(guó)家COPD人群易感性之間的關(guān)系進(jìn)行研究，但ADAM33基因在COPD的發(fā)病機(jī)制中的作用尚未明確。

目前ADAM33基因已經(jīng)成為研究COPD易感性的熱點(diǎn)基因。Shah等［3］通過對(duì)生活在克什米爾地區(qū)的COPD人群與ADAM33基因的關(guān)系進(jìn)行了相關(guān)的研究，結(jié)果表明T1、T2位點(diǎn)GG基因型及Q-1位點(diǎn)AG基因型與COPD病程進(jìn)展有關(guān)，T1、T2位點(diǎn)的G等位基因是當(dāng)?shù)厝巳夯加写瞬〉奈ｋU(xiǎn)因素。Gosman等［4］對(duì)荷蘭人群ADAM33基因多態(tài)性進(jìn)行探究，得出的結(jié)論為T2、T1、S2、ST+5位點(diǎn)的基因型與COPD的發(fā)生有關(guān)，但Q-1、S1、F+1、V4位點(diǎn)與COPD并無相關(guān)性。Sadeghnejad等［5］對(duì)880例年齡在50歲以上并且有20年以上吸煙史的美國(guó)白種人群ADAM33基因多態(tài)性進(jìn)行研究，結(jié)果為S2位點(diǎn)與肺功能指標(biāo)降低以及COPD的發(fā)病進(jìn)程有關(guān)。近些年，我國(guó)學(xué)者也開始關(guān)注此方面并對(duì)我國(guó)各民族人群進(jìn)行研究。Tan等［6］運(yùn)用多聚酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR-RELP）的方法對(duì)蒙古族人群ADAM33基因上8個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示S2等位點(diǎn)與蒙古族COPD發(fā)病無明顯關(guān)系。Xiao等［7］對(duì)我國(guó)藏族COPD人群進(jìn)行研究，結(jié)果顯示ADAM33基因T1位點(diǎn)的AG基因型與COPD易感性相關(guān)。根據(jù)以上研究顯示ADAM33基因F+1、S2、ST+5、T1位點(diǎn)與COPD之間關(guān)系尚存在爭(zhēng)議，因此F+1、S2、ST+5、T1位點(diǎn)與COPD易感性的關(guān)系仍有進(jìn)一步探究的價(jià)值。

本課題組蔣濤等［8］對(duì)新疆哈薩克族COPD人群與ADAM33基因S1、V4位點(diǎn)之間的關(guān)系進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)V4及S1位點(diǎn)是COPD病程進(jìn)展的影響因素。郝娥娥等［9］對(duì)新疆維吾爾族COPD人群與ADAM33基因S1、S2位點(diǎn)間的關(guān)系進(jìn)行研究，但并未發(fā)現(xiàn)二者之間有關(guān)。本研究顯示，ADAM33基因F+1位點(diǎn)的基因型以及等位基因的頻率分布在新疆哈薩克族的病例組與對(duì)照組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此推測(cè)哈薩克族COPD易感性與F+1位點(diǎn)可能有關(guān)，但并未發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)和肺功能相關(guān)指標(biāo)之間的關(guān)系；F+1、S2位點(diǎn)單體型分析顯示，單體型Hap1（CC）在病例組的頻率分布明顯低于對(duì)照組，表明此單體型有降低發(fā)生COPD風(fēng)險(xiǎn)的可能性，單體型Hap3（TC）在病例組的頻率分布明顯高于對(duì)照組，因此該單體型增加了患COPD的風(fēng)險(xiǎn)，S2、ST+5、T1位點(diǎn)與新疆哈薩克族COPD人群的發(fā)病過程無關(guān)聯(lián)。以上結(jié)果與其他國(guó)家及我國(guó)其他民族得出的結(jié)論存在差異，可能不同種族人群ADAM33基因各位點(diǎn)發(fā)揮的作用不同，也可能與生活環(huán)境有關(guān)，且ADAM33基因位點(diǎn)較多，各位點(diǎn)間存在連鎖不平衡，并不能確定哪個(gè)位點(diǎn)起到?jīng)Q定性作用，應(yīng)建立與疾病有關(guān)的完整基因體系。今后還需要深入研究，以進(jìn)一步闡明COPD的遺傳易感機(jī)制。

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（2015-07-27收稿 2015-09-01修回）

（本文編輯 李國(guó)琪）

Association between ADAM33 gene polymorphism with chronic obstructive pulmonary disease incidence in Kazakh of Xinjiang

WANG Shasha，GUAN Jian△，WANG Shan，CHENG Fangjuan，REN Xia，XU Xilin，GAO Yan
Department of Respiratory Medicine，The First Affiliated Hospital of Medical School，Shihezi University，Shihezi 832008，China△

ObjectiveTo explore correlation of Xinjiang Kazakh population who suffered from COPD with polymorphisms of F+1，S2，T1，ST+5 locus of ADAM33 gene.MethodsBlood samples（n=193）from healthy controls（Control group，n=193）and COPD patients（Case group，n=197）were detected by SNP SNaP shot.ResultsComparing case group with the control group，gene frequency and allele frequency of F+1 locus were of significant differences（P＜0.05）.In patient group，there were no significant differences in F+1 locus genotype and in clinical indicators include lung function FEV1 predicted and FEV1/FVC（P＞0.05）.The gene frequencies and allele frequency of S2、T1 and ST+5 locus were not significantly different between case group and control group（P＞0.05）.F+1 and S2 locus were analyzed by haplotype analysis which showed that there was significant differences in Hap1（CC）haplotype between case group and control group（P＜0.05），and OR＜1 indicated that its haplotype may reduce the risk of COPD.There were significant differences（P＜0.05）in Hap3（TC）haplotype between case group and control group and OR＞1 revealed that its haplotype may increase the risk of COPD.The distribution of Hap2（TG）and Hap4（CG）were not significantly different（P＞0.05）between the 2 groups.T1 and ST+5 locus were analyzed by haplotype analysis which showed significant differences in haplotypes between case group and control group（P＜0.05）.ConclusionThe occurrence of COPD may be related to the polymorphism of ADAM33 gene in F+1 locus in Xinjiang Kazakh.

pulmonary disease，chronic obstructive；ADAM proteins；polymorphism，single nucleotide；KAZAKH NATIONALITY；ADAM33 gene；haplotype

R563

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.12.002

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81360009）

石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科（郵編832008）

王莎莎（1990），女，碩士研究生，主要從事呼吸系統(tǒng)疾病研究

△通訊作者E-mail:guanjian6@163.com