楊康敏，高向東，顧覺奮

·綜述·

激活沉默基因簇發(fā)掘微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究進(jìn)展

楊康敏，高向東，顧覺奮

天然產(chǎn)物是指動(dòng)物、植物、昆蟲、海洋生物和微生物體內(nèi)的組成成分或其代謝產(chǎn)物以及人和動(dòng)物體內(nèi)許許多多內(nèi)源性的化學(xué)成分的總稱。在醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)，天然產(chǎn)物已是新藥的重要來源之一，新的化學(xué)單體中，40%以上都由天然產(chǎn)物衍生而來，而天然產(chǎn)物多數(shù)是由微生物的次級(jí)代謝過程產(chǎn)生［1］。自20世紀(jì)70年代以來，盡管人們對治療傳染性疾病和癌癥的藥物需求越來越多，但是，發(fā)現(xiàn)新的活性天然產(chǎn)物的速度卻在不斷下降，傳統(tǒng)方法已很難獲得新的次級(jí)代謝產(chǎn)物。如今的DNA測序技術(shù)已經(jīng)能夠快速、方便地檢測大量基因組序列。其結(jié)果提示我們：作為天然活性產(chǎn)物的重要來源，盡管細(xì)菌和真菌已被深入研究，但其次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇的數(shù)目遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出我們的預(yù)期，仍有大量的次級(jí)代謝產(chǎn)物等待發(fā)掘。有兩個(gè)原因限制了新化合物的發(fā)現(xiàn)：①能夠進(jìn)行人工培養(yǎng)的微生物種類比例極低，目前為止僅有0.1%～1%的微生物家族成員被成功地在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)［2］；②大部分次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇在常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件下處于沉默狀態(tài)。若這些潛在的生物合成途徑被激活，則有可能發(fā)現(xiàn)許多新活性產(chǎn)物，打破現(xiàn)有新藥研發(fā)的瓶頸［3］。

目前，為激活沉默基因簇，已報(bào)道了多種方法，其中包括改變微生物的培養(yǎng)條件，例如培養(yǎng)基成分、通氣速率、pH、溫度、光照等，使它們產(chǎn)生更多類型或更大數(shù)量的次級(jí)代謝產(chǎn)物，即one strain many compounds（OSMAC）法。此方法被成功應(yīng)用于aspoquinolone A～D的發(fā)現(xiàn)，研究人員發(fā)現(xiàn)在構(gòu)巢曲菌基因組中存在可編碼多種鄰氨基苯甲酸合酶的基因，后者可催化喹啉或喹唑啉生物堿的合成，通過在不同條件下培養(yǎng)構(gòu)巢曲菌，利用紫外光譜法和質(zhì)譜法篩選后，獲得了新化合物aspoquinoloneA～D（圖1）。但OSMAC法在許多情況下（例如改變培養(yǎng)條件）并不能使微生物生產(chǎn)新的次級(jí)代謝產(chǎn)物，應(yīng)用范圍受到極大限制。近年來，研究人員通過采用不同手段、不同途徑探索激活沉默基因簇，并取得一定成果，本文就這一領(lǐng)域的最新進(jìn)展進(jìn)行簡要綜述。

圖1 利用OSMAC法在構(gòu)巢曲菌發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到的aspoquinoloneA～D

1 聚酮合酶和非核糖體肽合酶系統(tǒng)

絕大多數(shù)次級(jí)代謝產(chǎn)物都由非核糖體多肽或多聚酮衍生而來，其表達(dá)過程都有多功能酶——聚酮合酶（PKSs）和非核糖體肽合酶（NRPSs）的參與。PKSs和NRPSs分別利用簡單的丙二酰或氨基酸來構(gòu)建分子片段，并用非常相似的方法進(jìn)行組裝［4］。完整的PKS系統(tǒng)由許多模塊組成，每個(gè)模塊負(fù)責(zé)一個(gè)獨(dú)立的鏈延伸步驟，并且可被細(xì)分為不同的域（domain）。一個(gè)典型的PKS模塊至少包含一個(gè)負(fù)責(zé)選擇和轉(zhuǎn)移延伸單元的?；D(zhuǎn)移酶域AT，一個(gè)負(fù)責(zé)荷載延伸單元的?；d體蛋白域ACP和負(fù)責(zé)延伸單元脫羧化縮合的酮脂酰合成酶域KS。同樣地，NRPS模塊至少包含一個(gè)負(fù)責(zé)氨基酸活化的腺苷酰化域A，一個(gè)硫醇化域T和一個(gè)催化肽鍵形成的縮合域C；此外，有些模塊還包含許多非必需域（圖2）。在細(xì)菌中，有許多證據(jù)證明PKS和NRPS系統(tǒng)還可以共同作用，產(chǎn)生雜合產(chǎn)物［5］。近年來，根據(jù)PKS和NRPS系統(tǒng)，并利用基因工程技術(shù)，多種激活沉默基因的有效方法被發(fā)展起來。

2 過表達(dá)通路特異性轉(zhuǎn)錄因子

過表達(dá)某種通路特異性轉(zhuǎn)錄因子是激活沉默基因簇的有效方法之一，它可同時(shí)提高整個(gè)基因簇的表達(dá)，產(chǎn)生最終的次級(jí)代謝產(chǎn)物，只需操控一個(gè)很小的基因。此技術(shù)首次被應(yīng)用于過表達(dá)構(gòu)巢曲菌中的轉(zhuǎn)錄因子基因apdR。apdR是沉默基因簇apd的一部分，而后者中部包含一段PKS-NRPS雜合基因。Bergmann等［6］發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)apdR可以激活整段基因簇，最終導(dǎo)致了一類新細(xì)胞毒性化合物——aspyridoneA、B的發(fā)現(xiàn)（圖3）。但此技術(shù)也存在一定缺陷，其操作的成功性目前還不可預(yù)測。此外，某些通路特異性轉(zhuǎn)錄因子需要進(jìn)行翻譯后修飾，這可能會(huì)降低待表達(dá)次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。例如，在構(gòu)巢曲菌中，調(diào)控柄曲霉素基因簇表達(dá)的特異性轉(zhuǎn)錄因子AflR在被翻譯后必須進(jìn)行磷酸化才能成功進(jìn)入核內(nèi)［7］。

圖2 PKS和NRPS模塊結(jié)構(gòu)

圖3 在構(gòu)巢曲菌中過表達(dá)apdR基因以產(chǎn)生aspyridoneA、B

圖4 在構(gòu)巢曲菌中敲除sumO基因以提高asperthecin產(chǎn)量；敲除cclA基因以獲得monodyctiphenone、emodins

3 過表達(dá)通用轉(zhuǎn)錄因子

除了通路特異性轉(zhuǎn)錄因子，微生物基因組中還存在一些通用轉(zhuǎn)錄因子，例如LaeA，它是一種核內(nèi)蛋白，具有調(diào)控曲霉屬真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物表達(dá)的功能［8］。敲除laeA基因會(huì)降低構(gòu)巢曲菌中柄曲霉素、青霉素以及煙曲霉菌中膠霉毒素的表達(dá)。相反，過表達(dá)laeA能夠增加這些次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量。利用此方法，研究人員在構(gòu)巢曲菌中成功表達(dá)了terrequinoneA。Terrequinone A具有抗癌活性，有著廣闊的應(yīng)用前景和市場潛力［9］。

4 表觀遺傳調(diào)控/染色質(zhì)水平的重構(gòu)

組蛋白修飾可以通過改變?nèi)旧|(zhì)的乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化和類泛素化等來調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。Shwab等［10］證實(shí)了組氨酸乙?；谡{(diào)節(jié)曲霉菌天然產(chǎn)物合成過程中的重要作用。曲霉菌基因組中的hdaA基因可編碼組蛋白脫乙酰酶，將其敲除可提高雜色曲霉素和青霉素的產(chǎn)量。此外，COMPASS復(fù)合物能夠促進(jìn)組蛋白H3第四位賴氨酸（H3K4）的甲基化，而后者被認(rèn)為是染色質(zhì)變松散、轉(zhuǎn)錄因子被活化的標(biāo)志［11］。Bok等［12］將構(gòu)巢曲菌中編碼COMPASS復(fù)合物的cclA基因敲除，發(fā)現(xiàn)其可誘導(dǎo)大黃素及其衍生物以及組織蛋白酶K抑制劑F-9775A和F-9775B等合成基因的表達(dá)。類似地，Szewczyk等［13］將構(gòu)巢曲菌中的類泛素化基因sumO敲除后，可激活某些次級(jí)代謝途徑，使asperthecin產(chǎn)量增加（圖4）。

5 次級(jí)代謝生物合成基因簇的異源表達(dá)

過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子以及染色質(zhì)水平的調(diào)節(jié)只能應(yīng)用于擁有較高級(jí)分子遺傳系統(tǒng)的微生物中，若要將這些技術(shù)普遍應(yīng)用于其他微生物，必須引入一套完善的分子遺傳系統(tǒng)，或者將待表達(dá)的次級(jí)代謝生物合成基因簇引入到合適的異源宿主微生物中。例如，唐德鏈霉菌S.tendae Tu1028含有吩嗪化合物生物合成基因簇，但在常規(guī)條件下處于沉默狀態(tài)，Saleh等［14］將該基因簇引入到宿主菌天藍(lán)鏈霉菌S.coelicolor M512基因組中進(jìn)行表達(dá)，通過在關(guān)鍵基因前加入紅霉素抗性基因強(qiáng)啟動(dòng)子，成功分離到了具有抗腫瘤和抗細(xì)菌等多種活性的吩嗪化合物。目前，放線菌沉默基因簇異源表達(dá)的常用宿主菌有白色鏈霉菌、天藍(lán)鏈霉菌和大腸桿菌等。異源表達(dá)存在的問題是，由于包含PKSs和NRPSs基因的基因簇可長達(dá)100 kb，將其引入異源宿主中相對困難［15］。此外，異源表達(dá)時(shí)必須將宿主微生物基因簇中原有啟動(dòng)子替換為強(qiáng)啟動(dòng)子或可誘導(dǎo)啟動(dòng)子，當(dāng)次級(jí)代謝產(chǎn)物合成通路中含有較多基因時(shí)，此方法便會(huì)受到限制。

6 核糖體工程

野生型變鉛青鏈霉菌本身由于相應(yīng)合成基因的休眠通常不會(huì)生產(chǎn)抗生素，但是當(dāng)其核糖體蛋白S12突變，引入鏈霉素抗性后，便能生產(chǎn)大量藍(lán)色的放線紫紅素。另一方面，細(xì)菌的信號(hào)素ppGpp（高度磷酸化的鳥苷酸分子，包括鳥苷酸五磷酸及四磷酸，簡稱ppGpp）在核糖體中產(chǎn)生，它可以和RNA聚合酶（RNAP）結(jié)合，導(dǎo)致抗生素的產(chǎn)生［16］。以上研究說明，引入某種抗性的RNAP修飾可模擬ppGpp結(jié)合方式，從而激活合成基因簇的表達(dá)。據(jù)此，Chai等［17］建立了“核糖體工程”方法，以核糖體S12蛋白、轉(zhuǎn)錄因子以及RNAP等為靶，通過改造，調(diào)控轉(zhuǎn)錄（翻譯）途徑，激活或提高沉默（或低表達(dá)）的基因簇的表達(dá)。他們將海洋真菌產(chǎn)紫青霉菌G59經(jīng)50%DMSO介導(dǎo)2 mg/ml慶大霉素處理5 d，使其核糖體蛋白S12發(fā)生突變，篩選得到慶大霉素抗性突變株，在其發(fā)酵產(chǎn)物中分離純化得到了麥角甾醇（ergosterol）、fructigenine A、rugulosuvineA等具有抗腫瘤活性的新次級(jí)代謝產(chǎn)物。

7 利用物種內(nèi)部通訊機(jī)制

次級(jí)代謝產(chǎn)物的功能之一是為產(chǎn)生它的微生物應(yīng)對周圍環(huán)境提供便利。某些情況下次級(jí)代謝產(chǎn)物被用以對抗一些紫外線輻射等非生物介質(zhì)，但更多情況下微生物利用其次級(jí)代謝產(chǎn)物來對抗其他微生物，這提示我們，可能存在某些感應(yīng)機(jī)制來控制次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生。如果可以利用微生物與環(huán)境之間的相互作用，便有可能激活沉默基因簇產(chǎn)生新次級(jí)代謝產(chǎn)物。Schroeckh等［18］通過細(xì)菌-真菌相互作用，利用基因芯片技術(shù)監(jiān)測了真菌沉默基因簇的選擇性激活。將構(gòu)巢曲菌和采集的58種不同的放線菌進(jìn)行共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其中一種放線菌——S.rapamycinicus，在與構(gòu)巢曲菌接觸后，可誘導(dǎo)兩個(gè)次級(jí)代謝基因簇的表達(dá)，其中一個(gè)可以產(chǎn)生芳香多酮類化合物苔色酸（orsellinic acid）、紅粉苔酸（lecanoric acid）以及組織蛋白酶K抑制劑F-9775A和F-9775B。透析實(shí)驗(yàn)和電鏡成像顯示，構(gòu)巢曲菌與S.rapamycinicus之間的物理接觸是激活沉默PKSs基因的必要條件。此方法也證明了將不同微生物共培養(yǎng)以獲得新次級(jí)代謝產(chǎn)物的可行性。

8 展望

目前，先進(jìn)的基因組測序技術(shù)證明了大量未知的次級(jí)代謝生物合成基因簇的存在，還有大量的次級(jí)代謝產(chǎn)物等待被發(fā)現(xiàn)。各種卓有成效的激活沉默基因簇的手段使得對新天然產(chǎn)物的發(fā)掘已進(jìn)入了一個(gè)新的階段。據(jù)統(tǒng)計(jì)，通過上述方法，已有多達(dá)50種新次級(jí)代謝產(chǎn)物被發(fā)現(xiàn)［19］。研究人員還在不斷探索新的方法，生物信息學(xué)在此領(lǐng)域正扮演越來越重要的角色，其最終目標(biāo)是利用基因組的測序信息，在未知的基因簇中預(yù)測新的天然產(chǎn)物。此外，近年來，蛋白質(zhì)組學(xué)也擴(kuò)充了鑒定沉默基因簇的方法。今后尋找新次級(jí)代謝產(chǎn)物的趨勢便是篩選方法的自動(dòng)化以及基因組學(xué)、分子遺傳學(xué)、生物化學(xué)等方法的協(xié)同組合。隨著越來越多的方法被發(fā)明以及改善，沉默的生物合成途徑將會(huì)成為新藥開發(fā)的寶貴資源。

此外，尋找這些基因簇在常規(guī)條件下處于沉默的原因也同樣十分重要，它們是否會(huì)在我們還未知的環(huán)境下自發(fā)表達(dá)？這些特殊的環(huán)境是怎樣的？在這種環(huán)境下，微生物所產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物的固有功能是什么？可以預(yù)見，當(dāng)了解隱藏在這些沉默基因簇背后的機(jī)制后，人們對微生物次級(jí)代謝途徑的利用將會(huì)更加充分。

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10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2015.01.015

210009南京，中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院

顧覺奮，Email：yqyan1@126.com，高向東，Email：xdgao@ cpu.edu.cn

2014-06-03