商悅，劉旭杰，陳淑珍

·論著·

表沒食子兒茶素沒食子酸酯與西妥昔單抗聯(lián)用體內(nèi)外抗食管癌細(xì)胞Eca-109的作用研究

商悅，劉旭杰，陳淑珍

目的研究表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）與西妥昔單抗聯(lián)用體內(nèi)外抗食管癌Eca-109的作用。

方法采用MTT法檢測化合物對腫瘤細(xì)胞增殖的影響；采用克隆形成法檢測EGCG對腫瘤細(xì)胞克隆形成的影響；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測化合物對腫瘤細(xì)胞凋亡的影響；采用動物實驗評價藥物或EGCG對移植于裸鼠的移植瘤的生長抑制作用；同時采用免疫組化的方法檢測藥物或EGCG對血管形成的影響。

結(jié)果EGCG能夠劑量依賴性地抑制Eca-109細(xì)胞增殖，其IC50值為43.22 μmol/L。經(jīng)克隆形成法檢測結(jié)果表明，EGCG能夠明顯抑制Eca-109細(xì)胞的克隆形成，IC50值為28.49 μmol/L。EGCG能夠顯著引起Eca-109細(xì)胞凋亡，60和80 μmol/L EGCG誘導(dǎo)的凋亡百分率分別為（21.70± 0.62）%、（57.13±9.09）%。EGCG和西妥昔單抗聯(lián)用對Eca-109細(xì)胞的增殖抑制作用較單獨用藥組強，具有相加作用。體內(nèi)實驗結(jié)果表明，EGCG和西妥昔單抗均能抑制Eca-109裸鼠移植瘤的生長，兩者聯(lián)用存在增強作用。EGCG和西妥昔單抗均能抑制裸鼠移植瘤的血管形成，兩者聯(lián)用血管形成抑制作用較單用組更強。

結(jié)論EGCG能夠抑制食管癌Eca-109的細(xì)胞增殖和克隆形成，具有誘導(dǎo)Eca-109細(xì)胞凋亡作用，與西妥昔單抗聯(lián)用在體內(nèi)外均具有增強作用。

兒茶酚類；藥物篩選試驗，抗腫瘤；食管腫瘤；西妥昔單抗

世界范圍內(nèi)，食管癌的發(fā)病率在腫瘤發(fā)病率中排名第六，每年新發(fā)病例約為450 000［1］。我國是世界上食管癌相對高發(fā)的地區(qū)。對食管癌的預(yù)防和治療進行研究將具有重要意義。

茶多酚是綠茶的主要活性成分，主要以兒茶素的單體形式存在，而表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG）在兒茶素中含量最高，活性最大［2］。EGCG單用具有中度的抗腫瘤活性，能夠增強抗腫瘤藥物的抗腫瘤活性、降低抗腫瘤藥物的毒性、逆轉(zhuǎn)耐藥性等［3］，如EGCG與紫杉醇聯(lián)用能夠協(xié)同抑制非小細(xì)胞肺癌H460細(xì)胞增殖［4］。EGCG不但能抑制腫瘤的生長，也能抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，抑制腫瘤的血管形成，具有多重效應(yīng)［5］。

西妥昔單抗（cetuximab，Cet）是靶向表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）的IgG1型的嵌合型單克隆抗體，能與內(nèi)源性的EGFR配體競爭性地結(jié)合EGFR，且親和力明顯高于內(nèi)源性配體［6］，是一種大分子靶向抗腫瘤藥物。在臨床上單用或與伊立替康聯(lián)用于EGFR過度表達的、對以伊立替康為基礎(chǔ)的化療方案耐藥的轉(zhuǎn)移性直腸癌的治療，其作用機制是通過拮抗EGFR受體介導(dǎo)的信號通路，從而產(chǎn)生抑制腫瘤的細(xì)胞生長、血管形成、侵襲轉(zhuǎn)移等多重效應(yīng)；同時也可以通過抗體依賴的細(xì)胞毒作用（antibodydepedent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）產(chǎn)生抗腫瘤作用［7］。

基于以上所述，EGCG和Cet均具有抑制腫瘤的細(xì)胞生長、血管形成、侵襲轉(zhuǎn)移等多重效應(yīng)，因此，我們研究兩者聯(lián)用對食管癌是否具有增效作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑綠茶提取物EGCG由綠康天然產(chǎn)物有限責(zé)任公司提供，批號為D98-120602；Cet注射液由勃林格殷格翰藥業(yè)公司生產(chǎn)（100 mg/瓶，進口藥品注冊號S20110009）；兔超敏二步法免疫組化檢測試劑盒和ZLI-9018濃縮型DAB試劑盒購自北京中杉金橋公司；一抗CD31購自美國Abcam公司，批號為2530-1；Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.1.2 實驗動物6～8周BALB/c裸鼠，體重18～22 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2007-0001。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)人食管癌Eca-109細(xì)胞由本室保存。細(xì)胞用含10%小牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液在含5%CO2的37℃溫箱中培養(yǎng)，每周傳代2～3次，常規(guī)消化，細(xì)胞長至對數(shù)生長期備用。

1.2.2 MTT法檢測藥物對腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用取對數(shù)生長期細(xì)胞，消化計數(shù)后按3000～5000個/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后用不同濃度的藥物處理細(xì)胞48 h或72 h，每組至少3個平行孔，MTT用PBS緩沖液配成2 mg/ml溶液，每孔加20 μl，37℃溫箱中溫育4 h。吸出上清液，加入150 μl DMSO，振蕩15 min，使結(jié)晶物充分溶解。用酶標(biāo)儀在570 nm處測定每個孔的光密度（OD）。

細(xì)胞存活率（%）=OD藥物組/OD對照組×100%

各測試孔的OD值減去本底（完全培養(yǎng)基加MTT，無細(xì)胞）OD值，3個平行孔OD值取平均數(shù)。以存活率為50%的藥物濃度為IC50。

1.2.3 克隆形成法檢測藥物對腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用取對數(shù)生長期細(xì)胞，消化計數(shù)后按5000個/10 ml的濃度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔50個細(xì)胞/100 μl，每組設(shè)3個平行孔。置5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后用不同濃度的藥物處理細(xì)胞，加藥后放培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，計數(shù)含50個細(xì)胞以上的集落，顯微鏡下計細(xì)胞集落數(shù)，并計算藥物單獨作用的IC50。聯(lián)合用藥給藥方式為先加EGCG 50 μl/孔，6 h后加其他藥物50 μl/孔。

1.2.4 Annexin V-FITC雙染法檢測細(xì)胞凋亡將細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，10萬～20萬個/孔（2 ml），培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度的藥物，并設(shè)空白對照，每組設(shè)3個平行孔。作用48 h后，吸出舊培養(yǎng)液，用PBS沖洗細(xì)胞1次，胰酶消化，用舊培養(yǎng)液中和胰酶，收集細(xì)胞液稍混勻，轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，1000×g離心5 min，棄上清，收集細(xì)胞，用PBS輕輕重懸細(xì)胞并計數(shù)，取5萬～10萬個重懸細(xì)胞，1000×g離心5 min，棄上清，加入195 μl Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞。加入5 μlAnnexin V-FITC，輕輕混勻。室溫避光孵育10 min。1000×g離心5 min，棄上清，加入190 μl Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞。加入10 μl碘化丙啶（PI）染色，輕輕混勻，冰浴避光放置。隨即進行流式細(xì)胞儀檢測，Annexin V-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。

1.2.5 小鼠腫瘤模型建立將培養(yǎng)好的人食管癌Eca-109細(xì)胞接種于BALB/c裸鼠右腋皮下，接種細(xì)胞數(shù)為（800～1000）×104個/只。

1.2.6 動物體內(nèi)療效觀察在BALB/c裸鼠右腋皮下接種人食管癌Eca-109細(xì)胞，待腫瘤生長后，剝離瘤體，切成2 mm3大小的腫瘤塊，移植入裸鼠右腋皮下。接種后7 d，將動物按體重分層，并隨機分組，每組6只，共6個實驗組：對照組、EGCG單藥150 mg/kg、EGCG單藥100 mg/kg、Cet 20 mg/kg、EGCG單藥150 mg/kg與Cet 20 mg/kg聯(lián)合、EGCG單藥100 mg/kg與Cet 20 mg/kg聯(lián)合。EGCG口服給藥每周5次，連給3周，共15次。Cet腹腔注射每周2次，連給3周，共6次。定期測量動物體重及瘤塊的長徑和短徑。一周測量2～3次，按以下公式計算腫瘤體積：

V=a（長徑）×b（短徑）×1/2

第30天處死動物，取瘤塊稱重，計算抑瘤率及動物體重變化。

1.2.7 兩藥相互作用指數(shù)兩藥相互作用指數(shù)CDI，CDI=AB/（A×B）。AB為兩藥聯(lián)合作用組的細(xì)胞抑制率，A、B是藥物單獨作用組的細(xì)胞抑制率。當(dāng)CDI＜1時藥物作用為協(xié)同；當(dāng)CDI＜0.7時藥物作用為協(xié)同顯著；當(dāng)CDI=1時藥物作用性質(zhì)為相加，CDI＞1，表示兩藥無相加或協(xié)同作用。

1.2.8 免疫組化法研究CD31在腫瘤組織的表達將腫瘤組織制備成石蠟切片，脫蠟后侵入0.01 mmol/L枸櫞酸緩沖液中進行抗原修復(fù)，PBS沖洗2 min×2次，3%雙氧水室溫孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS沖洗2 min×3次，滴加一抗4℃過夜，PBS沖洗2 min×3次，滴加聚合物輔助劑，37℃孵育10～20 min，PBS沖洗2 min×3次。滴加二抗，37℃孵育10～20 min，PBS沖洗2 min×3次。DAB染色：1 ml DAB底物緩沖液中加1滴DAB濃縮液，混勻。組織切片上滴加DAB顯色液，上色后立即自來水沖洗，終止染色。蘇木素復(fù)染5 min，用水沖洗，氨水、酸乙醇反藍，脫水后中性樹脂封片。光鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 EGCG對Eca-109細(xì)胞的增殖抑制作用

采用MTT法檢測了EGCG對Eca-109細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果表明，EGCG能夠劑量依賴性地抑制Eca-109的增殖，40 μmol/L時顯示出明顯療效，與對照組相比存在統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.001）。EGCG在本實驗條件下的IC50值為43.22 μmol/L（圖1）。

圖1 EGCG對Eca-109細(xì)胞增殖的影響（***P＜0.001）Figure 1Effect of EGCG on the proliferation of Eca-109 cells（***P＜0.001）

2.2 EGCG對Eca-109細(xì)胞克隆形成的影響

克隆法是體外檢測化合物是否具有抑瘤作用的一個有效方法。表1結(jié)果表明，EGCG能夠抑制Eca-109細(xì)胞的克隆形成，具有濃度依賴性，10 μmol/L EGCG的克隆形成抑制率為72.22%，與對照比較具有顯著差異（P＜0.001）。EGCG對Eca-109細(xì)胞克隆形成的IC50值為28.49 μmol/L。

2.3 EGCG對Eca-109細(xì)胞凋亡的影響

細(xì)胞凋亡是化合物或藥物抑制細(xì)胞增殖的一個途徑，本文采用Annexin V-FITC雙染法經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡。結(jié)果表明，EGCG處理細(xì)胞48 h能夠劑量依賴性地誘導(dǎo)Eca-109細(xì)胞凋亡，60和80 μmol/L EGCG都能顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，凋亡百分率分別為（21.70±0.62）%、（57.13± 9.09）%，其凋亡百分率和對照比較均存在統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.001）（圖2）。

表1 EGCG對Eca-109細(xì)胞的克隆形成的影響Table 1Effect of EGCG on colony formation of Eca-109 cells

2.4 EGCG與Cet聯(lián)用對Eca-109細(xì)胞增殖的影響

本研究采用MTT法檢測了EGCG與Cet聯(lián)用對Eca-109細(xì)胞增殖的影響。實驗中采用的藥物作用濃度分別為10 μmol/L EGCG、1 μg/ml Cet。實驗采用兩種加藥順序，先加EGCG 2 h，再加Cet（圖3A）；或者先加Cet 2 h，再加EGCG（圖3B），兩種順序均兩藥共同作用72 h。圖3A表明，Cet能夠顯著抑制Eca-109細(xì)胞增殖，與對照相比具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），兩藥聯(lián)用，作用明顯增強，此種情況下CDI值為1.05。圖3B也表明，兩藥聯(lián)用作用明顯增強，CDI值為1.11。從以上CDI值均大于1可以看出，兩藥聯(lián)用沒有相加或協(xié)同作用，但存在增強作用。

2.5 EGCG與西妥昔單抗聯(lián)用對Eca-109裸鼠移植瘤的影響

動物實驗是評價藥物或化合物抑制腫瘤生長是否有效的金標(biāo)準(zhǔn)，因此本實驗中采用食管癌裸鼠移植瘤實驗觀察了兩藥聯(lián)合應(yīng)用的情況。本實驗中，Cet采用20 mg/kg。圖4結(jié)果表明，在本實驗劑量條件下，Cet、EGCG和兩者聯(lián)用對動物體重均沒有明顯的影響，聯(lián)用情況下，動物體重也是逐漸增加的，因此說明此劑量條件下無論是單藥還是聯(lián)用均對動物沒有明顯毒性。圖5是腫瘤的生長曲線，從中可以看出，單用EGCG能夠劑量依賴性地抑制腫瘤的生長，Cet對Eca-109移植瘤的生長也具有生長抑制作用，兩者聯(lián)用作用明顯增強。從剝離瘤塊后稱重結(jié)果可以看出，各劑量組均能顯著抑制腫瘤的生長（P＜0.05），且兩藥聯(lián)用的CDI值在1～1.06之間，接近1，因此具有一定的相加作用。

圖2 EGCG對Eca-109細(xì)胞凋亡的影響（***P＜0.001）（A～D為凋亡的散點圖；A：0 μmol/L；B：40 μmol/L；C：60 μmol/L；D：80 μmol/L；E：三次實驗的平均結(jié)果圖）Figure 2Effect of EGCG on the apoptotic rate of Eca-109 cells（***P＜0.001）（A-D was a scatter plot of apoptosis；A：0 μmol/L；B：40 μmol/L；C：60 μmol/L；D：80 μmol/L；E：Average result of triple）

圖3 EGCG與Cet聯(lián)用對Eca-109細(xì)胞增殖的影響（*P＜0.05，***P＜0.001）（A：EGCG預(yù)處理2 h，兩藥共同作用72 h；B：Cet預(yù)處理2 h，兩藥共同作用72 h）Figure 3Effect of the combination of EGCG and Cet on the proliferation of Eca-109 cells（*P＜0.05，***P＜0.001）（A：The cells were pretreated with EGCG for 2 h，followed by exposure to both drugs for 72 h；B：The cells were pretreated with Cet for 2 h，followed by exposure to both drugs for 72 h）

2.6 EGCG與Cet聯(lián)用對腫瘤組織中血管形成的影響

處理動物，腫瘤組織進行石蠟切片包埋并進行免疫組化實驗。實驗中采用CD31抗體作為一抗，研究化合物對血管形成的影響。圖6結(jié)果表明，Cet作用后，瘤塊中的新生血管明顯減少，EGCG作用后新生血管較對照組有所減少，但不如Cet組明顯，兩者聯(lián)用后，新生血管明顯減少。

圖4 EGCG與Cet聯(lián)用對攜帶移植瘤裸鼠體重的影響Figure 4Effect of the combination of EGCG and Cet on the body weight of nude mice with tumor xenografts of Eca-109 cells

圖5 EGCG與Cet聯(lián)用對Eca-109裸鼠移植瘤的生長抑制作用Figure 5Combination of EGCG and Cet inhibited the growth of tumor xenografts of Eca-109 cells in nude mice

圖6 EGCG和Cet聯(lián)用對血管形成的影響［A：對照；B：EGCG（150 mg/kg）；C：Cet（20 mg/kg）；D：EGCG（150 mg/kg）+Cet（20 mg/kg）；圖中箭頭表示新生血管（×200）］Figure 6Effect of the combination of EGCG and Cet on the angiogenesis［A：Control；B：EGCG（150 mg/kg）；C：Cet（20 mg/kg）；D：EGCG（150 mg/kg）+Cet（20 mg/kg）；The direction of the arrow showed the neovascularization（×200）］

3 討論

眾所周知，茶葉具有一定的防癌功能。EGCG是茶葉具有生物學(xué)活性的主要成分，兼具一定的抗腫瘤作用。EGCG能夠抑制肝癌細(xì)胞生長，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，引起肝癌細(xì)胞周期阻滯，這些與EGCG抑制Akt信號通路相關(guān)［8］。因此，我們研究了EGCG對Eca-109細(xì)胞增殖和克隆形成的影響，同時觀察了EGCG的凋亡誘導(dǎo)作用。本研究結(jié)果表明，EGCG能夠劑量依賴性地抑制食管癌細(xì)胞Eca-109的增殖，在體外具有顯著的抑制腫瘤細(xì)胞生長和克隆形成的作用，同時，其還具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的功能，凋亡也是化合物或藥物引起腫瘤細(xì)胞死亡的機制之一。但是，EGCG對食管癌細(xì)胞作用的分子機制還有待進一步研究。

腫瘤靶向治療是近年來腫瘤研究的熱點，由于EGFR在腫瘤中高表達，它已經(jīng)成為腫瘤治療的靶點［9］。腫瘤化療一般以聯(lián)合治療為主，靶向藥物也需要與傳統(tǒng)的化療藥物聯(lián)用來達到治療腫瘤的最大效能。Cet主要通過拮抗EGFR信號通路發(fā)揮抗腫瘤作用，與之相聯(lián)用的化療方案正在進行不同腫瘤的臨床試驗［10-11］。本研究將EGCG與Cet聯(lián)用，結(jié)果表明，在體外，兩者聯(lián)用對Eca-109的細(xì)胞增殖具有一定的增強作用。體內(nèi)試驗表明，EGCG和Cet單獨應(yīng)用也能明顯抑制攜帶Eca-109裸鼠移植瘤的生長，兩者聯(lián)用能夠顯著抑制移植瘤的生長，強于單獨用藥組。

CD31為內(nèi)皮細(xì)胞分子標(biāo)記［12］，EGCG和Cet都具有血管形成抑制作用，因此該研究也進行了CD31表達的免疫組化分析。結(jié)果表明，Cet能夠明顯抑制腫瘤組織中的血管形成，EGCG具有較Cet弱的血管形成抑制作用，兩者聯(lián)用后血管形成抑制作用明顯增強。EGCG與Cet聯(lián)用產(chǎn)生明顯抗腫瘤作用的機制可能與它們抑制腫瘤血管形成相關(guān)。本研究為EGCG的抗腫瘤作用提供一些實驗依據(jù)，為茶多酚開發(fā)成藥提供了一些思路。

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MethodsMTT assay and colony formation assay were used to detect the effect of cell proliferation.Cellular apoptosis was examined using flow cytometry.Animal experiments were performed to evaluate the reduced growth of tumor xenograft in nude mice administrated by EGCG and cetuximab.Immunohistochemical technique was applied to examine the expression of endothelial cells in tumor tissue.

ResultsEGCG inhibited the proliferation of Eca-109 cells in a dose-dependent manner and the IC50value was 43.22 μmol/L.The results from colony formation assay showed that EGCG dose-dependently decreased the number of colony formation at the IC50value of 28.49 μmol/L.EGCG also induced apoptosis of Eca-109 cells and the percentage of apoptosis was（21.70±0.62）%and（57.13±9.09）%at the concentration of 60 and 80 μmol/L，respectively.The inhibitory effect of the combination of EGCG and cetuximab on the proliferation was more potent than that of either single treatment with EGCG or cetuximab，indicating an additive effect for the combination treatment.At the same time，the combination reduced the growth of tumor xenografts in nude mice more potently than EGCG or cetuximab alone.Moreover，expression level of CD31 in the tumor tissue from xenografts in the combination group was decreased more significantly than that of single EGCG or cetuximab treatment.

ConclusionEGCG inhibits the proliferation and colony formation，and induces significantly apoptosis in human esophageal cancer cell line Eca-109.An additive effect was observed for the combination of EGCG and cetuximab treatment on the growth of Eca-109 cells in vitro and in vivo.

Antitumor effect of the combination of EGCG and cetuximab on the human esophageal cancer cell line Eca-109 in vitro and in vivo

SHANG Yue，LIU Xu-jie，CHEN Shu-zhen

ObjectiveTo explore the antitumor effect of the combination of EGCG and cetuximab on human esophageal cancer cell line Eca-109 in vitro and in vivo.

Catechols；Drug screening assays，antitumor；Esophageal neoplasms；Cetuximab

CHEN Shu-zhen，Email：bjcsz@imb.pumc.edu.cn

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2015.01.005

國家自然科學(xué)基金（81373437）；“重大新藥創(chuàng)制”國家科技重大專項（2012ZX09301-002-001-022）

100050北京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所腫瘤室

陳淑珍，Email：bjcsz@imb.pumc.edu.cn

2014-04-29

www.cmbp.net.cn中國醫(yī)藥生物技術(shù)，2015，10（1）：18-24

AuthorAffiliation:Department of Oncology，Institute of Medicinal Biotechnoloty，Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical College，Beijing 100050，China

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol，2015，10（1）：18-24