聶偉偉，唐 林，韋 鳳，陳龍邦，張辰宇，朱 琳，李冬海，管曉翔

(基礎(chǔ)研究)

miR-144/451基因簇調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的生物信息學(xué)分析

聶偉偉，唐 林，韋 鳳，陳龍邦，張辰宇，朱 琳，李冬海，管曉翔

目的 生物信息學(xué)方法是預(yù)測miRNA二級結(jié)構(gòu)及miRNA靶基因的有用工具。miRNA、轉(zhuǎn)錄因子和靶基因之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)參與多種生理、病理活動的分子機制。文中用生物信息學(xué)方法預(yù)測mir-144/451基因簇的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。 方法運用多個在線數(shù)據(jù)庫，研究miR-144/451基因簇的上游轉(zhuǎn)錄因子及下游靶基因間的多個反饋和前反饋環(huán)路，對參與miR-144/451基因簇調(diào)控環(huán)路的基因進行功能聚類分析，繪制miR-144/451基因簇的核心調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。結(jié)論miR-144/451基因簇與其上游轉(zhuǎn)錄因子GATA1有17個共調(diào)控的靶基因，與生物體蛋白磷酸化、性腺發(fā)育、上皮細胞分化、葡萄糖代謝等生化學(xué)過程密切相關(guān)，并參與胰島素信號通路、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號通路、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)信號通路、自然殺傷細胞介導(dǎo)的細胞毒作用、Toll樣受體信號通路、ErbB信號通路及黃體酮調(diào)節(jié)卵細胞成熟等體內(nèi)重要生理過程。結(jié)果對miR-144/451基因簇調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的生物信息學(xué)分析有助于理解其在細胞發(fā)育、細胞周期調(diào)控和腫瘤發(fā)生過程中的作用機制，為后續(xù)實驗提供了理論依據(jù)。

微小RNA;miR-144/451基因簇;生物信息學(xué);反饋環(huán)路;基因功能

0 引 言

微小RNA(microRNA，miRNA)是具有基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控作用的非編碼單鏈小RNA［1］，在細胞增殖、分化、發(fā)育以及細胞凋亡等生理過程以及疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［2］。miRNA的表達水平及活性在不同組織及不同時間內(nèi)表現(xiàn)出明顯差異［3］，其確切機制尚未明確。

靶基因的轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平分別受轉(zhuǎn)錄因子和miRNA調(diào)控，同時miRNA的表達水平依賴于轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控［4］。因此靶基因、轉(zhuǎn)錄因子和miRNA三者之間存在由多條反饋環(huán)路和前反饋環(huán)路構(gòu)成的復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)［5］。miRNA參與的反饋環(huán)路是指miRNA可以反作用于調(diào)控其自身表達的轉(zhuǎn)錄因子。miRNA參與的前反饋環(huán)路是指miRNA上游的轉(zhuǎn)錄因子除了通過miRNA間接調(diào)控靶基因，還可以直接調(diào)控靶基因，即miRNA和其上游轉(zhuǎn)錄因子共調(diào)控同一靶基因。

miR-144/451基因簇編碼miR-144和miR-451 2個miRNA，參與基因調(diào)控、哺乳動物紅細胞生成［6］等生理活動和白血病、淋巴瘤［7］、肺癌［8］等腫瘤發(fā)生發(fā)展，并與藥物耐藥現(xiàn)象密切相關(guān)［9］。本研究采用生物信息學(xué)方法，綜合多個在線數(shù)據(jù)庫的信息，探索miR-144/451基因簇與上游轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor，TF)及下游靶基因間的調(diào)控關(guān)系，分析尋找miR-144/451基因簇與其上游轉(zhuǎn)錄因子之間存在的反饋和前反饋環(huán)路，并對其進行功能綜合分析，精確地繪制出該基因簇調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，深入了解miR-144/451基因簇相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展機制，為臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 在線數(shù)據(jù)庫本研究使用的數(shù)據(jù)庫如下:轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫TransmiR數(shù)據(jù)庫(http://202.38.126.151/hmdd/mirna/tf);轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫 TRANSFAC (http://www.gene-regulation.com/pub/databases);靶基因數(shù)據(jù)庫miRWalk(http://www.ma.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk);啟動子序列數(shù)據(jù)庫UCSC(http://genome.ucsc.edu);jaspar-core數(shù)據(jù)庫(http://jaspar.cgb.ki.se)。功能聚類分析采用DAVID基因功能富集分析數(shù)據(jù)庫(http://david.abcc.ncifcrf.gov)。

1.2 方法

1.2.1 獲取miR-144/451基因簇的上游TF-1從調(diào)控microRNA的TF數(shù)據(jù)庫TransmiR［10］獲得調(diào)控miR-144/451基因簇的上游TF-1。

1.2.2 獲取miR-144/451基因簇的靶基因從綜合性數(shù)據(jù)庫miRWalk［11］獲得經(jīng)實驗證實的 miR-144/451基因簇各個miRNA成員靶基因。

1.2.3 獲取miR-144/451基因簇靶基因的轉(zhuǎn)錄因子用加州大學(xué)圣克魯斯分校(University of California Santa Cruz)的基因參考序列數(shù)據(jù)庫 UCSC搜索miR-144/451基因簇各成員靶基因的上游-2000到200 bp啟動子序列中轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，選取相關(guān)系數(shù)分值大于0.9(最大相關(guān)系數(shù)分值為1)的轉(zhuǎn)錄因子，并與jaspar-core數(shù)據(jù)庫及TRANSFAC數(shù)據(jù)庫中人種屬的轉(zhuǎn)錄因子進行校對，得到miR-144/451基因簇靶基因的TF-2。

1.2.4 獲取參與miR-144/451基因簇調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的反饋環(huán)路和前反饋環(huán)路比較調(diào)控miR-144/451基因簇的上游轉(zhuǎn)錄因子和調(diào)控miR-144/451基因簇靶基因的轉(zhuǎn)錄因子，獲得重疊轉(zhuǎn)錄因子，從而獲得既受重疊轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控又受miR-144/451基因簇調(diào)控的共調(diào)控靶(join target)基因。綜合分析獲得參與miR-144/451基因簇調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的反饋和前反饋環(huán)路。

1.2.5 獲取miR-144/451基因簇調(diào)控網(wǎng)絡(luò)用DAVID數(shù)據(jù)庫分析參與miR-144/451基因簇反饋和前反饋環(huán)路中的基因的功能，繪制miR-144/451基因簇的核心調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。

圖1 miR-144/451基因簇調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖Figure 1 Flow shart of the miR-144/451 cluster mediated regulation network

2 結(jié) 果

2.1 miR-144/451基因簇的上游轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄因子通過與靶基因的啟動子區(qū)結(jié)合在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控其表達。轉(zhuǎn)錄因子受miRNA調(diào)控，而miRNA的表達水平依賴于轉(zhuǎn)錄因子為主的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制，所以轉(zhuǎn)錄因子和miRNA之間存在協(xié)同作用和相互調(diào)控的關(guān)系。TransmiR數(shù)據(jù)庫收集了大量經(jīng)實驗驗證的調(diào)控miRNA轉(zhuǎn)錄因子。我們利用TransmiR數(shù)據(jù)庫得到miR-144/451基因簇的4個上游轉(zhuǎn)錄因子GATA1、GATA4、SMAD3、Tcf3。

2.2 miR-144/451基因簇調(diào)控的靶基因通過結(jié)合靶基因mRNA的3'-UTR端，miRNA抑制mRNA表達，并促進其降解，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達［12］。miRWalk數(shù)據(jù)庫是miRNA的綜合數(shù)據(jù)庫，數(shù)據(jù)來源于軟件預(yù)測和文獻挖掘，收錄了包括miRNA靶基因以及 miRNA與信號通路、疾病及組織特異性表達相關(guān)的數(shù)據(jù)信息。利用miRWalk數(shù)據(jù)庫得到miR-144/451基因簇各miRNA成員的靶基因共103個，其中miR-144和miR-451共同調(diào)控的靶基因有17個，見表1。

表1 miR-144/451基因簇的靶基因Table 1 Target genes of the miR-144/451 cluster

2.3 調(diào)控miR-144/451基因簇靶基因的轉(zhuǎn)錄因子采用一致序列匹配方法在Match數(shù)據(jù)庫搜索調(diào)控miR-144/451基因簇的103個靶基因的轉(zhuǎn)錄因子，見表1。其中26個基因未找到對應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子。為了避免過多的假陽性結(jié)果，我們只篩選出轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點相關(guān)系數(shù)分值大于0.9的轉(zhuǎn)錄因子，最大相關(guān)系數(shù)為1。結(jié)合JASPAR數(shù)據(jù)庫和TRANSFAC數(shù)據(jù)庫收集的294個人的轉(zhuǎn)錄因子。篩選得到的調(diào)控miR-144/451基因簇轉(zhuǎn)錄因子共17個，分別為Arnt、Ap-4、c-Myb、ER、GATA1、GATA2、GATA3、HLF、MyoD、NKx2-5、Oct-1、P54、P65、pax6、SOX9、USF、YY1。

2.4 miR-144/451基因簇調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中反饋和前反饋環(huán)路轉(zhuǎn)錄因子既可調(diào)控相關(guān)靶基因，又可調(diào)控miRNA。將調(diào)控miR-144/451基因簇的轉(zhuǎn)錄因子和調(diào)控miR-144/451基因簇靶基因的轉(zhuǎn)錄因子進行對比，得到既調(diào)控miR-144/451，又調(diào)控miR-144/451基因簇靶基因的重疊轉(zhuǎn)錄因子GATA1。同時篩選出GATA1所調(diào)控的miR-144/451基因簇的靶基因共14個，見表2，進而得到miR-144/451基因簇各成員靶基因和GATA1參與的前反饋環(huán)路。

表2 轉(zhuǎn)錄因子、miR-144/451和共調(diào)控靶基因組成的前反饋環(huán)路Table 2 Feedforward loops among TFs，miR-144/451 and joint targets

2.5 參與miR-144/451基因簇反饋和前反饋環(huán)路的基因功能分析結(jié)果將參與miR-144/451基因簇反饋和前反饋環(huán)路的14個基因映射到DAVID數(shù)據(jù)庫，進行基因分類分析(gene ontology，GO)和KEGG信號通路功能聚類分析，結(jié)果見表3、表4，可以看出這14個基因參與調(diào)節(jié)蛋白磷酸化、性腺發(fā)育、上皮細胞分化、葡萄糖代謝等生化過程，并參與胰島素信號通路、mTOR信號通路、VEGF信號通路、自然殺傷細胞介導(dǎo)的細胞毒作用、Toll樣受體信號通路、ErbB信號通路及黃體酮調(diào)節(jié)的卵細胞成熟等體內(nèi)重要生理過程。因此證明miR-144/451基因簇和上游轉(zhuǎn)錄因子的共調(diào)控靶基因在多種細胞生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用。

表3 miR-144/451基因簇調(diào)控的靶基因的GO功能分析結(jié)果Table 3 Gene ontology analysis on the targets of the miR-144/451 cluster

表4 miR-144/451基因簇調(diào)控的靶基因的KEGG pathway分析結(jié)果Table 4 KEGG pathway analysis on the targets of the miR-144/451 cluster

2.6 構(gòu)建miR-144/451基因簇的核心調(diào)控網(wǎng)絡(luò)綜合以上分析結(jié)果，繪制出以miR-144/451基因簇的核心調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。

圖2 miR-144/451基因簇的核心調(diào)控網(wǎng)絡(luò)Figure 2 Core regulation network for the miR-144/451 cluster

3 討 論

miRNA在細胞增殖、分化、發(fā)育以及細胞凋亡等生理過程以及腫瘤形成等病理過程中發(fā)揮重要作用。生物信息學(xué)是處理大量生物信息的新的研究手段，應(yīng)用生物學(xué)、數(shù)學(xué)和計算機知識，利用多種數(shù)據(jù)庫，研究和分析生命體細胞、組織、器官的生理、病理和藥理過程中的各種生物信息，從而全面、深刻地揭示生命科學(xué)的本質(zhì)問題。生物信息學(xué)在miRNA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測、miRNA靶基因的預(yù)測等研究中起重要作用。本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)揭示了miR-144/451與其上游轉(zhuǎn)錄因子及相應(yīng)基因組成的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，有助于進一步研究該miRNA分子功能的理論和方法。

轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合靶基因調(diào)控區(qū)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，既可激活基因的表達，也可抑制基因的表達。因此，轉(zhuǎn)錄因子既可以啟動某些特定基因的表達，使細胞向特定方向分化;也可以關(guān)閉某些特定基因表達，解除細胞向特定細胞分化所受到的抑制作用，使細胞向特定方向分化。miRNA的作用方式與轉(zhuǎn)錄因子作用相似［13］。真核生物的轉(zhuǎn)錄因子可以與同源性的順式作用元件相結(jié)合，但轉(zhuǎn)錄因子和這些順式作用元件結(jié)合的親合力并不相同。因此，某個轉(zhuǎn)錄因子可與多個順式作用元件結(jié)合。反之，同一順式元件也能和多個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合。miRNA與mRNA 3' UTR區(qū)的結(jié)合并不需要完全配對。因此，某個miRNA可與多個同源性結(jié)合位點結(jié)合，而同一順式作用元件即miRNA結(jié)合位點也可以與多個miRNA相互作用［14］。研究發(fā)現(xiàn)某些miRNA可抑制［15－16］或者激活［17］其mRNA靶基因的表達水平，因而miRNA可在翻譯水平發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。隨著對miRNA的深入研究，發(fā)現(xiàn)miRNA基因的表達受到復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，這種調(diào)控作用可以是直接作用，也可以是某種轉(zhuǎn)錄因子通過其他轉(zhuǎn)錄因子間接調(diào)控其相應(yīng)的miRNA［18］。許多轉(zhuǎn)錄因子自身的表達受到 miRNA的調(diào)控。因此轉(zhuǎn)錄因子和miRNA是基因表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分和樞紐，協(xié)同調(diào)控靶基因的表達。轉(zhuǎn)錄因子和miRNA構(gòu)成基因表達調(diào)控的反饋環(huán)路和前反饋環(huán)路。miRNA參與的反饋環(huán)路是指miRNA可以反作用于調(diào)控其自身表達的轉(zhuǎn)錄因子。反饋環(huán)路可有效降低細胞信號網(wǎng)絡(luò)的噪音和波動，或者促進細胞從一種狀態(tài)快速轉(zhuǎn)換成另一種狀態(tài)。miRNA參與的前反饋環(huán)路是指miRNA上游的轉(zhuǎn)錄因子除了通過miRNA間接調(diào)控靶基因，還可以直接調(diào)控靶基因，即miRNA和其上游轉(zhuǎn)錄因子共調(diào)控同一靶基因。前反饋環(huán)路又分為一致前反饋環(huán)路和不一致前反饋環(huán)路。在一致前饋環(huán)路中，TF通過調(diào)控miRNA能更有效地向下游共調(diào)控靶基因傳遞信號。在不一致前饋環(huán)路中，miRNA則可阻止噪音刺激引發(fā)的網(wǎng)絡(luò)響應(yīng)以及防止信號的過度激活。這些前反饋與反饋環(huán)路間的相互協(xié)同作用便于基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)信號的放大、減弱和持續(xù)性，進而指導(dǎo)細胞對外界刺激做出最適應(yīng)答［5］。

Re等［19］于2009年對人類轉(zhuǎn)錄因子、microRNA和基因之間存在的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進行總結(jié)，為該構(gòu)想理論提供了更多依據(jù)。c-Myc、E2F和miR-17-5p/miR-20a調(diào)控環(huán)路是經(jīng)實驗驗證的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)之一。c-Myc可直接激活細胞周期相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(transeription factor1/3，E2F1/3)的轉(zhuǎn)錄，同時又可通過miR-17-5p和miR-20a轉(zhuǎn)錄后抑制 E2F1/3，進而精細調(diào)控E2F1/3蛋白表達水平，而E2F1/3也可激活髓細胞增生原癌基因(myelocytomatosis oncogene，MYC)和miR-17-5p的轉(zhuǎn)錄［20］。這些調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的存在一定程度上證實了miR-144/451基因簇調(diào)控網(wǎng)絡(luò)存在的可能性。

GATA1是重要的造血轉(zhuǎn)錄因子，在網(wǎng)織紅細胞和巨噬細胞的分化成熟中起著關(guān)鍵作用，并調(diào)控與該過程密切相關(guān)的基因［21］。我們的分析結(jié)果顯示GATA1與miR-144/451基因簇共同調(diào)控的靶基因廣泛地參與細胞的多種生物學(xué)過程。實驗證明GATA1和miR-144/451之間的調(diào)控作用在紅細胞生成中起關(guān)鍵作用［22］。這些被共調(diào)控的靶基因的具體功能尚有待實驗研究進一步證實。

通過本研究我們得到miR-144/451基因簇與其上游轉(zhuǎn)錄因子及下游共調(diào)控靶基因構(gòu)成精密復(fù)雜的基因表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，協(xié)調(diào)細胞對外界刺激做出適當(dāng)?shù)膽?yīng)答，進而維持細胞的正常功能。同時miR-144/451基因簇調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的反饋和前反饋環(huán)路之相互間的穩(wěn)定關(guān)系是維持細胞正常功能的關(guān)鍵因素，否則將會引起多個信號通路發(fā)生改變，甚至導(dǎo)致細胞的惡性轉(zhuǎn)化。多項研究結(jié)果證明miR-144/451基因簇的功能異?？蓪?dǎo)致紅細胞生成障礙，進而引起多種血液疾病［22－23］。因此，對miR-144/451基因簇調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進行詳細而全面的研究，不僅能揭示miR-144/451基因簇的生物學(xué)功能，而且為闡明與其相關(guān)疾病的發(fā)病機制提供了新的理論基礎(chǔ)，也為臨床疾病治療提供了新的治療靶點［24］。

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Bioinformatic analysis of the miR-144/451 cluster mediated regulation network

NIE Wei-wei1，TANG Lin1，WEI Feng1，CHEN Long-bang1，ZHANG Chen-yu2，ZHU Lin3，LI Dong-hai2，Guan Xiao-xiang1
(1.Department of Medical Oncology，School of Medicine，Nanjing University/Nanjing General Hospital of Nanjing Military Command，PLA，Nanjing210002，Jiangsu，China;2.Jiangsu Research Center for MicroRNA Engineering，State Key Laboratory of Pharmaceutical Biotechnology，School of Life Sciences，Nanjing University，Nanjing210093，Jiangsu，China;3.Institute of Discovery Biology，Jiangsu Simcere Pharmaceutical R＆D Co.，Ltd，Nanjing210042，Jiangsu，China)

Objective Bioinformatic methods are useful tools for predicting the secondary structure and target gene of miRNA.The regulation network of miRNAs，transcription factors and target genes is involved in molecular mechanisms of physiological and pathological activities.This study is to predict the miR-144/451 cluster regulation network using online bioinformatic tools.Methods We studied some of the feedforward and feedback loops by integrating compressive information from different online databases.After function analysis of the genes involved in the circuits regulated by the miR-144/451 cluster，we determined the regulation network of the gene cluster. Results There were 17 joint targets of the miR-144/451 cluster and its upstream transcriptional factor GATA1，which played important roles in such biological processes as protein amino acid phosphorylation，gonad development，epithelial cell differentiation and glucose metabolism，as well as in some important signaling pathways，including insulin signaling pathway，mTOR signaling pathway，VEGF signaling pathway，natural killer cell mediated cytotoxicity，progesterone-mediated oocyte maturation，Toll-like receptor signaling pathway，and ErbB signaling pathway. Conclusion Bioinformatic analysis of the regulation network of the miR-144/451 cluster potentially provide a good guideline for deeper insights into its mechanisms of regulating cell development and tumorigenesis.

microRNA;miR-144/451 cluster;Bioinformatic analysis;Feedforward loop;microRNA feedback loop;Gene function

Q522

A

1008-8199(2012)03-0229-05

國家自然科學(xué)基金(81141094，31000323);江蘇省自然科學(xué)基金(BK2011656);高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金(20100091120023，20100091120026)，高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金(1095020823)

210002南京，南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床學(xué)院(南京軍區(qū)南京總醫(yī)院)腫瘤內(nèi)科［聶偉偉(醫(yī)學(xué)碩士)、唐林、韋 鳳、陳龍邦、管曉翔］;210093南京，南京大學(xué)生命科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)重點實驗室，江蘇省小核糖核酸工程研究中心(張辰宇、李冬海); 210042南京，南京市先聲藥業(yè)研究院生物評價研究所(朱 琳)

管曉翔，E－mail:xxguan@hotmail.com

2011-10-17;

2012-01-16)

(責(zé)任編輯:齊 名;英文編輯:羅永合)