王 樂，隋 源，王 顏，韋 博，郝繼龍

（1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 眼科，吉林 長春130021；2.吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長春130012；3.長春市中心醫(yī)院 腎病科，吉林 長春130051；4.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 神經(jīng)外科，吉林 長春130033）

Usher綜合征是一種常見的累及眼和耳疾病的綜合征[1－3]。1858年，第一次描述這個疾病的特征是由一位德國眼科醫(yī)生Albrecht von Grafe開始的，之后便以他的名字命名[4]。1914年，一位英國眼科醫(yī)生，在69例遺傳疾病的基礎(chǔ)上再次報道這種疾病[5]。該病視力受損首先表現(xiàn)夜盲，進而周邊視野逐漸縮小，最終形成管狀視野。聽力受損也是漸進性聽力喪失，最終耳聾。依據(jù)他們的嚴(yán)重程度和發(fā)病時間，Usher綜合征主要分為3種類型，Usher綜合征I型，Usher綜合征II型，Usher綜合征III型[6，7]。以往研究證明espin全長和whirlin全長相互作用，espin是USH2蛋白復(fù)合體里的新成員。但espin的哪個結(jié)構(gòu)域和whirlin存在相互作用還不是很清楚。這對于我們進一步研究USH綜合征的發(fā)病機制起到非常重要的作用。

1 資料與方法

1.1 儀器

PCR儀、電泳儀、電泳槽、倒置顯微鏡、熒光顯微鏡、共聚焦顯微鏡（FV1000，奧林巴斯，東京，日本）。

1.2 實驗方法及步驟

圖1 espin結(jié)構(gòu)域示意圖

1.2.1 如圖1所示，espin由espin＿A，espin＿P，espin＿WH和espin＿M 4個結(jié)構(gòu)域組成，用PCR得到目的基因（片段大小依次為1 050bp、950bp、665bp、488bp），限制性內(nèi)切酶EcoR I和BamH I雙酶切酶切目的基因及GFPC2載體，最終得到 GFP－espin A、GFP－espin P、GFP－espin WH、GFP－espin M質(zhì)粒。以上所有質(zhì)粒均經(jīng)過基因測序檢測驗證。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 于37℃恒溫箱培養(yǎng)COS－7細(xì)胞，DMEM培養(yǎng)液中加入5%胎牛血清。孵育COS－7細(xì)胞24h后，用Lipofectamine 2000（Invitrogen公司）體外進行瞬間轉(zhuǎn)染，即：將0.4μg的兩種目的質(zhì)粒稀釋在30μl的不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，取2μl Lipofectamine 2000加入30μl不含胎牛血清的培養(yǎng)基中，室溫放置10min。最后加入相應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)液中孵育10h。置于共聚焦顯微鏡下照像并保存圖像。

2 結(jié)果

2.1 Espin由4個結(jié)構(gòu)域組成

Espin由espinA、espinP、espinWH和espinM 4個結(jié)構(gòu)域組成。EspinA有8個并列相連重復(fù)序列組成，espinP主要由脯氨酸組成，espinWH是類似威斯科特奧爾德里奇綜合征同源蛋白結(jié)構(gòu)域，espinM是促進肌動蛋白束形成。紅色，藍(lán)色，黃色和綠色的長方形分別在代表espinA、espinP、espinWH和espinM（圖1）。

2.2 Espin多個結(jié)構(gòu)域與whirlin在體外細(xì)胞中熒光蛋白表達共定位

分別把 gfp－espinA、gfp－espinP、gfp－espinWH 和 gfp－espinM 4個質(zhì)粒和mCherry－whirlin轉(zhuǎn)染入COS－7細(xì)胞中，從熒光蛋白表達來看，我們發(fā)現(xiàn)含有g(shù)fp－espinA、gfp－espinP和gfp－espinM這3個espin結(jié)構(gòu)域的質(zhì)粒的熒光蛋白表達都和whirlin全長質(zhì)粒的熒光蛋白表達共定位，只有g(shù)fp－espinWH質(zhì)粒的熒光蛋白表達沒有和whirlin全長的熒光蛋白表達共定位 （圖2）。

3 討論

從實驗結(jié)果來看，在 COS－7細(xì)胞中，gfp－espinA、gfp－espinP和gfp－espinM這3個espin結(jié)構(gòu)域的質(zhì)粒的熒光蛋白表達都和whirlin全長質(zhì)粒的熒光蛋白表達共定位，提示這3個結(jié)構(gòu)域極有可能參與蛋白之間的相互作用，我們推斷espinA和espinP極有可能是調(diào)控下游espinM和肌動蛋白相互作用。但是gfp－espinWH質(zhì)粒的熒光蛋白表達沒有和whirlin全長的熒光蛋白表達共定位，前面提到espinM是促進肌動蛋白束形成，espin微絲和肌動蛋白束相結(jié)合一起，從實驗結(jié)果來看，Gfp－espinWH質(zhì)粒熒光蛋白表達是細(xì)長微絲，mCherry－whirlin質(zhì)粒熒光蛋白表達是彌漫形，二者很明顯沒有共定位，至于espinWH結(jié)構(gòu)域起到什么樣的作用有待于進一步驗證。

圖2 Espin多個結(jié)構(gòu)域與whirlin在體外細(xì)胞中熒光蛋白表達共定位

[1]Boughman JA，Vernon M，Shaver KA.Usher syndrome：definition and estimate of prevalence from two high－risk populations[J].J Chronic Dis，1983，36（8）：595.

[2]Hartong DT，Berson EL，Dryja TP.Retinitis pigmentosa[J].Lancet，2006，368（9549）：1795.

[3]Keats BJ，Corey DP.The usher syndromes[J].Am J Med Genet，1999，89（3）：158.

[4]A.von Graefe.Vereinzelte Beobachtungen and Bemerkungen.Exceptionelles Verhalten des Gesichtsfeldes bei Pigmententartung des Netzhaut.Albrecht Graefes Arch[J].Klin.Ophthalmol，1858，4，250.

[5]C.H.Usher.On the inheritance of retinitis pigmentosa，with notes of cases.R.Lond[J].Ophthalmol.Hosp.Rep，1914，19，130.

[6]Williams DS.Usher syndrome：animal models，retinal function of Usher proteins，and prospects for gene therapy[J].Vision Res.2008，48（3）：433.

[7]Yang J，Wang L，Song H，et al.Current understanding of usher syndrome type II[J].Frontiers in Bioscience in press，2012，17（1）：1165.