孫會忠，王小東，朱金峰 ，李廣良，孫明輝，許自成，宋月芹

1 河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南洛陽 471003；

2 河南省煙草公司漯河市公司，河南漯河市 462000；

3 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，鄭州 450002

烤煙內(nèi)生高溫菌YYFG3的分離鑒定及所產(chǎn)蛋白酶活性

孫會忠1，王小東1，朱金峰2，李廣良2，孫明輝2，許自成3，宋月芹1

1 河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南洛陽 471003；

2 河南省煙草公司漯河市公司，河南漯河市 462000；

3 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，鄭州 450002

通過固體分離培養(yǎng)基的分離培養(yǎng)和牛奶瓊脂鑒別培養(yǎng)基的鑒別初篩，從煙草（Nicotiana tabacum L.）的初烤煙葉中分離到一株嗜熱產(chǎn)蛋白酶菌株，編號為YYFG3，其生長溫度范圍是30℃-65℃，最適生長溫度55℃左右，對pH的耐受范圍是5-9，最適范圍是6-7；在發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，56℃、180 r/min條件下發(fā)酵32 h的蛋白酶活力達(dá)到最大值35.3 U/mL，故將YYFG3定性為產(chǎn)蛋白酶高溫菌株。通過光學(xué)顯微鏡和掃描電子顯微鏡對該菌株形態(tài)特征的觀察、相關(guān)生化特性的測定、16S rDNA的克隆測序以及對菌株分子遺傳進(jìn)化樹的構(gòu)建，確定菌株YYFG3隸屬于土芽孢桿菌屬Geobacillus，暫將其命名為Geobacillus sp.YYFG3。菌株YYFG3可作為產(chǎn)蛋白酶高溫微生物誘變育種和全基因組育種的良好材料，具有良好的開發(fā)應(yīng)用潛力。

煙草；高溫菌；分離；蛋白酶；16S rDNA

高溫菌株往往具有與常溫菌株明顯不同的生物學(xué)特性，它們一般具有高度的特異性，尤其是高溫菌所產(chǎn)的胞外酶活性在高溫條件下能夠保持很好的穩(wěn)定性，克服了在應(yīng)用過程中常溫酶化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定的局限性，能夠更好的適應(yīng)和滿足工業(yè)化開發(fā)利用的需求，已經(jīng)開發(fā)成功的具有嗜熱特性高溫酶已達(dá)幾十種，如蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、糖苷酶、漆酶、硫酸化酶等[1]。蛋白酶占世界酶制劑市場的65%以上，廣泛應(yīng)用于制藥、紡織、食品、皮革等領(lǐng)域[2]。近年來高溫菌及其所產(chǎn)酶在應(yīng)用領(lǐng)域擴(kuò)展迅速，如煙料發(fā)酵[3]、菌肥開發(fā)[4]、垃圾處理[5]等領(lǐng)域。因?yàn)楦邷氐鞍酌傅臒岱€(wěn)定性一般與其產(chǎn)酶菌株的耐熱能力成正比，不管是開發(fā)應(yīng)用還是理論研究，首要條件是分離獲得高溫菌株，而且來源于微生物的蛋白酶都是胞外酶，比動植物來源的蛋白酶易于加工，因此，從不同材料分離高溫菌有著重要的現(xiàn)實(shí)意義，一直是功能微生物的研究熱點(diǎn)之一。

植物內(nèi)生菌是一個(gè)巨大的遺傳多樣性寶庫，植物為內(nèi)生菌提供了多元復(fù)雜的生境，內(nèi)生菌所具備的獨(dú)特的生物學(xué)特性[1]，為高溫菌的分離和開發(fā)提供了更多可能[6]。煙草（Nicotiana tabacum L.）富含生物堿[7]，有著比較特殊的微生物內(nèi)生環(huán)境，而煙葉烘烤是在較高溫度下進(jìn)行的一個(gè)與物理變化相伴隨的復(fù)雜的生理生化過程[8]，該過程會促使具有特殊功能內(nèi)生菌的存在。迄今為止，尚未見關(guān)于烤煙產(chǎn)蛋白酶高溫內(nèi)生菌株分離鑒定的研究報(bào)道?；谝陨媳尘?，本文擬以烤煙為試驗(yàn)材料探索分離培養(yǎng)具有產(chǎn)蛋白酶活性的高溫菌株，旨在豐富產(chǎn)功能酶高溫菌資源。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

烤煙品種：中煙100，由河南省煙草公司漯河市公司提供。

固體分離培養(yǎng)基：蠶蛹干粉3 g，酵母粉5 g，吉蘭糖膠2 g，海藻糖0.5 g，菊糖0.3 g，NaCl 9 g，牡丹根際土壤浸汁200 mL，瓊脂粉18 g，蒸餾水1 000 ml，自然pH。

牛奶瓊脂鑒別培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨5 g，NaCl 5 g，脫脂奶粉15 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1 000 mL，pH7.0。

LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 5 g，蒸餾水 1 000 ml，pH7.0。

發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基：牛肉膏6 g，大豆蛋白胨15 g，KH2PO41.3 g，K2HPO43 g，CaCl22 g，NaCl 2 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，F(xiàn)eSO40.001 g，蒸餾水 1 000 mL，pH7.0。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的分離及篩選

烤煙材料的預(yù)處理：將新鮮煙葉用無菌水充分水洗后，常規(guī)烘烤。烘烤完畢，立即裝入無菌袋中備用。

取2片備用葉材料，用無菌水沖洗，之后用75%乙醇進(jìn)行葉表面浸泡消毒3min，緊接著再次用0.1 mol/L升汞浸泡消毒3min，消毒完成后用無菌水漂洗3次，每次3min，漂洗完成后，在無菌操作條件下用研缽研碎，轉(zhuǎn)入滅菌三角瓶后，加入100 mL無菌水，充分混勻。分別取 50 μL、100 μL、150 μL 不同體積上清液涂布于固體分離培養(yǎng)基，每個(gè)體積涂6個(gè)平板，恒溫培養(yǎng)箱中55 ℃培養(yǎng)48 h后，挑取菌落連續(xù)進(jìn)行3次平板劃線純化，并將純化菌株甘油-20℃保存。取80 μL最后一次漂洗液涂板同步培養(yǎng)作為對照，無雜菌生長視為消毒成功。

將純化菌株接種于牛奶瓊脂鑒別培養(yǎng)基進(jìn)行產(chǎn)蛋白酶初篩，55℃恒溫培養(yǎng)48 h，將具有透明圈者初步定性為具有產(chǎn)蛋白酶活性高溫菌株。

1.2.2 菌株生長溫度范圍及最適溫度測定

菌株在LB液體培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)后（OD600=0.4），以1%的接種量轉(zhuǎn)接至新鮮LB液體培養(yǎng)基，分別在20℃、25℃、30℃、35℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃和70℃溫度下，180 r/min搖床培養(yǎng)36 h。通過測定菌液OD600確定其生長溫度范圍和最適生長溫度。設(shè)3次重復(fù)。

1.2.3 菌株生長pH耐受范圍測定

菌株在LB液體培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)后（OD600=0.4），以1%的接種量轉(zhuǎn)接至新鮮LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基pH分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0等8個(gè)梯度，在55℃、180 r/min搖床培養(yǎng)24 h，通過測定菌液OD600確定其pH耐受范圍及最適pH。設(shè)3次重復(fù)。

1.2.4 菌株生長與產(chǎn)蛋白酶的關(guān)系

菌株在LB液體培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)后（OD600=0.4），以4%接種量接種于發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基，55℃、180 r/min搖床連續(xù)培養(yǎng)60 h，期間每隔4 h取樣一次，分別測定發(fā)酵液OD600和蛋白酶活力。設(shè)3次重復(fù)。蛋白酶活力采用Folin-酚法測定，步驟參考文獻(xiàn)[9]進(jìn)行。

1.2.5 菌株的鑒定

①表型及生化特征

應(yīng)用光學(xué)顯微鏡和掃描電子顯微鏡對菌株進(jìn)行形態(tài)觀察[10]；生理生化指標(biāo)測定方法參考文獻(xiàn)[11]、[12]進(jìn)行。

②菌株的16S rDNA分析

將目標(biāo)菌株接種于LB培養(yǎng)基，37 ℃，180 r/min搖床培養(yǎng)12 h，獲取菌液。采用TaKaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction kit Ver. 2.0 試劑盒提取YYFG3基因組DNA。

擴(kuò)增引物：正向引物27F：5′ -AGAGTTTGATCCT GGCTCAG-3′ ，反向引物：1492R：5′ -TAGGGTTA CCTTGTTACGACTT-3′ 。 擴(kuò) 增 體 系（20 μL）：10×Ex Taq PCR buffer 2 μL，dNTP（10 mmol/mL）1.6 μL，正向和反向引物（20 μm/mL）各 1 μL，DNA 模板 1 μL，Ex Taq DNA 聚合酶 0.2 μL，超純水13.2 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5min；94 ℃變性 50 s，50 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1min 30 s，循環(huán)35次；72 ℃最終延伸10min。目的片段長度約為1.5 kb，PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳后，采用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction kit Ver. 3.0對目的條帶進(jìn)行膠回收，回收產(chǎn)物與TaKaRa pMDTM18-T Vecter質(zhì)粒載體連接，并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化于大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)12 h，藍(lán)白斑篩選后，選取陽性克隆搖菌送測（由北京奧克鼎盛生物科技有限公司完成）。

將測序獲得的16S rDNA序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫在線進(jìn)行相似性比對，采用MEGA6.06軟件構(gòu)建Neighbor-Joining分子遺傳進(jìn)化樹。菌株形態(tài)學(xué)和生化鑒定參考文獻(xiàn)[13]、[14]和[15]進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 目標(biāo)菌株的獲得

通過固體分離培養(yǎng)基的分離和牛奶瓊脂培養(yǎng)基的鑒別培養(yǎng)，分離篩選出一株水解圈大而顯著的菌株，編號為YYFG3，其水解圈直徑/菌落直徑比為4.6（圖1），初步確定為目標(biāo)菌株。

圖1 YYFG3在牛奶瓊脂平板上的水解圈Fig. 1 Hydrolysis circle of strain YYFG3 in milk culture medium

2.2 YYFG3的生長特性

由圖2可知，菌株YYFG3在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，25℃以下和70℃以上均不能生長，30℃和65℃能夠生長，但長勢較弱，其它溫度下菌株均能夠較好生長，55℃培養(yǎng)時(shí)的OD600值最大，所以，菌株對溫度的響應(yīng)范圍在30℃-65℃之間，最適生長溫度55℃左右。圖3則表明，菌株YYFG3生長的pH耐受范圍是5≤pH≤9，最適生長pH6-7。

圖2 溫度對菌株生長的影響Fig.2 Effect of temperature on bacterial growth

圖3 pH對菌株生長的影響Fig.3 Effect of pH on bacterial growth

2.3 YYFG3的生長與產(chǎn)蛋白酶曲線

如圖4，菌株YYFG3在發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)約60 h的歷程中，菌株生長曲線呈現(xiàn)較為典型的“S”型曲線，發(fā)酵約8 h開始進(jìn)入對數(shù)生長期，產(chǎn)蛋白酶活性在發(fā)酵24 h時(shí)躍變較為明顯，從發(fā)酵28 h開始，蛋白酶活性開始進(jìn)入高點(diǎn)，直至52 h，酶活性始終比較穩(wěn)定，說明產(chǎn)酶能力主要在發(fā)酵后期菌體生物量最大的穩(wěn)定期。發(fā)酵約44 h，菌株開始進(jìn)入衰亡期，但產(chǎn)酶活性卻下降平緩，說明產(chǎn)酶活性不但集中菌株生長曲線的穩(wěn)定期和衰亡前期，而且酶活性持續(xù)時(shí)間長且較為穩(wěn)定。所以，菌株YYFG3蛋白酶產(chǎn)量與生長曲線具有一定相關(guān)性。

圖4 菌株YYFG3的蛋白酶活性Fig.4 Enzyme production of strain YYFG3

2.4 菌株YYFG3的鑒定

2.4.1 表型特征

菌株YYFG3大小 1.1-2.8μm×0.8-1.6μm，無莢膜，能運(yùn)動；在LB平板上55 ℃培養(yǎng)18 h，可觀察到單菌落近圓形，邊緣不整齊，直徑2-4mm，表面粗糙，隆起不十分明顯，扁平狀，菌落灰白色（圖5-A）；芽孢橢圓形，位于中間或次極端（圖5-B）。掃描電鏡下可見典型直桿型菌體，兩端鈍圓，具側(cè)生鞭毛（圖5-C）。

圖5 菌株YYFG3的表型特征Fig.5 The general characteristics of strain YYFG3

2.4.2 生理生化特性

對菌株YYFG3進(jìn)行的生理生化指標(biāo)測定結(jié)果表明，菌株相關(guān)生化特征與文獻(xiàn)[13]和[14]和[15]中土芽孢桿菌屬描述基本一致（表1）。

表1 菌株YYFG3的生理生化指標(biāo)測定結(jié)果Tab.1 Determination results of physiological and biochemical index of strain YYFG3

2.4.3 16S rDNA分析

菌株YYFG3的16S rDNA序列PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖6所示。

圖6 菌株YYFG3的16S rDNA序列擴(kuò)增結(jié)果Fig.6 The ampli fi cation results of 16S rDNA sequence of strain YYFG3

將目的條帶進(jìn)行切膠回收，并與質(zhì)粒連接后，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，送測陽性克隆獲得的YYFG3菌株16S rDNA序列長度為1517 bp，將結(jié)果提交GenBank，序列號為KR362555。將菌株16S rDNA基因序列提交NCBI（National Center for Biotechnology Information）數(shù)據(jù)庫的blast程序進(jìn)行相似性比對，并選取相似度高的菌株序列構(gòu)建菌株YYFG3的分子遺傳進(jìn)化樹（圖7）。結(jié)果顯示，菌株YYFG3與土芽孢桿菌屬的Geobacillus pallidus strain P4和G. Pallidus strain BGSC109A1聚為同一分支，與二者的相似性均達(dá)到99%，且bootstrap值也達(dá)到99%。綜合該菌株的形態(tài)特征、生理生化特性和分子遺傳進(jìn)化樹分析，將菌株YYFG3歸為土芽孢桿菌屬Geobacillus，暫命名為Geobacillus sp. YYFG3。

圖7 基于16S rDNA基因序列的YYFG3系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig. 7 Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequences of YYFG3

3 結(jié)論與討論

通過本研究，主要得出以下結(jié)論：（1）對烤煙進(jìn)行嚴(yán)格的表面消毒后，仍然能夠分離到能夠耐受65℃高溫菌活體純培養(yǎng)物，說明煙葉經(jīng)過烘烤后，確實(shí)有高溫菌的存在；（2）菌株YYFG3在56℃、180 r/min條件下發(fā)酵發(fā)酵歷程中，蛋白酶活力最高達(dá)到了35.3 U/mL，說明該菌株在高溫條件下具有較高的產(chǎn)蛋白酶活性，在烤制過程中對品質(zhì)形成可能起著一定的作用；（3）菌株YYFG3經(jīng)過多項(xiàng)分類鑒定，確定隸屬于土芽孢桿菌屬（Geobacillus），該屬是從原芽孢桿菌屬（Bacillus）分離出來的一個(gè)新屬，具有嗜熱的共同特性，從系統(tǒng)歸屬的角度來看，YYFG3菌株具有產(chǎn)耐高溫功能酶的可能。

高溫菌一般的溫度界定范圍是最低生長溫度為25℃-50℃，最適生長溫度為55℃，最高生長溫度為60～70℃[1]。參照這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，菌株YYFG3在30-65℃溫度范圍均可以生長，55℃生長最好，完全符合高溫菌對溫度的響應(yīng)特征，可以定性為高溫菌菌株。從高溫、中溫、低溫環(huán)境中都能夠分離獲得高溫菌，但從高溫環(huán)境篩選獲得的高溫菌產(chǎn)功能高溫酶的可能性也更大，酶的熱穩(wěn)定性好，具有更大的開發(fā)應(yīng)用潛力[16]。鮮煙葉在烘烤過程中，淀粉酶、蛋白酶、氧化還原酶等對烤煙品質(zhì)的形成起著重要的作用，而一系列酶的活性及作用時(shí)間與烘烤溫度密切相關(guān)，常溫菌在烘烤的高溫階段會死亡或失去活性，烘烤特殊的溫度環(huán)境則有利于高溫菌的活動，但關(guān)于烤煙內(nèi)生高溫菌的研究鮮見報(bào)道。在本實(shí)驗(yàn)的操作過程中，充分關(guān)注了無菌操作，對實(shí)驗(yàn)材料在烘烤前進(jìn)行了多次漂洗，盡可能去除葉片表面的附生菌群；烘烤完成后，又進(jìn)行了二重表面消毒，盡可能的降低了葉表面附生菌群的干擾。

不同來源的微生物往往具有不同的生物學(xué)特性，即便是同一種微生物，也會由于生境的不同而表現(xiàn)出某些生理特性上的顯著差異[1]。本實(shí)驗(yàn)分離到的烤煙內(nèi)生菌YYFG3的嗜熱特性顯著，pH耐受范圍較廣，初始產(chǎn)蛋白酶活性也較高，所以能夠更好的適應(yīng)不同工業(yè)上加工工藝的要求，在應(yīng)用方面具有廣闊前景。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，煙草營養(yǎng)器官內(nèi)除了具有豐富的常溫菌細(xì)菌外[17]，也蘊(yùn)藏著寶貴的高溫菌資源。微生物的產(chǎn)酶活性與培養(yǎng)基類型和發(fā)酵條件密切相關(guān)[18]，后續(xù)將對高溫菌株YYFG3所產(chǎn)的蛋白酶學(xué)性質(zhì)及與烤煙品質(zhì)形成的關(guān)系展開深入研究。

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Isolation and identi fi cation of endophytic thermophilic bacteria YYFG3 from fl ue-cured tobacco and its protease activity

SUN Huizhong1, WANG Xiaodong1, ZHU Jinfeng2, LI Guangliang2, SUN Minghui2, XU Zhicheng3, SONG Yueqin1
1 College of Agriculture，Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, Henan, China;
2 Henan Luohe Municipal Tobacco Corporation, Luohe 462000 Henan, China;
3 College of Tobacco Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China

Thermophilic bacteria strain producing protease YYFG3 was isolated from fl ue-cured tobacco （Nicotiana tabacum L.） by using solid culture medium and milk agar medium. The growth temperature was in the range of 30-65℃, and the optimum growth temperature was 55℃ . The tolerance of pH was in the range of 5-9, and the optimum pH was 6-7. After 32h fermentation under the condition of 55℃ , 180 r/min, protease activity reached the maximum value of 35.3 U/mL. Therefore, the YYFG3 was identi fi ed as a thermophilic strain producing protease. Morphological characteristics of strain YYFG3 were observed by optical microscope and scanning electron microscope, and related biochemical properties were measured. 16S rDNA was cloned and sequenced, and its phylogenetic tree was established. YYFG3 was classi fi ed into the genus Geobacillus, and temporarily named Geobacillus sp. YYFG3. It was concluded that strain YYFG3 can be used as good material for conventional mutation breeding and genome breeding of thermophilic bacteria producing proteinase and enjoyed a good prospect for further development and application.

Nicotiana tabacum; endophytic bacteria; isolation; protease; 16S rDNA

孫會忠，王小東，朱金峰，等. 烤煙內(nèi)生高溫菌YYFG3的分離鑒定及所產(chǎn)蛋白酶活性[J]. 中國煙草學(xué)報(bào)，2015,21（6）

河南省煙草公司科技項(xiàng)目（HYKJ2012M04；HYKJ201302）；上海煙草集團(tuán)責(zé)任有限公司項(xiàng)目（SZBCW2014-00830）；河南科技大學(xué)博士科研啟動基金（4024-13480045；4026-13480047）

孫會忠（1976—），博士，副教授，主要從事植物內(nèi)生菌研究，Email：huizhong66@163.com

朱金峰（1979—），碩士，高級農(nóng)藝師，主要從事煙草生產(chǎn)技術(shù)研究與推廣，Email：lylhsys@126.com

2015-03-21

:SUN Huizhong, WANG Xiaodong, ZHU Jinfeng, et al. Isolation and identi fi cation of endophytic thermophilic bacteria YYFG3 from fl ue-cured tobacco and its protease activity[J]. Acta Tabacaria Sinica, 2015,21(6 )