代海濤，仵 楠，徐 江

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院口腔科，新疆 石河子 832000)

白色念珠菌(candida albicans)又稱白假絲酵母菌，廣泛存在于自然界，也存在于正常人口腔，上呼吸道，腸道及陰道，一般在正常機體中數(shù)量少，不引起疾病，為條件致病性真菌。當機體免疫力下降，正常的生態(tài)平衡破壞時，其可導(dǎo)致口腔黏膜病，牙周病的發(fā)生。齲病是兒童最常見的一種口腔疾病。近年來，白色念珠菌受到口腔微生物研究者的關(guān)注，不同地域、不同人群口腔白色念珠菌的檢出及與齲病的相關(guān)研究都有文獻報道，而國內(nèi)鮮有關(guān)于少數(shù)民族兒童口腔白色念珠菌的報道。本研究旨對烏魯木齊市幼兒園的維吾爾族兒童口腔白色念珠菌的檢出情況進行分析，探討白色念珠菌與高齲相關(guān)危險因素。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

科瑪嘉念珠菌顯色培養(yǎng)基(CHROMagarCandida，CAC，科瑪嘉公司，法國)，Biospin Fungus Genomic DNA Extraction Kit(Bioflux)、Taq聚合酶等PCR試劑(北京博邁德生物工程公司)核酸染料，MarkDL2000(北京生工生物)。

1.2 研究對象

通過倫理委員會批準及征得幼兒園準許和家長知情同意，采用分層整群抽樣方法隨機調(diào)查烏魯木齊市區(qū)4所雙語幼兒園3～5歲維吾爾族兒童104名。納入標準:檢查前1個月內(nèi)未服用抗生素，無全身性疾病，無先天性疾病及表現(xiàn)出任何癥狀的口腔黏膜病，口腔內(nèi)未佩戴矯治器。受試兒童于采樣前2 h禁食，并用磷酸鹽緩沖液(PBS)漱口。

1.3 方法

1.3.1 口腔檢查

對104名兒童進行齲病檢查，其中高齲組51名，無齲組53名。齲齒診斷標準參考WHO“口腔健康調(diào)查基本方法”標準，dmft≥5為高齲組，dmft=0為無齲組。

1.3.2 樣本采集

采用兩種方法取樣。①菌斑法:無齲兒童用無菌木簽取上下頜第一乳磨牙頰側(cè)頸1/3及上前牙唇面頸1/3菌斑;有齲兒童用無菌挖器取齲損牙的深部牙本質(zhì)及齲損牙釉質(zhì)，放人消毒滅菌的裝有500 μL PBS液的2 mL無菌離心管中;②唾液法:取受試者口腔非刺激性唾液于10 mL無菌離心管中。所采集樣本均冷藏于冰盒中，2 h送回實驗室。

1.3.3 白色念珠菌培養(yǎng)

菌斑法獲得的樣本，用VERTEX震蕩2 min，將所有樣本調(diào)整到 300 μL，棄去多余液體，于6 000 r/min離心10 min，棄去上清液，用100 μL無菌PBS液重新混懸，取出20 μL接種于CAC培養(yǎng)基。唾液法獲得的樣本，直接取20 μL接種于CAC培養(yǎng)基。接種后的培養(yǎng)基在37℃培養(yǎng)，24～48 h觀察菌落顏色對CAC培養(yǎng)樣本進行判斷。

1.3.4 白色念珠菌鑒定

1.3.4.1 45 ℃生長實驗

挑取CAC平板上翠綠色或藍綠色菌落再次接種于CAC平板，恒溫45℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落生長情況。

1.3.4.2 革蘭染色法

取CAC平板上翠綠色或藍綠色菌落涂片、固定后，革蘭染色，置顯微鏡下觀察。

1.3.4.3 PCR 鑒定法

白色念珠菌的純化及增菌:挑取CAC平板上翠綠色或藍綠色單菌落劃線接種于CAC平板上，重復(fù)3次。挑取在CAC上純化的單個菌落移種于無菌沙氏液中，37℃搖動培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后按試劑盒說明提取白色念珠菌DNA:收集菌液使用lyticase酶破細胞壁，蛋白酶K消化蛋白，RNase除去RNA;然后用吸附柱法獲得白假絲酵母菌的DNA，并用分光光度法測定DNA純度和含量。于－20℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR擴增及電泳:所用引物為MITS:GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG;ITS2:GCTGCGTTCTTCATCGATGCPCR。

反應(yīng)體系(20 μL):2×EasyTaq PCR Super-Mix10 μL，10 μmol/L上游引物和下游引物各0.5 μL，牙菌斑DNA模板2.0 μL，H2O 7.0 μL調(diào)制平衡。循環(huán)條件:95℃熱啟動5 min;95℃30 s，50℃退火 30 s，72℃ 30 s，40 個循環(huán);72℃10 min。4℃保存。15 g/L瓊脂糖，1×TBE緩沖液，genefinder核酸染料染色，電泳(100 V)30 min。紫外線凝膠掃描成像，并記錄實驗結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行pearson χ2檢驗，檢驗水準 α =0.05。

2 結(jié)果

2.1 白色念珠菌臨床菌株的培養(yǎng)

白色念珠菌在37℃培養(yǎng)24 h后在平板上形成白色或淡綠色扁圓形菌落，48 h后菌落顏色呈翠綠色或藍綠色，大小不一，直徑1～3 mm，嵌入培養(yǎng)基，菌落表面及邊緣光滑;紫色菌落為光滑念珠菌;藍灰色菌落為熱帶念珠菌;粉紅色菌落為克柔念珠菌;深綠色菌落為都柏林菌(圖1)。

2.2 白色念珠菌45℃生長實驗及革蘭染色

培養(yǎng)平板經(jīng)45℃培養(yǎng)48 h，生長良好。顯微鏡下觀察，可見成群G+的卵圓形的孢子和菌絲(圖2)。

圖1 CAC培養(yǎng)基白色念珠菌培養(yǎng)菌落

圖2 白色念珠菌革蘭染色

2.3 白色念珠菌PCR鑒定

CAC鑒定培養(yǎng)基上呈綠色的菌落，經(jīng)過PCR鑒定，均為白色念珠菌，目的條帶明亮清晰(圖3)。

圖3 白色念珠菌PCR鑒定

2.4 兩種方法檢測不同齲敏感性兒童口腔白色念珠菌

菌斑法與唾液法得到的白色念珠菌的檢出率無齲組分別為 3.8%、1.9% (χ2=0.343，P=0.558)，高齲組分別為 47.1%、27.5%(χ2=4.194，P=0.041);不同齲敏感性兒童口腔白色念珠菌的檢出皆具有統(tǒng)計學(xué)意義(菌斑組χ2=25.971，P=0.000;唾液組χ2=13.761，P=0.000)(表 1)。

表1 兩種方法檢測不同齲敏感兒童口腔白色念珠菌(%)

2.5 兩種方法檢測不同性別兒童口腔白色念珠菌

菌斑法與唾液法得到的白色念珠菌的檢出率男性組分別為 29.8%、14.0%(χ2=4.150，P=0.042)，女性組分別為 17.0%、6.4%(χ2=3.294，P=0.070)，男、女間無統(tǒng)計學(xué)意義(菌斑組χ2=2.313，P=0.078;唾液組χ2=1.595，P=0.207)。

表2 兩種方法檢測不同性別兒童口腔白色念珠菌(%)

3 討論

目前在齲病病因?qū)W研究中，微生物牙菌斑生物膜菌種間信息交流及信號調(diào)控機制是國內(nèi)外齲病研究者的重要課題。由于口腔微生物環(huán)境的復(fù)雜、多樣性以及研究方法的局限性，對口腔微生物病因?qū)W研究長期以來多集中于變異鏈球菌、乳酸桿菌等已知菌屬上。而在近10年的研究中發(fā)現(xiàn)齲病的發(fā)生不一定依賴于變異鏈球菌的存在［1］，可能還有其他微生物的致齲作用。而人類口腔中有700余種微生物［2］，這些微生物之間通過共生、競爭、拮抗和抑制等生活方式在牙菌斑生物膜中發(fā)揮著各自的作用，參與齲病的發(fā)生發(fā)展的過程還有待于研究。近年來，隨著對齲齒微陣列的研究，及對定植于牙面的菌斑之間相互作用的研究日益深入外，對白色念珠菌與ECC的相關(guān)性的研究也日益受到國內(nèi)外研究者的重視［3］。白色念珠菌具有強大的產(chǎn)酸潛能，可分解利用山梨糖、木糖醇等多種變異鏈球菌不能利用的糖類產(chǎn)酸［4］，產(chǎn)酸溶解羥基磷灰石的能力為變異鏈球菌的20倍［5］，且無論玷污層存在與否，白色念珠菌均易粘附于牙釉質(zhì)、牙本質(zhì)和牙骨質(zhì)表面［6］。研究者由此推測白色念珠菌可能有很強的致齲潛能［2］。在近10年的研究中發(fā)現(xiàn)齲損部位有時并無變異鏈球菌的存在，口腔白色念珠菌與齲病的關(guān)系更是日益受到研究者的關(guān)注，很多學(xué)者認為白色念珠菌很可能是致齲的危險因素［7－，9］。

目前，科瑪嘉念珠菌顯色培養(yǎng)基(CAC)已得到臨床和實驗室的有效評價，靈敏度與特異度都得到了認可［10］。為了明確區(qū)分在CAC上綠色光滑菌落是白色念珠菌還是都柏林菌［11］，本研究除了進行45℃生長實驗驗證外，還運用靈敏可靠的聚合酶鏈式反應(yīng)對白色念珠菌進行分子生物水平的鑒定，得到明亮清晰，穩(wěn)定的目的條帶。經(jīng)過PCR鑒定，CAC鑒定培養(yǎng)基上呈綠色的菌落，經(jīng)證明均為白色念珠菌。

檢測口腔白色念珠菌的采樣方法主要分為唾液法和菌斑法。唾液法采集樣本針對于成年人較快速簡易，檢查者和受試者都比較容易操作，是較理想的樣本采集方式［12］，而本試驗對象為3～5歲幼兒，有部分幼兒不能配合唾液法采集樣本。菌斑法采集樣本更有利于獲得齲洞部位的念珠菌［13］，操作簡單，幼兒易于配合。本研究采用菌斑法與唾液法檢測不同齲敏感性及不同性別兒童口腔白色念珠菌，結(jié)果顯示，菌斑法檢測到的白色念珠菌在高齲組兒童及男性兒童組中都較唾液法高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。提示菌斑法采集樣本更有利于口腔白色念珠菌的檢測，與Arendorf［13］觀點一致。采用菌斑法收集樣本的方法，無論從可操作性還是可靠性上都較唾液法更值得推廣。兩種方法在無齲組與女性組中檢測白色念珠菌獲得率都較低，可能是導(dǎo)致兩種方法在這兩組中無差異的原因。而無論運用哪種方法維吾爾高齲組白色念珠菌的檢出率均明顯高于無齲組，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，提示白色念珠菌可能是齲病的危險因素，與Majewska等［8］Marchant等［9］和 Radford 等［14］觀點都具有統(tǒng)一性。維吾爾族男、女性別口腔白色念珠菌的檢出無差異，與 Ma＇amon［15］的兒童口腔白色念珠菌的總體分布可能與性別有關(guān)的觀點不一致，可能與民族差異及地域差異有關(guān)，還有待于進一步研究。

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