王艷青, 胡菊花, 李 頌, 胡淑麗, 張紅艷

(安徽 合肥 230032：1.安徽醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院;2.安徽醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院，安徽省口腔疾病研究中心實驗室)

親環(huán)素A在人根尖周炎中的表達與臨床表現(xiàn)的相關(guān)性研究

王艷青1, 胡菊花2, 李 頌2, 胡淑麗2, 張紅艷1

(安徽 合肥 230032：1.安徽醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院;2.安徽醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院，安徽省口腔疾病研究中心實驗室)

目的: 初步探討人根尖周炎中親環(huán)素A(CypA)表達及與臨床表現(xiàn)的關(guān)系。方法：收集根尖手術(shù)切除并經(jīng)病理診斷證實的根尖周炎病損組織83例作為實驗組；收集新鮮拔除的健康正畸牙牙髓6例作為正常對照組。用免疫組織化學染色法分析比較各組織中CypA及RANKL的表達情況，取蛋白平均吸光度值(A值)進行統(tǒng)計學分析，并比較其表達量與臨床癥狀的相關(guān)性。結(jié)果：根尖周炎病變組織中CypA主要表達于炎細胞浸潤區(qū)和上皮組織，主要陽性細胞為淋巴樣細胞、上皮細胞、血管內(nèi)皮細胞，正常對照組中少見CypA的表達；CypA在根尖肉芽腫組織中的表達量明顯高于根尖囊腫組(P<0.05)，RANKL在根尖囊腫組織中的表達量明顯高于根尖肉芽腫組(P<0.05)；有明顯臨床癥狀的根尖周炎組織中CypA和RANKL的A值均明顯高于無癥狀組(P<0.05)；CypA和RANKL的表達水平與根尖周炎病變大小均呈正相關(guān)(r=0.462，P<0.05；r=0.417，P<0.05)。結(jié)論：CypA存在于人根尖周炎病損組織中,可能參與人根尖周炎疾病的發(fā)病進程。

親環(huán)素A; RANKL; 根尖周炎; 臨床表現(xiàn)

[DOI] 10.15956/j.cnki.chin.j.conserv.dent.2015.02.003

[Chinese Journal of Conservative Dentistry,2015,25(2): 73]

根尖周炎主要是一種多數(shù)繼發(fā)于根管牙髓感染、以持續(xù)的抗原刺激引起宿主反應和根尖部牙槽骨組織破壞為主要特征的牙體牙髓疾病[1-2]。這個免疫反應是復雜的，它包括招募多種炎性細胞并形成多種細胞因子來參與一個廣泛的免疫反應網(wǎng)絡。有研究表明，在機體對細菌及其產(chǎn)物的免疫反應中，會合成一些促炎細胞因子來誘導和維持炎癥反應[3-5]。但根尖周病的具體發(fā)病機制目前仍不十分明朗。

親環(huán)素A(CypA)是人類細胞內(nèi)蛋白親環(huán)素族中最豐富的一種，在動脈粥樣硬化中、炎性和氧化應激反應中可由單核細胞、巨噬細胞、內(nèi)皮細胞和血管平滑肌細胞分泌[6-7]；其可在炎性條件中由細胞胞外釋放，也可以通過與細胞外基質(zhì)中的金屬蛋白酶誘導因子(EMMPRIN)結(jié)合來調(diào)節(jié)炎性反應[8-9]。最近，在對很多種疾病的研究中都在關(guān)注親環(huán)素A在其發(fā)展中的潛在作用，其中包括類風濕性關(guān)節(jié)炎、腫瘤和心血管疾病等[10-12]。已有研究證明，親環(huán)素A參與人類牙周病和實驗性小鼠牙周病的發(fā)病過程[13-14]。但在根尖周炎中仍沒有該因子的相關(guān)報道。

本實驗旨在檢驗親環(huán)素A是否存在于人類根尖周病中，并通過比較根尖周炎病損組織中親環(huán)素A和RANKL(Receptor activator of NF KappaB Ligand)的表達情況以探討其與骨破壞的關(guān)系；同時結(jié)合不同臨床表現(xiàn)討論親環(huán)素A在根尖周病中的可能作用。

1 材料和方法

1.1 主要儀器與試劑

Olympus CX21FS1型光學顯微鏡(奧林巴斯，日本)；Spot Advanced顯微攝像系統(tǒng)(Diagnostic Instrument Inc，美國)；Image- Pro- Plus 6.0圖像處理系統(tǒng)(Media Cybemetics Inc，美國)；隔水式恒溫培養(yǎng)箱(GNP- 9160型,上海三發(fā)科學儀器有限公司)；電熱恒溫鼓風干燥箱(DHG- 9140A型,上海精宏實驗設備有限公司)；微波爐(PJ21C- AU型, 廣東美的集團)；-20 ℃冰箱(BCD- 209KHC型, 安徽美菱股份有限公司)；Nikon生物顯微鏡(E200型，日本)；病理組織包埋機(BM- 2型, 上海同舸醫(yī)療器械有限公司)；LEICA組織切片機(RMZ125型，德國)；SP通用型試劑盒(streptavidin- perosidas，鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法；福建邁新生物技術(shù)有限公司)；DAB顯色液(武漢博士德生物技術(shù)有限公司)；兔抗人CYPA抗體(ab154388，abcam, 美國)RANKL抗體(Santa Cruz Biotechnology, CA)。

1.2 方法

1.2.1 樣本收集和組織切片制備

收集我院頜面外科2014-01—2014-07經(jīng)根尖手術(shù)切除的根尖周炎病損組織83例，其中男42人，女41人。納入標準：①年齡18～65歲；②無其他口腔疾病和全身性疾病；③3個月內(nèi)未服用抗生素和其他激素類藥物。同時收集患者相關(guān)信息，包括臨床表現(xiàn)和根尖片(平行線投照技術(shù)[15])；并根據(jù)有無疼痛、腫脹等明顯臨床癥狀將其分為有癥狀組和無癥狀組。然后，由兩位不知本試驗目的的實驗員使用醫(yī)用軟件(clinview 8.2)測量根尖稀疏區(qū)的直徑并取平均值。另收集因正畸減數(shù)拔除的健康牙牙髓6例(男3例，女3例；年齡16～30歲)，作為正常對照組。

收集的所有組織樣本用100 mL/L甲醛液固定后，不同濃度梯度乙醇逐級脫水、常規(guī)石蠟包埋，并制作4 μm厚連續(xù)切片。本研究獲得了安徽醫(yī)科大學生物醫(yī)學倫理委員會的倫理審查批準(批準號:2014013)。

1.2.2 常規(guī)組織學觀察及根尖病損類型判定

分別取上訴各樣本組織切片，脫蠟、脫水后常規(guī)HE染色，光學顯微鏡下觀察，并按以下標準判斷根尖病損的類型。①根尖肉芽腫：根尖部組織形成增生的肉芽組織團塊，周圍有纖維結(jié)締組織包繞，其中以炎性細胞和成纖維細胞為主； ②根尖囊腫：以各種厚度的纖維囊腔為診斷特征，纖維囊腔被覆復層鱗狀上皮(厚薄不一)，上皮釘突因炎癥刺激發(fā)生不規(guī)則增生、伸長，并相互融合成網(wǎng)狀，上皮表現(xiàn)為明顯的細胞間水腫和以中性粒細胞為主的上皮內(nèi)炎癥細胞浸潤；纖維組織囊壁內(nèi)炎癥明顯，炎性浸潤細胞主要為淋巴細胞、漿細胞，混雜有中性粒細胞以及泡沫吞噬細胞浸潤[16]。

1.2.3 免疫組織化學染色觀察

1.2.3.1免疫組織化學染色方法

分別取上述各樣本組織切片，65 ℃下烤片2 h后常規(guī)二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水，蒸餾水5 min； 30 mL/L過氧化氫 37 ℃孵育10 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗5 min×3次；置于640 mL枸櫞酸緩沖液(pH 6.0)中用微波爐高火煮沸8 min，停 3 min再高火4 min，自然冷卻至常溫后PBS沖洗 3 min ×3次；正常羊血清液37 ℃下封閉30 min，傾去勿洗；分別滴加一抗兔抗人CypA 抗體(稀釋濃度：1 ∶400)、RANKL抗體(稀釋濃度：1 ∶150)；4 ℃ 冰箱孵育過夜(用PBS緩沖液代替一抗作空白對照)；PBS沖洗5 min×3次，滴加通用型生物素標記二抗，37 ℃孵育30 min；PBS沖洗 5 min×3 次；滴加過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作液，37 ℃孵育30 min；PBS沖洗5 min×3次，DAB(3，3＇- diaminobenzidine,二氨基聯(lián)苯胺)反應染色；自來水充分沖洗后蘇木素復染1 min，常規(guī)脫水、透明、干燥、封片。

1.2.3.2 免疫組織化學染色鑒定

免疫組織化學染色以胞核、胞質(zhì)或胞膜上出現(xiàn)黃色或棕色顆粒為陽性，顯微鏡400倍下從每張切片中隨機選取5個視野用顯微攝像系統(tǒng)拍攝照片，并用Image- pro- plus 6.0圖像分析系統(tǒng)分析每個組織切片上CypA和RANKL的蛋白平均吸光度值(A值)。

1.3 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0和EXCEL統(tǒng)計軟件。首先用Image- Pro plus圖像處理系統(tǒng)計量每個組織切片上CypA、RANKL的蛋白平均吸光度值(A)，并將數(shù)據(jù)錄入Excel 2003軟件，然后采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析：Kolmogorov-Smirnov檢驗顯示CypA和RANKL在根尖肉芽腫和根尖囊腫中的表達呈現(xiàn)非正態(tài)分布，使用Mann-Whitney U test比較兩者在不同病變類型(對照組、根尖囊腫和根尖肉芽腫)間的表達情況；各組RANKL和CypA的相關(guān)性分析采用直線相關(guān)，先繪制散點圖，并求其相關(guān)系數(shù)r，之后再做顯著性檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 組織樣本基本情況及病理檢測結(jié)果

83例根尖炎性組織樣本有明顯臨床癥狀者39例、無明顯臨床癥狀者44例。

HE染色結(jié)果顯示：83例根尖周炎組織樣本中有49例為根尖肉芽腫，其組織中可見大量炎細胞浸潤，包括大量的淋巴細胞和成纖維細胞，并可見成纖維細胞增殖形成的纖維組織 (圖1a)；有34例為根尖囊腫，可見上皮組織不同程度的增生(圖1b)。

a．根尖肉芽腫 b．根尖囊腫

圖1 HE染色觀察(×20)

2.2 免疫組化染色結(jié)果分析

2.2.1 實驗組與對照組比較

83例根尖周炎組織中均檢測出有CypA的表達，正常牙髓組織(陽性對照組)少見該因子表達，空白對照組中未檢測出該因子表達。根尖周炎病變組織中CypA主要表達于炎細胞浸潤區(qū)和上皮組織，主要陽性細胞為淋巴樣細胞、上皮細胞、血管內(nèi)皮細胞；正常對照組和空白對照組中少見CypA的表達(圖2)。量化分析結(jié)果顯示,實驗組CypA的蛋白表達量和RANKL的蛋白表達量均明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(表1)。

2.2.2 肉芽腫組與囊腫組比較

免疫組化染色結(jié)果顯示： CypA 在肉芽腫中的表達明顯高于囊腫組(Z=4.48，P<0.05)；而RANKL在肉芽腫中的表達則明顯低于囊腫組(Z=4.48，P<0.05)(圖3～4)。

表1 各組樣本中CypA和RANKL的表達情況比較

空白對照組 根尖周炎病變組織正常牙髓(陽性對照組)組織

圖2 免疫組化染色觀察(×40)

CypA在肉芽腫中的表達高于囊腫組(P<0.05) RANKL在肉芽腫中的表達低于囊腫組(P<0.05)

圖3 CypA和RANKL在根尖囊腫、根尖肉芽腫中的表達比較

根尖肉芽腫 根尖囊腫

圖4 根尖肉芽腫、根尖囊腫免疫組織化學染色結(jié)果(×40)

2.3 臨床表現(xiàn)對比分析

免疫組化定量分析結(jié)果顯示，有明顯臨床癥狀的根尖周炎組織中CypA和RANKL的A值分別為77.24(69.48～89.54)和85.07(78.57～91.15)，二者均明顯高于無癥狀組的39.18(31.54～64.90)和48.09(38.36～74.35)，差異均有統(tǒng)計學意義(Z=2.724，P<0.05)(圖5)。

2.4 CypA和RANKL與臨床表現(xiàn)的相關(guān)性分析

CypA和RANKL的表達水平與根尖周炎的病變大小均呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)(圖6)；無論在有癥狀組中還是在無癥狀組中，CypA的表達量與RANKL的表達量均呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.938,P<0.05;r=0.958,P<0.05)(圖7)。

圖5 CypA和RANKL在兩組根尖病損中的

圖6 CypA和RANKL蛋白的表達水平與根尖稀疏區(qū)大小的相關(guān)性

圖7 兩組中CypA與RANKL蛋白表達水平的相關(guān)性比較

3 討論

本實驗首次研究了CypA在人類慢性根尖周炎中的表達情況，并結(jié)合臨床表現(xiàn)分析其在根尖周炎中可能發(fā)揮的作用。在心血管疾病[12]、類風濕性關(guān)節(jié)炎[10]以及癌癥[11]等相關(guān)研究中均已有大量的研究探討了該因子的作用，并證明CypA可能以促炎方式參與炎癥疾病的發(fā)生發(fā)展。最近在牙周病的相關(guān)研究中也有兩篇文獻報道了CypA參與牙周病的發(fā)生發(fā)展[13-14]，而目前尚沒有CypA在根尖周病中的相關(guān)研究報道。RANKL是TNF超級家族中的一員，已經(jīng)被很多研究證明是一種參與骨質(zhì)破壞的因子[17]。鑒于根尖稀疏區(qū)的大小可反映臨床根尖骨質(zhì)破壞的程度，因此本實驗通過比較CypA與RANKL蛋白表達量與臨床表現(xiàn)的關(guān)系，來討論CypA在根尖周炎中可能的作用。

在牙周炎的相關(guān)研究中，Li等[13]最先在動物牙周病模型中檢測到CypA的表達。定量和相關(guān)性分析顯示：CypA在炎性牙齦組織中的表達量明顯高于正常牙齦組織；且與牙槽骨的喪失、巨噬細胞和淋巴細胞的浸潤呈正相關(guān)。隨后該作者又在人牙周病組織中發(fā)現(xiàn)了類似情況[14]，說明CypA可能參與牙周病中炎癥反應和牙槽骨的喪失。本實驗中通過免疫組化的方法檢測到根尖周炎病損組織中有CypA的表達，其表達水平明顯高于正常牙髓組織；提示CypA可能也參與了根尖周炎癥的發(fā)展。

本實驗分別比較了CypA和RANKL在不同病損組織中的表達水平，結(jié)果顯示：CypA在根尖肉芽腫組織中的表達量相對較多，而RANKL在根尖囊腫組織中的表達量相對較多,與Zhang等[18]的研究結(jié)果相吻合。CypA和RANKL在肉芽腫和囊腫中表達情況不同，可能與參與兩者表達的細胞不同有關(guān)。RANKL主要由成骨細胞、基質(zhì)細胞及活化的T細胞表達[19]；而CypA主要由內(nèi)皮細胞、巨噬細胞、淋巴細胞及血管平滑肌細胞表達[7-8,20]。同時有研究表明，CypA可作為一種強勁的趨化因子趨化中性粒細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞及T細胞到炎性部位[21-22]；由于肉芽腫主要由大量新生成的微小血管并浸潤大量炎性細胞及成纖維細胞；囊腫主要有明顯的纖維囊壁；因此本實驗中CypA在巨噬細胞、成簇的內(nèi)皮細胞及淋巴樣細胞上明顯著色，而囊腫中主要集中于上皮細胞，固有層內(nèi)炎性細胞表達則相對較少。

本實驗中CypA和RANKL均與患牙根尖稀疏區(qū)大小呈正相關(guān)，CypA與RANKL兩者比較也呈正相關(guān)關(guān)系，說明CypA可能也參與根尖骨質(zhì)破壞的進程。根尖稀疏區(qū)大小主要反映根尖骨質(zhì)破壞的情況，RANKL是已知的參與骨破壞的重要因子[17]。RANK- RANKL- OPG三者平衡體系一旦失衡(RANK/RANKL/OPG system)，即會發(fā)生相應的骨質(zhì)破壞[23-24]。Yang等[10]對RA(Rheumatoid arthritis，類風濕性關(guān)節(jié)炎)進行研究時發(fā)現(xiàn)，在RA中，CypA- CD147相互作用可上調(diào)MMP- 9的表達量，并通過促進單核細胞/巨噬細胞粘附到細胞外基質(zhì)上而導致軟骨和骨的破壞。MMPs(Matrix metalloproteinase)為基質(zhì)金屬蛋白酶，在牙周組織胞外基質(zhì)降解過程中有重要的作用[25]。與此同時，Wang等[22]也有類似的發(fā)現(xiàn)，并提出CypA可明顯提高MMP- 2和MMP- 9的分泌、促進細胞入侵及單核細胞釋放炎性細胞因子的量；此外，實驗中還發(fā)現(xiàn)，注射CypA組的軟骨吸收率明顯高于對照組，說明其與破骨有關(guān)。目前已有研究指出，基質(zhì)金屬蛋白酶也參與牙槽骨的骨破壞[26]。除此之外，Li等[14]還發(fā)現(xiàn)，在炎性牙齦中CypA的表達量與MMP- 1/MMP- 2/MMP- 9表達量呈正相關(guān)；提示CypA可能參與牙周組織中的軟、硬組織的破壞。因此，CypA可能作為一個新的切入點來重新考量軟骨及骨降解的炎性過程。

當有炎癥刺激時，CypA可以被細胞釋放到胞外并與細胞膜上的EMMPRIN(Extracellular matrix metalloproteinase inducer,胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導劑)結(jié)合，CypA可通過與EMMPRIN相互作用調(diào)節(jié)炎性反應，促進炎性細胞釋放基質(zhì)金屬蛋白酶[10]。Liu等發(fā)現(xiàn)CypA和EMMPRIN同時位于浸潤的巨噬細胞、淋巴細胞上，而在一些多核細胞上也有附著，說明CypA- EMMPRIN存在于牙周病炎癥反應中；同時還發(fā)現(xiàn)，CypA在炎性牙齦組織中過度表達且分布廣泛，并發(fā)現(xiàn)300 ng/mL的CypA與100 ng/mL及500 ng/mL相比對中性粒細胞的趨化作用最強，可使其在牙周組織中的浸潤程度明顯增加，并使TNF- α/IL- 8的分泌量增加[13-14]。Kim等[20]也發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細胞經(jīng)LPS刺激后可分泌CypA，并能在體外實驗中反作用調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞的活性，且不同濃度的CypA對內(nèi)皮細胞TLR- 4的表達有明顯的影響，說明CypA與炎癥相關(guān)。

總之，本實驗通過免疫組化的方法檢測了CypA在根尖周炎性組織中的表達情況，所得結(jié)果提示，CypA可能參與根尖周炎炎癥的發(fā)生發(fā)展，并可能與破骨有關(guān)。該結(jié)果有助于進一步理解根尖周病的發(fā)病機制和病變的發(fā)展。但還需進一步的實驗來詳細闡明CypA在根尖周病中的作用。

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Immunolocalization of cyclophilin- A in human apical periodontitis lesions

WANG Yan- qing*, HU Ju- hua, LI Song, HU Shu- li, ZHANG Hong- yan

(*StomatologicHospital﹠College,AnhuiMedicalUniversity,KeyLab.ofOralDiseasesResearchofAnhuiProvince,Hefei230032,China)

AIM: To examine the expression of cyclophilin A (CypA) in human periapical lesions and to investigate its relationship with the clinical symptoms of periapical periodontitis. METHODS: Samples of human apical periodontitis lesions of 83 cases were subjected to immunohistochemical examination for CypA and RANKL expression. Six 6 healthy dental pulp samples obtained from orthodontic patients served as the controls. The integrated average optical density value (A) of CypA and RANKL was measured by immunohistochemical analysis for all the samples. Differences in CypA and RANKL expression between different clinical presentations were subsequently analyzed by t-test. RESULTS: CypA postitive cells and RANKL positive cells were both detected in all periapical lesion tissues, and the expression of CypA was significantly higher in periapical lesions than in normal tissues (P<0.05). Epithelial cells, lymphoid cells and endothelial- like cells showed CypA positive in the lesions. The expression of RANKL in cyst group were higher than in granuloma group (Z=4.48,P<0.05), while the expression of CypA in granuloma group were higher than in cyst group (Z=4.48,P<0.05). The average (A) value of CypA positive sites in periapical lesions with clinical symptoms was higher than that without clinical symptoms(77.24 versus 39.18,P<0.05). Positive correlation was observed between CypA expression and lesion size(r=0.462,P<0.05). Moreover, positive correlation between RANKL expression and lesion size was observed (r=0.417,P<0.05). CONCLUSION: CypA might be involved in the inflammatory response and bone resorption, and associated with periapical lesion pathogenesis.

cyclophilin- A; RANKL; periapical lesions; clinical presentations

2014-09-14

安徽省自然科學基金(070413141)

王艷青(1990-)，女，漢族，安徽蕪湖人。碩士生(導師：張紅艷)

張紅艷, E-mail: toothyan@126.com

R780.2

A

1005-2593(2015)02-0073-07

安徽高校省級自然科學研究項目(KJ2011Z168)

安徽省高校教學質(zhì)量與教學改革工程項目(20100352)