顧珉　楊美琴　馬仕洪　顧炳仁

（1蘇州市食品藥品檢驗(yàn)所，江蘇蘇州215002；2中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京100050）

藥品質(zhì)控實(shí)驗(yàn)室用水的微生物分析

顧珉1楊美琴2馬仕洪2顧炳仁1

（1蘇州市食品藥品檢驗(yàn)所，江蘇蘇州215002；2中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京100050）

目的：針對(duì)目前國(guó)內(nèi)藥檢所微生物實(shí)驗(yàn)室用水的實(shí)際情況，探索實(shí)驗(yàn)室用水微生物分析的可行方法，提出合理的水微生物污染的質(zhì)控水平。方法：參考國(guó)內(nèi)外藥典對(duì)藥用水的微生物質(zhì)控方法，采用培養(yǎng)基方法考察了實(shí)驗(yàn)用水在儲(chǔ)水期、培養(yǎng)基配制過(guò)程中的微生物生長(zhǎng)情況和運(yùn)用96孔酶標(biāo)板法初步考察了水的污染程度對(duì)培養(yǎng)基檢測(cè)性能的影響。結(jié)果：水在儲(chǔ)水期、培養(yǎng)基配制過(guò)程中的微生物生長(zhǎng)迅速，在水的微生物污染程度達(dá)到104cfu/mL的時(shí)候?qū)ε囵B(yǎng)基的檢測(cè)性能有影響。結(jié)論：本研究為微生物實(shí)驗(yàn)室水質(zhì)影響評(píng)估和合理利用實(shí)驗(yàn)室用水提供了依據(jù)。

實(shí)驗(yàn)室用水；微生物分析；培養(yǎng)基法；96孔酶標(biāo)板法

制藥用水由于其在制藥工業(yè)中的重要地位，世界衛(wèi)生組織和各國(guó)藥典不斷制定和修改新的水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)；《中國(guó)藥典》2010年版二部（附錄XVI）制藥用水共收載了飲用水、純化水、注射用水及滅菌注射用水等4種制藥用水［1-4］。而在微生物實(shí)驗(yàn)室中，水在培養(yǎng)基和消毒液配置、實(shí)驗(yàn)器皿清洗、樣品稀釋和處理等方面發(fā)揮著重要的作用。隨著微生物檢測(cè)技術(shù)不斷發(fā)展，人們對(duì)實(shí)驗(yàn)用水帶來(lái)實(shí)驗(yàn)風(fēng)險(xiǎn)的認(rèn)識(shí)不斷深化和提高，根據(jù)國(guó)內(nèi)藥檢所微生物實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際使用情況，在微生物實(shí)驗(yàn)過(guò)程中涉及到的實(shí)驗(yàn)室用水主要包括蒸餾水、純化水、超純水、水浴、自來(lái)水等。這其中涉及的大部分水樣不在藥典質(zhì)量控制的范圍以內(nèi)，對(duì)于微生物實(shí)驗(yàn)室，缺乏可行的實(shí)驗(yàn)用水質(zhì)量控制依據(jù)。

目前，藥品微生物實(shí)驗(yàn)室日常配制培養(yǎng)基和試劑以及清洗玻璃器皿主要以蒸餾水為主。本研究考察了蒸餾水在儲(chǔ)存期間微生物載荷的變化和在培養(yǎng)基配制過(guò)程中的微生物載荷的測(cè)定，并對(duì)不同污染程度的蒸餾水配制的培養(yǎng)基性能進(jìn)行了評(píng)估。本研究提出的對(duì)實(shí)驗(yàn)用水微生物監(jiān)控的目標(biāo)是通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)室各個(gè)環(huán)節(jié)中使用水的微生物計(jì)數(shù)和代表性微生物的鑒定來(lái)評(píng)估實(shí)驗(yàn)中所用水的質(zhì)量情況。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室用水的實(shí)際應(yīng)用情況，提出合適的微生物控制水平，即作為一種預(yù)警及糾正水平的指標(biāo)，采取必要的措施如清洗、消毒或及時(shí)更換新的水樣來(lái)降低微生物污染水平，以符合微生物實(shí)驗(yàn)室生物污染風(fēng)險(xiǎn)控制的需要。

1　實(shí)驗(yàn)儀器、材料

1.1考察水樣

中國(guó)食品藥品檢定研究院培養(yǎng)基室制備蒸餾水、微生物實(shí)驗(yàn)室自來(lái)水、微生物實(shí)驗(yàn)室中水浴。

1.2培養(yǎng)基

胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（以下簡(jiǎn)稱TSA，批號(hào)：120607，北京三藥科技）；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（以下簡(jiǎn)稱NA，批號(hào)：120420，北京三藥科技）；玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基（以下簡(jiǎn)稱RA，批號(hào)：120509，北京三藥科技）；Difco R2A瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：211320，BD公司）；胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（以下簡(jiǎn)稱TSB，批號(hào)：8203190，BD公司）；4.5 mL ID鑒定管（BD公司）。

1.3儀器

2　實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1培養(yǎng)基配置用水微生物考察

取清洗干凈的儲(chǔ)水桶5個(gè)，分別標(biāo)記為桶1～5，1次加滿蒸餾水后，連續(xù)5日對(duì)儲(chǔ)水桶中的水取樣。將每份水樣TSA培養(yǎng)基置35℃培養(yǎng)72 h，R2A培養(yǎng)基置25℃培養(yǎng)5天，每個(gè)水樣稀釋級(jí)別平行測(cè)定2個(gè)平皿，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，以2個(gè)平皿計(jì)數(shù)的平均值記錄結(jié)果。

2.2不同水質(zhì)配制培養(yǎng)基滅菌前微生物生長(zhǎng)情況考察

表1　儲(chǔ)水桶中微生物數(shù)變化趨勢(shì)（cfu/mL）

取滅菌蒸餾水和不同微生物污染級(jí)別的蒸餾水樣（水樣1～4），分別按配方制備NA培養(yǎng)基、RA培養(yǎng)基、TSA培養(yǎng)基、R2A培養(yǎng)基，充分溶解分散均勻后，模擬培養(yǎng)基滅菌前等待狀態(tài)置30℃孵育2 h，取上述培養(yǎng)基溶液稀釋至適當(dāng)濃度后精密吸取100 μL，立即涂布至預(yù)制TSA平板，35℃培養(yǎng)72 h，見(jiàn)表2。

表2　不同微生物污染級(jí)別蒸餾水配制培養(yǎng)基液滅菌前涂布計(jì)數(shù)（cfu/mL）

2.3不同水質(zhì)配制培養(yǎng)基檢測(cè)性能比較

取滅菌蒸餾水和不同儲(chǔ)水期的水樣（水樣5～8）分別配制TSB培養(yǎng)基（表3），按培養(yǎng)基配制水樣分成5組，充分溶解混勻后，置30℃培養(yǎng)箱孵育2 h，立即滅菌（121℃，15 min）。滅菌后的5組培養(yǎng)基分別選擇大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌4株標(biāo)準(zhǔn)菌株作為TSB培養(yǎng)基指示能力的參考物。取上述4種菌懸液，分別用上述5組TSB培養(yǎng)基在96孔酶標(biāo)板上進(jìn)行10倍梯度稀釋，共稀釋11個(gè)級(jí)別，每個(gè)菌液在每種培養(yǎng)基中平行制備兩組，最后一列8個(gè)微孔加空白培養(yǎng)基液作為空白背景。將加樣后96孔酶標(biāo)板置35℃培養(yǎng)24 h后置MSS酶標(biāo)儀檢測(cè)，測(cè)定波長(zhǎng)為492 nm，得到最終試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4（表中數(shù)字表示最后顯示陽(yáng)性結(jié)果的稀釋級(jí)）。

表3　配置培養(yǎng)基蒸餾水樣微生物計(jì)數(shù)（cfu/mL）

2.4水樣中主要微生物分析

按無(wú)菌操作將取水樣100 μL涂布在血瓊脂平板上，35℃培養(yǎng)48～72 h后，取典型特征的單個(gè)菌落劃線分離至新鮮的滅菌平板，35℃培養(yǎng)18～24 h后，取分離的單個(gè)菌落適量革蘭染色，顯微鏡下觀察細(xì)菌特征。另取分離的單菌落用BD公司的ID肉湯配制成0.5～0.6麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙?，按?xì)菌顯微鏡觀察結(jié)果將制備的菌懸液加至對(duì)應(yīng)的微生物鑒定卡中，用phoenix-100全自動(dòng)生化鑒定儀進(jìn)行菌種鑒定，鑒定結(jié)果見(jiàn)表5。

亂世中大批士人選擇了南遷至南唐、西蜀等地，〔2〕(卷二六二，P9075) 其中的名士有羅隱 （五代初至吳越）、李元（后梁時(shí)避居湖南）等。隱逸為士人在世道污濁時(shí)保持人格的獨(dú)立提供了可能，是士人溫和地反抗現(xiàn)實(shí)的方式，是一種“不求兼濟(jì)，但求獨(dú)善”的逃避行為，所謂“明主既難謁，青山何不歸”正是這類人心境的寫照，隱士們走的是精神上的自我放逐之路。

表4　不同微生物污染程度蒸餾水配置TSB培養(yǎng)基檢測(cè)性能比較

表5　水樣中分離出微生物

2.5實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在制藥用水微生物計(jì)數(shù)方法中，存在著“高營(yíng)養(yǎng)”和“低營(yíng)養(yǎng)”兩種計(jì)數(shù)培養(yǎng)基體系分別進(jìn)行計(jì)數(shù)。美國(guó)藥典建議在水系統(tǒng)驗(yàn)證期間，高低營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)方式可同時(shí)進(jìn)行［2］。本研究選擇了TSA培養(yǎng)基和R2A培養(yǎng)基分別代表高低營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基對(duì)水的污染程度進(jìn)行評(píng)價(jià)。由表1數(shù)據(jù)可知，隨著儲(chǔ)水期限的延長(zhǎng)，其中的微生物數(shù)有逐日增加的趨勢(shì)，在第5日大部分水桶的微生物指標(biāo)接近了104cfu/mL的級(jí)別，保存至兩周甚至達(dá)到了106cfu/mL的污染級(jí)別；R2A培養(yǎng)基的計(jì)數(shù)結(jié)果普遍高于TSA培養(yǎng)基，在水污染程度較低的情況下，結(jié)果的差異比較明顯，然而R2A培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)普遍較為細(xì)小，從外觀上無(wú)法區(qū)分不同種的細(xì)菌，不易于進(jìn)行后續(xù)分析；在微生物污染程度較高的情況下，TSA的計(jì)數(shù)值接近R2A的計(jì)數(shù)值，且TSA平板上菌落生長(zhǎng)較為典型，易于挑取進(jìn)行后續(xù)染色、觀察和鑒定。因此，兩種培養(yǎng)基的選擇應(yīng)基于水微生物污染檢驗(yàn)的目的，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室自身水系統(tǒng)的特點(diǎn)選擇合適的培養(yǎng)基。

培養(yǎng)基配制結(jié)束后微生物增殖迅速，在滅菌前2 h有2～10倍的增長(zhǎng)（表2），配制用水的初始微生物污染載荷是造成培養(yǎng)基中的微生物載荷大量增加的主要因素，因此，實(shí)驗(yàn)室需要關(guān)注水的原始污染對(duì)微生物試驗(yàn)結(jié)果造成的影響。本研究提出使用酶標(biāo)儀檢測(cè)培養(yǎng)基的陽(yáng)性反應(yīng)，TSB是一種基礎(chǔ)富營(yíng)養(yǎng)液體培養(yǎng)基，對(duì)不同種類的菌株均有較好的增殖作用，因此被選擇作為測(cè)試的參照培養(yǎng)基。利用酶標(biāo)儀的高靈敏度和高檢測(cè)通量實(shí)現(xiàn)不同微生物載荷水配制的培養(yǎng)基靈敏度的比較，通過(guò)測(cè)定發(fā)現(xiàn)水樣中微生物數(shù)達(dá)到104cfu/mL級(jí)別時(shí)，會(huì)對(duì)滅菌后培養(yǎng)基的檢出性能產(chǎn)生一定影響（表4），水樣6，7和8配制的TSB培養(yǎng)基靈敏度與無(wú)菌水、水樣5配制的TSB培養(yǎng)基在測(cè)試的4個(gè)試驗(yàn)菌組均有顯著差異，檢測(cè)靈敏度低于微生物載荷數(shù)量低的水配制的培養(yǎng)基。

從對(duì)蒸餾水的微生物分離物鑒定分析來(lái)看（表5），制備出的蒸餾水與自來(lái)水主要微生物關(guān)聯(lián)度不大，有一些如人葡萄球菌、表皮葡萄球菌等主要來(lái)自人源污染的微生物，需要加強(qiáng)對(duì)本實(shí)驗(yàn)室制水工作人員操作的規(guī)范性，鑒定結(jié)果可為實(shí)驗(yàn)室制水系統(tǒng)污染調(diào)查提供依據(jù)。

3　討論

3.1關(guān)于實(shí)驗(yàn)方法

目前，常用培養(yǎng)基法對(duì)水的微生物計(jì)數(shù)。經(jīng)典的用于水微生物實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)基法包括澆灌平板法、涂布平板法、薄膜過(guò)濾法和最大可能計(jì)數(shù)試驗(yàn)法（MPN法）等［2］。本文選擇了涂布平板法對(duì)儲(chǔ)水期的用水進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)，相比澆灌平板法，涂布法具有實(shí)驗(yàn)迅速、需氧菌生長(zhǎng)良好和易于觀察菌落特征等優(yōu)點(diǎn)，因而選擇用涂布法考察了不同水質(zhì)配制培養(yǎng)基滅菌前微生物生長(zhǎng)情況。

對(duì)于培養(yǎng)基的質(zhì)量控制主要是通過(guò)比較對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株的靈敏度差異，由于固體培養(yǎng)基計(jì)數(shù)過(guò)程冗長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)中受人員操作影響因素較多，而96孔酶標(biāo)板法具有所需樣品微量化、檢驗(yàn)通量大、儀器檢測(cè)快速靈敏等特點(diǎn)［5］，本文提出利用96孔酶標(biāo)板梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)菌株菌懸液，通過(guò)培養(yǎng)結(jié)束后培養(yǎng)基指示能力的差異比較培養(yǎng)基的檢測(cè)性能。

3.2培養(yǎng)基的選擇

由于微生物實(shí)驗(yàn)室中配制培養(yǎng)基的蒸餾水或純化水潔凈程度相對(duì)較高，其中存在的微生物可能處于低營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)，在培養(yǎng)的初期觀察不到細(xì)菌或只能觀察到菌落形態(tài)較小的菌，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌落逐漸清晰可見(jiàn)。在通常情況下，兼性的低營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌可以在高營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，一些兼性的富營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌可以在低營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，但這個(gè)重疊部分是不完全重合的［2］。在本研究中，同時(shí)選擇了高營(yíng)養(yǎng)的TSA培養(yǎng)基和低營(yíng)養(yǎng)培的R2A培養(yǎng)基對(duì)水中的微生物進(jìn)行檢測(cè)，兼顧緩慢生長(zhǎng)的細(xì)菌和在低營(yíng)養(yǎng)情況下最適生長(zhǎng)的細(xì)菌。在本研究中，低營(yíng)養(yǎng)和高營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)方式同時(shí)使用，以更好地評(píng)估實(shí)驗(yàn)室用水的微生物污染狀況和清潔措施效率。

3.3實(shí)驗(yàn)室用水風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

在微生物實(shí)驗(yàn)室中，檢驗(yàn)工作的核心問(wèn)題是培養(yǎng)基的檢測(cè)性能。影響培養(yǎng)基質(zhì)量的除培養(yǎng)基本身的配方質(zhì)量、培養(yǎng)基保存的條件、滅菌條件等因素以外，配制用水的微生物污染程度也是需要著重關(guān)注的因素。因此，要加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)用水的日常監(jiān)控和根據(jù)水的微生物污染發(fā)展?fàn)顩r確定制水系統(tǒng)和儲(chǔ)水裝置的消毒、清洗的周期和頻率。

在微生物實(shí)驗(yàn)室中，還涉及到一些輔助或特殊用途的水，主要包括自來(lái)水、超純水和水浴等。自來(lái)水主要用于玻璃器皿的粗洗和實(shí)驗(yàn)室外圍的清潔工作，同時(shí)也是實(shí)驗(yàn)室制備純化水和蒸餾水的主要水源。通過(guò)日常對(duì)實(shí)驗(yàn)室自來(lái)水的微生物檢測(cè)，自來(lái)水監(jiān)測(cè)到的微生物數(shù)量在30～500 cfu/mL之間，這主要與水廠的日常凈水工藝有關(guān)。同時(shí)注意到，自來(lái)水中的微生物相比蒸餾水中微生物的恢復(fù)時(shí)間更長(zhǎng)，通常需要48 h以上才能觀察到有菌落生長(zhǎng)，甚至延長(zhǎng)培養(yǎng)至5天才觀察到完整的生長(zhǎng)情況。水浴在培養(yǎng)基保溫和某些實(shí)驗(yàn)樣品處理等用途中會(huì)有應(yīng)用，可以適時(shí)對(duì)水浴中的水樣監(jiān)測(cè)和增加換水的頻次，以減少使用不當(dāng)為微生物實(shí)驗(yàn)室環(huán)境和樣品帶來(lái)污染的風(fēng)險(xiǎn)。

對(duì)于一個(gè)具有良好規(guī)范的微生物實(shí)驗(yàn)室而言，有必要加強(qiáng)對(duì)實(shí)驗(yàn)室各個(gè)環(huán)節(jié)用水的微生物污染狀況的監(jiān)控。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際條件，適時(shí)地提出實(shí)驗(yàn)室用水污染的預(yù)警和糾正標(biāo)準(zhǔn)，為微生物實(shí)驗(yàn)室科學(xué)合理用水提供依據(jù)。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（二部）［S］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：411.

［2］美國(guó)藥典委員會(huì).美國(guó)藥典［S］.35版.華盛頓：美國(guó)藥典委員會(huì).2012：886.

［3］歐洲藥典委員會(huì).歐洲藥典［S］.7版.斯特拉斯堡：歐洲藥品質(zhì)量管理局，2011，2：2319.

［4］衛(wèi)生部.藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（2010年修訂）［S］.衛(wèi)生部令第79號(hào)，2011-01-17.

［5］王秀華，雷質(zhì)文，黃楊冰.96孔酶標(biāo)板法測(cè)定對(duì)蝦血淋巴的過(guò)氧化物酶相對(duì)活性的初步研究［J］.海洋科學(xué)，2001，25（11）：55-57.

Microbiological Analysis of Water Used in Laboratory of Quality Control of Pharmaceuticals

Gu Min1，Yang Meiqin2，Ma Shihong2，Gu Bingren1
（1 Suzhou Institute for Food and Drug Control，Jiangsu Suzhou 215002，China；2 National Institute for Drug and Food Control，Beijing 100050）

Objective:In view of the actual situation of the water used in microbiological laboratories in domestic institutes for drug control，feasible methods for microbiological analysis of water for laboratory use were explored and the reasonable standards were put forward for the quality control of water at different microbial contamination levels.Methods:Referring to the methods set forth in domestic and foreign pharmacopoeias for quality control of microorganism in the water for pharmaceutical use，an investigation was conducted，using culture medium method，of the microbial growth in water for laboratory use during the period of water storage and the process of culture medium preparation，and the impact on the detection performance of culture medium by water microbial contamination was detected using 96-well enzyme labeling plate method.Results:During the water storage period and the process of culture medium preparation，microbial growth was fast and the detection performance of culture medium was impacted when microbial contamination level of water reached to 104cfu/mL. Conclusion:A basis was provided for the assessment of water quality and the reasonable utilization of water for the microbiological laboratories.

Water for Laboratory Use；Microbiological Analysis；Culture Medium Method；96-well Enzyme Labeling Plate Method

10.3969/j.issn.1672-5433.2015.10.004

2015-06-11）

顧珉，男，碩士，主管藥師。研究方向：藥品微生物檢驗(yàn)、微生物鑒定和分型技術(shù)研究。E-mail：scofei@aliyun.com

顧炳仁：男，主任藥師，碩士生導(dǎo)師。研究方向：抗生素藥物分析、微生物檢驗(yàn)和鑒定研究。通訊作者E-mail：2803307338@qq.com